Name: Sistema eficiente de expresión de plásmido controlado por transcripción para la investigación de la estabilidad de las transcripciones de ARNm en células epiteliales alveolares primarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprende un sistema de expresión plasmídica inducible para estudiar la estabilidad del ARNm en células epiteliales alveolares primarias mediante electroporación con pipeta. Este método minimiza la alteración de la fisiología celular.

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Francis Migneault fue apoyado por una beca proporcionada por la Red de Salud Respiratoria de Quebec y el programa de formación pulmonar de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR), una beca de FRSQ y una beca de la Faculté des études Supérieures et Postdoctorados, Universidad de Montreal. Este trabajo fue apoyado por la Cátedra Gosselin-Lamarre en investigación clínica y los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria [YBMOP-79544].

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales del Centro de Investigación del Centro Hospitalario de la Universidad de Montreal (CRCHUM).
1. Diseño y generación del plásmido de respuesta expresando el gen de interés (GOI)
<ol><li>Utilice un vector de desconexión de tetraciclina inducible, como pTRE-Tight.</li>
	<li>Analice la secuencia del GOI y del sitio de clonación múltiple (MCS) del vector para identificar los sitios de restricción en el MCS que no están presentes internamente en el GOI.</li>
	<li>Aísle las células epiteliales alveolares primarias de los pulmones de rata Sprague-Dawley machos como se describió anteriormente19,20.</li>
	<li>Purificar el ARN total de las células epiteliales alveolares mediante la extracción de ARN utilizando un método estándar, como la extracción de fenol/cloroformo o el uso de columnas de espín de ARN a base de sílice.</li>
	<li>Transfiera el ARNm en ADN complementario (ADNc) utilizando oligo(dT) y transcriptasa inversa de alta fidelidad.</li>
	<li>Utilice técnicas de PCR de alta fidelidad taq polimerasa y superposición estándar para flanquear el GOI con dos sitios de reconocimiento de enzimas de restricción seleccionados utilizando imprimaciones diseñadas.<ol>
<li>Pida a la imprimación delantera que contenga un sitiode unión ribosoma de Kozak para mejorar los niveles de expresión para estudiar la expresión de proteínas en paralelo con la estabilidad del ARNm. Debe incluirse una secuencia que codifica el epítopo V5 aguas arriba del GOI para distinguir la expresión del GOI transinfectado de la expresión endógena (Tabla 1).</li>
		<li>Pida que la imprimación inversa contenga una señal de poliadenilación después del codón de parada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Los mutantes se pueden generar mediante eliminación secuencial para estudiar los efectos de diferentes regiones UTR de 3' en la estabilidad del ARNm del GOI utilizando imprimaciones inversas que codifican un sitio de poliadenilación que elimina gradualmente el extremo de 3' del GOI 3' UTR(Figura 6). Alternativamente, la mutagénesis dirigida por PCR se puede utilizar para dirigirse a una región específica de interés en el UTR22de 3'.</li>
	<li>Digerir el vector inducible y el inserto con las enzimas de restricción previamente elegidas a la temperatura de incubación adecuada durante 1 h, seguido de un tratamiento con fosfatasa durante la reacción vectorial durante 30 min para evitar la auto-ligación.</li>
	<li>Separe el vector digerido e inserte segmentos por electroforesis en un gel de agarosa de 1-1,5% (concentración dependiendo del tamaño de la plaquita).</li>
	<li>Usando una hoja y una luz UV, recoja los fragmentos de ADN que contienen el inserto y el vector deseados que se van a ligar. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.</li>
