Uso de la membrana chorioalantoica de pollo en vivo modelo para estudiar cánceres ginecológicos y urológicos

El injerto de tumores en la membrana corioalantoica de pollo, o CAM, se puede utilizar para estudios de tumorigenicidad, eficacia del tratamiento ocrucimiento celular. Este método permite un crecimiento tumoral rápido y rentable en un entorno in vivo inmunotolerante. Utilizando el modelo CAM, nuevos enfoques terapéuticos se pueden probar rápidamente utilizando líneas celulares o incluso muestras de tumores de pacientes.

Los aspectos más cruciales de este protocolo son asegurar la formación adecuada de CAM y no interrumpir el CAM o la vasculatura al abrir los huevos. En el día siete u ocho del desarrollo, cuando el CAM se haya desarrollado por completo, apague el rotador de huevos y coloque aproximadamente de uno a tres huevos en el estante de huevos en el gabinete de bioseguridad. Con las luces apagadas, coloque una veladora de huevo contra la cáscara de huevo para identificar y marcar la ubicación de la célula de aire de un huevo, luego mueva el velador de huevo sobre la cáscara para encontrar una red grande de vasos sanguíneos, girando el huevo según sea necesario.

Una vasculatura ideal se ramificará cerca de la mitad del huevo. Utilice un marcador para trazar la vasculatura que se utilizará para la implantación. Después de volver a encender la luz en el capó, utilice una herramienta rotativa inalámbrica equipada con una piedra de molienda de carburo de silicio para perforar un pequeño agujero en la cáscara directamente sobre el centro de la celda de aire.

Cuando la mayor parte de la cáscara se ha eliminado pero con la membrana interna blanca intacta, perforar otro pequeño agujero donde la ventana vascular se abrirá como se acaba de demostrar. Cuando el segundo agujero esté listo, utilice una aguja de calibre 18 para perforar suavemente la membrana interna blanca sobre la célula de aire y la vasculatura teniendo cuidado de que la membrana interna blanca, pero no la CAM, se interrumpa en toda la totalidad del área perforada. Con la luz de la campana apagada de nuevo, utilice la vela de huevo para verificar que la célula de aire se ha transferido desde el extremo del huevo a la zona sobre la vasculatura.

Si es necesario, coloque el tubo de vacío insertado en un controlador de pipeta alrededor del orificio sobre la celda de aire original y aplique suavemente la succión en ráfagas cortas para mover la celda de aire. Marque el contorno de la nueva ubicación de la celda de aire aproximadamente 0,5 centímetros dentro del límite CAM de aire y fije un pedazo de cinta de embalaje lo suficientemente grande como para cubrir el agujero sobre la nueva celda de aire. Después de preparar los otros dos huevos como se acaba de demostrar, devuelva los huevos a la incubadora y abra cualquier huevo adicional para el experimento en grupos de uno a tres como se ha demostrado.

Una vez abiertos todos los huevos, transfiera de uno a tres huevos con células de aire reubicadas al estante de huevos en un gabinete de bioseguridad y utilice una herramienta rotativa inalámbrica equipada con una rueda de corte circular para cortar una pequeña línea sobre el límite de la célula de aire completamente a través de la célula sin interrumpir el CAM o la vasculatura. Usando tijeras curvas, corte alrededor de la célula de aire restante para crear una ventana en la cáscara y verificar la viabilidad del embrión. Los embriones viables mostrarán una extensa vasculatura, albúmina clara, movimiento embrionario y/o un latido visible del corazón.

En embriones no viables, la CAM puede parecer opaca con pocos vasos presentes, si los hay, y los embriones pueden ser pequeños o ausentes sin movimiento ni latidos del corazón. Usando fórceps Semkin, tire de pequeños trozos de algodón de una bola de algodón estéril y borre suavemente la superficie CAM de los embriones viables para eliminar cualquier polvo de cáscara y escombros, luego cubra la abertura de la cáscara con un apósito de película transparente de un cuarto de seis por siete centímetros sin tocar el CAM y devuelva los huevos a la incubadora con la ventana abierta hacia arriba. Utilice un trozo de estante de huevo, el borde del rotador de huevos u otro elemento adecuado para apoyar cualquier huevo que siga rodando.