	<li>Purificar los segmentos recogidos del gel de agarosa utilizando un kit de purificación de PCR a base de sílice y medir la concentración por espectrofotometría a 260 nm.</li>
	<li>Ligar el GOI y el vector inducible con ligas a ADN T4 utilizando una relación molar vector:insert de 1:3 para aumentar la probabilidad de ligadura. Incubar la reacción a temperatura ambiente (RT) durante 3 h.</li>
	<li>Transformar la reacción de ligadura en E. coli competente (DH5).<ol>
<li>Añadir 1-10 ng de vector y gen a un tubo que contenga 100 ml de células competentes. Incubar las células sobre hielo durante 30 minutos y luego calentar las células a 42 oC durante 45 s. Coloque el tubo en hielo durante 2 min y agregue 900 sl de medio RT LB. Incubar las células durante 1 h a 37oC con agitación a 225 rpm.</li>
		<li>Esparza 100 oL de la reacción en una placa de agar LB con un antibiótico adecuado (p. ej., 100 g/ml de ampicilina para el vector pTRE-Tight) para seleccionar las bacterias transformadas. Incubar la placa durante la noche a 37oC.</li>
		<li>Seleccione colonias individuales utilizando un bucle de inoculación o una punta de 20 ml e incubar durante la noche en un medio LB de 5 ml que contenga el antibiótico adecuado a 37 oC con agitación. Las bacterias transformadas pueden almacenarse en poblaciones de glicerol a -80 oC a una proporción de 400:600 de medio LB a glicerol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraiga el ADN plásmido utilizando columnas de plásmido a base de sílice y mida la concentración por espectrofotometría a 260 nm. Confirmar la inserción del GOI mediante el análisis de restricciones y su orientación y la ausencia de mutaciones potencialmente introducidas durante rt-PCR mediante la secuenciación.</li>
</ol>2. Transfectar el plásmido de respuesta expresando el gen de interés (GOI) en células epiteliales alveolares primarias
<ol><li>Aislar las células epiteliales alveolares tipo II de los pulmones de las ratas.</li>
	<li>Sembrar las células a una densidad de 1 x 106 células/cm2 en platos Petri de 100 mm con medio esencial mínimo completo (MEM completo). El MEM completo se complementa con 10% DE FBS, 0,08 mg/L de tobramicina, Septra (3 g/ml de trimetoprim y 17 g/mL de sulfamethoxazol), 0,2% de NaHCO3,0,01 M HEPES (pH a 7,3) y 2 mM de L-glutamina. Cultivo de las células durante 24 h a 37oC en 5% deCO2 en una incubadora humidificada.</li>
	<li>Al día siguiente, coloque 500 ml de MEM completo sin antibióticos en cada pocto de una nueva placa de 12 pocillos y precaliente la placa a 37 oC durante 30 min. Durante este paso, es importante utilizar suero bovino fetal libre de tetraciclinas contaminantes o con un nivel demasiado bajo para interferir con la inducibilidad.</li>
	<li>Preparar tubos de 1,5 ml que contengan el plásmido con el GOI inducible (plásmido GOI) y el vector regulador (por ejemplo, pTet-Off) añadiendo 1 g de plásmido GOI y 1 g de vector regulador por pozo en RT. Para los experimentos de coexpresión con proteínas de unión al ARN (RBP), se añade a la mezcla de ADN(Figura 7) 1 g de un vector constitutivo (por ejemplo, pcDNA3) que expresa el RPB de interés.</li>
	<li>Aspirar el medio y enjuagar suavemente las células con PBS (sin calcio y magnesio) precalentado a 37 oC.</li>
	<li>Añadir 5 ml de 0,05% de trippsina precalentada a 37 oC e incubar las células hasta que las células estén separadas (2-4 min). Neutralizar la trippsina añadiendo 10 ml de MEM completo sin antibióticos.</li>
	<li>Recoger la suspensión celular en un tubo de 50 ml, lavar la placa Petri con 4 ml de medio para recoger tantas células restantes como sea posible, y luego centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Aspirar suavemente y desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 mL de PBS. Cuente y calcule el número de células utilizando un hemocitómetro.</li>
	<li>Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min. Aspirar suavemente el sobrenadante y resuspender el pellet en tampón de resuspensión a una concentración de 4 x 107 células/ml. Agregue las células del tubo de 1,5 ml preparadoen en el paso 2.4 a una concentración de 400.000 células por pozo y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Coloque el tubo en el dispositivo de electroporación y llénelo con 3,5 ml de tampón electrolítico.</li>
	<li>Inserte una punta de electrodo chapada en oro en una pipeta presionando completamente el pistón. Mezcle suavemente el contenido del tubo de 1,5 ml y aspire cuidadosamente las células con la pipeta. Tenga cuidado de evitar que las burbujas de aire entren en la punta, ya que esto causará arco eléctrico durante la electroporación y conducirá a una menor eficiencia de transfección.</li>
	<li>Inserte la pipeta en la estación de electroporación hasta que haya un sonido de clic.</li>
	<li>Seleccione el protocolo de electroporación adecuado para las células epiteliales alveolales, correspondiente a una tensión de pulso de 1.450 V y 2 pulsos con una anchura de 20 ms, y pulse Iniciar en la pantalla táctil.</li>
	<li>Inmediatamente después de la transfección, retire la pipeta y transfiera las células a un pozo previamente lleno con MEM completo sin antibiótico que haya sido precalentado a 37 oC.</li>
	<li>Repita los pasos 2.11-2.14 para las muestras restantes.</li>
	<li>Agitar suavemente la placa para extender las células uniformemente sobre la superficie del pozo. Incubar las células a 37oC en 5% co2 en una incubadora humidificada. Después de 2 días, sustituya el medio por MEM completo con antibióticos.</li>
	<li>Confirmar el éxito de la transfección observando la expresión de eGFP bajo un microscopio de fluorescencia o mediante citometría de flujo utilizando un vector de control (Figura 1). NOTA: Este paso es opcional y requiere un paso de transfección adicional utilizando un plásmido diferente que expresa eGFP, como pcDNA3-EGFP.</li>
</ol>3. Inducción de la inhibición de la transcripción del GOI
NOTA: Las células se pueden pretratar con los tratamientos deseados antes de la inducción de la doxiciclina para evaluar su impacto en la estabilidad del ARNm(Figura 5).
<ol><li>Preparar una solución de material de doxiciclina de 1 mg/ml en agua desionizada. Almacene la solución de stock a -20 oC protegida de la luz. La doxiciclina, un derivado de la tetraciclina, se utiliza en lugar de tetraciclina porque tiene una vida media más larga (2x) que la tetraciclina. Además, se requiere una menor concentración de doxiciclina para la inactivación completa del tet operon23. NOTA: La doxiciclina podría afectar la expresión de ARNm del GOI endógeno. Para verificar esto, se debe probar el efecto de un tratamiento de 24 horas con doxiciclina en células alveolares para confirmar la ausencia de cambios en la expresión goI(Figura 2).</li>
	<li>Preparar una solución de doxiciclina fresca de 1 g/ml en una posttransfección completa de MEM 72 h y calentarla a 37 oC.</li>
	<li>Sustituya el medio por 1 ml de MEM completo que contenga 1 g/ml de doxiciclina por pocto para inhibir la transcripción del GOI.</li>
	<li>Incubar múltiples pozos a 37oC en 5%CO2 para diferentes cantidades de tiempo de 15 min-6 h para evaluar la vida media del ARNm del GOI.</li>
	<li>Al final del tratamiento, lave las células con PBS helado y lilícea con un kit de extracción de ARN fenol-cloroformo disponible comercialmente añadiendo 500 ml de tampón por poca y agitando la placa para homogeneizar las células.</li>
	<li>Aísle el ARN de acuerdo con el protocolo del fabricante. Determinar el rendimiento y la pureza del ARN mediante espectrofotometría a 230, 260 y 280 nm. Las muestras de ARN con relaciones 260:230 y 260:280 de 1,8 y 2,0, respectivamente, se consideran puras. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.</li>
</ol>4. Determinar la estabilidad del ARNm del GOI