Para preparar la suspensión de células cancerosas para el trasplante, cosecha las células del cultivo celular del cáncer de interés y sedimenta las células por centrifugación. Aspirar el sobrenadante y resuspender mecánicamente las células en el medio residual. Coloque la suspensión celular sobre hielo y utilice una pipeta para medir el volumen de las células en el medio.

Luego resuspender las células a una concentración de uno a dos millones de células en 20 a 100 microlitros de medio complementados con 2.7 a 4 miligramos por matriz extracelular mililitro y cualquier factor de crecimiento u otros aditivos de interés. Para la implantación de células cancerosas, utilizando un anillo antiadherente, coloque hasta seis huevos para ser implantados en el estante de huevo y enrolle los bordes del apósito de película transparente hacia la ventana abierta para eliminar la película de las conchas. Compruebe si los huevos son viables y saludables.

Los huevos ideales tendrán un recipiente grande con recipientes ramificados más pequeños dentro del centro de la zona abierta. Usando fórceps de iris curvos, coloque un anillo antiadherente estéril en el CAM sobre el recipiente idealmente sobre un punto de rama. Utilice una barra de agitación de vidrio estéril para abrasar suavemente el CAM y pipetear la suspensión de la célula cancerosa en el centro del anillo.

Cuando se hayan entregado todas las células, selle la abertura con un vendaje de película transparente de un cuarto de seis por siete centímetros y etiquete el huevo con una designación de implante adecuada. A continuación, coloque los huevos firmemente en la incubadora con la abertura de la cáscara mirando hacia arriba. Para implantar células cancerosas sin el uso de un anillo antiadherente, aspirar la suspensión celular en una punta de pipeta de tamaño adecuado y sosteniendo la parte superior de la punta expulsar cuidadosamente la punta de la pipeta y colocar la punta horizontalmente en un plato estéril de cultivo de tejido de 10 centímetros.

Después de que las puntas hayan sido cargadas, coloque el plato en una incubadora de 37 grados Celsius durante 15 a 30 minutos, comprobando la polimerización después de 15 minutos. Una pequeña cantidad de líquido normalmente se filtra a medida que cada punta se coloca en el plato. Utilice este líquido para estimar la extensión de la polimerización dentro de la punta.

Cuando la matriz esté lista, coloque una punta en una pipeta de tamaño adecuado y presione el émbolo para forzar la suspensión de celda parcialmente polimerizada en el CAM idealmente sobre el punto ramificado de un recipiente grande y bien desarrollado. Utilizando estos métodos, las líneas celulares de cáncer de ovario humano y murino y las piezas de tumores primarios resultaron en el injerto exitoso de tumores con morfologías consistentes con las observadas en otros modelos in vivo. De los tipos de tumores analizados, el crecimiento del cáncer de ovario fue mucho menos pronunciado y, por lo general, no era visible sin la ayuda de imágenes de bioluminiscencia.

Los efectos de la adición de factores de crecimiento u hormonas en el momento de la implantación también se pueden probar utilizando estos métodos. Para el cáncer de riñón, la implantación de células de carcinoma de células renales transparentes a partir de líneas celulares establecidas o piezas de tumores renales humanos primarios produce una formación de tumores rápida y robusta. Además, se habían utilizado múltiples líneas celulares de cáncer de próstata humano y murino y líneas celulares de cáncer de vejiga humana y piezas de tumores primarios para establecer tumores utilizando este modelo.

Es crucial evitar interrumpir el CAM y la vasculatura y asegurarse de que el CAM no se adhiere al shell mientras se abre la ventana. Después de un injerto exitoso, el modelo CAM se puede utilizar para evaluar la eficacia terapéutica de los tratamientos de interés o interacciones entre diferentes tipos celulares dentro de un tumor.