<ol><li>Tratar 1 g de ARN total con ADNsa libre de ARN I (grado de amplificación) para eliminar cualquier rastro de ADN plásmido que pueda interferir con la amplificación posterior del ADN.<ol>
<li>En un tubo de PCR de 0,2 ml, combine 1 g de ARN total, 1 l de tampón de reacción DNase I 10x, 1 l de DNAse I (1 U/L) y agua libre de ARNi para obtener un volumen total de 10 l.</li>
		<li>Incubar la reacción a RT durante 20 min.</li>
		<li>Desactive la DNAse I añadiendo 1 ml de EDTA de 25 mM a la mezcla de reacción de 10 ml e incubando la reacción a 70 oC durante 10 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfiera inversamente el ARN total agotado por ADN en el ADNc utilizando un kit de síntesis de ADNc disponible comercialmente con una mezcla de imprimaciones de hexamer aleatorias y oligo(dT) para mejorar la eficiencia de la transcripción inversa.<ol>
<li>En resumen, añadir 4 l de mezcla de reacción de 5x, 1 l de transcriptasa inversa y 4 l de agua libre de ANR a 11 ml de la mezcla total de ARN agotada por ADN para obtener un volumen de reacción total de 20 l. Mezcle bien la reacción pipetándola hacia arriba y hacia abajo.</li>
		<li>Incubar la reacción durante 5 min a 25oC, seguida de 20 min a 46oC, y luego inactivar la reacción incubando a 95oC durante 1 min. Cada reacción producirá 50 ng/L de producto de ADNc.</li>
		<li>Diluir la reacción de ADNc a una concentración de 5 ng/L añadiendo 180 ml de agua de grado de biología molecular a la mezcla de reacción de 20 ml. Almacene los productos de ADNc a -80 oC o proceda inmediatamente a la realización de PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR). NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.</li>
	</ol></li>
	<li>Diseñe imprima imprimaciones qPCR hacia adelante y hacia atrás específicas del GOI.<ol>
<li>Debido a la expresión endógena del GOI en las células, las imprimaciones deben diseñarse para amplificar un amplicon de 100-150 bp del epítopo V5 acoplado al GOI (Tabla 1).</li>
		<li>Las imprimaciones genéticas de referencia interna también deben utilizarse como controles de normalización. Por lo general, los genes de limpieza, como los genes de beta-actina e hipoxantina fosforibosyltransferasa 1, se utilizan como genes de referencia. Sin embargo, estos no se pueden utilizar con este sistema de inducción debido a la variación de la eficiencia de la transfección. En su lugar, la expresión de la transcripción tTA-Ad se evalúa a los efectos de la normalización, porque su expresión es constitutiva en las células debido a la actividad del promotor del citomegalovirus. Cualquier variación en su expresión medida por qPCR será representativa de la eficiencia de la transfección (primers: adelante 5'-GCC TGA CGA CAA AAC TC-3' y reversa 5'-AGT GGG GAT GCC TGT CCCC CC-3; 129 bp amplicon) y permitirá la normalización de la expresión de los clones transinfectados (Figura 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare cada reacción qPCR en triplicado utilizando una mezcla maestra de tinte verde SYBR.<ol>
<li>Diluir la mezcla de ADNc de 5 ng/L a una concentración de 1,25 ng/L utilizando agua de grado de biología molecular.</li>
		<li>Combinar 5 l de mezcla maestra de tinte verde SYBR (2x), 0,1 l de agua de grado de biología molecular, 0,45 ml de imprimación de avance de 7,5 oM, 0,45 ml de imprimación inversa de 7,5 m y 4 l de 1,25 ng/L de ADN para obtener un volumen de reacción total de 10 ol. Mezcle bien enpipeando hacia arriba y hacia abajo en una placa de PCR de 96 g. Utilice una película adhesiva óptica para asegurarse de que la cubierta de la placa esté sellada y para evitar la contaminación y la evaporación.</li>
		<li>Gire brevemente la mezcla de reacción por centrifugación y coloque la placa en un termociclador qPCR.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplifique los amplicons GOI y tTA-Ad con etiqueta V5 utilizando las siguientes condiciones qPCR: 95 oC durante 10 min como paso de desnaturalización, seguido de 40 ciclos de 95 oC para 10 s, 58 oC para 15 s y 72 oC para 20 s. Se debe generar una curva de fusión de alta resolución después de que se realicen los ciclos de amplificación para evaluar las temperaturas de fusión específicas de los amplicones deseados y garantizar la ausencia de picos de amplificación de ruido.<ol>
<li>Incluir controles negativos para el qRT-PCR realizando qPCR con ARN como plantilla sin transcriptasa inversa para servir como control para la posible contaminación por plásmido del ADN y qPCR sin ADNc añadido a la mezcla qPCR para asegurar la falta de dimers de imprimación o Contaminantes.</li>
		<li>La concentración óptima de ADNc, la eficiencia de imprimación y la concentración deben optimizarse de acuerdo con el GOI mediante un ensayo de curva estándar. Para ello, realice una dilución en serie utilizando ADNc de células no tratadas (cultivadas sin doxiciclina). La curva estándar se genera trazando los valores de Cq con el registro del factor de dilución cDNA, y la eficiencia de amplificación (E) se calcula de acuerdo con la pendiente de la curva estándar utilizando la siguiente fórmula: E 10-1/pendiente NOTA: La eficiencia de amplificación debe ser de aproximadamente 0,9 a 1,05. De lo contrario, las imprimaciones deben ser rediseñadas.</li>
	</ol></li>
	<li>Analice los datos qPCR utilizando el método cq comparativo normalizando los valores de expresión del GOI a la expresión de tTA-Ad para obtener los niveles de expresión relativos del GOI e informar de su expresión como un porcentaje de la expresión de ARNm del GOI en células del mismo animal en el punto de partida (t - 0) (Figura 4).</li>
	<li>La vida media se determina a partir de la constante de velocidad (K) de la curva de degradación del ARNm GOI utilizando la siguiente ecuación: t1/2 ln 2/K.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

La baja tasa de transfección de las células epiteliales alveolares en el cultivo primario ha sido una grave limitación para el uso del sistema Tet-Off para evaluar la estabilidad del ARNm en estas células. Sin embargo, esta limitación fue superada por la electroporación de pipetas, permitiendo una eficiencia de transfección del 25-30%(Figura 1 y Figura 3)26.
La medición de la estabilidad de la transcripción es ...

Se han desarrollado varias técnicas para determinar la vida media de los ARNm. La técnica de descomposición de la persecución por pulsos, que utiliza ARNm etiquetados, permite la evaluación simultánea de una gran piscina de ARNm con mínima perturbación celular. Sin embargo, este enfoque no permite una estimación directa de la vida media de una sola transcripción genética y no se puede implementar para estudiar la modulación posttranscripcional de un ARNm después de la estimulación con factores de crecimiento, ROS, alarminas o inflamación1.
El uso de inhibidores de la transcripción, como la actinomicina D y la amanitina, es un método relativamente simple para medir la cinética de degradación del ARNm a lo largo del tiempo. Una ventaja principal de este enfoque sobre el de las técnicas anteriores , (es decir, la persecución por pulsos) se basa en la capacidad de estimar directamente la vida media de una transcripción determinada y comparar cómo diferentes tratamientos podrían afectar su cinética de degradación. Sin embargo, el impacto nocivo significativo de los inhibidores de la transcripción en la fisiología celular representa un inconveniente importante del enfoque2. De hecho, la inhibición de todo el transcriptoma celular con estos fármacos tiene el efecto secundario negativo de perturbar la síntesis de elementos clave involucrados en la estabilidad del ARNm, como los microARN (miRNAs), así como la expresión y síntesis de proteínas de unión al ARN, que son importantes para la degradación y estabilidad del ARNm. Por lo tanto, la perturbación severa de la transcripción génica por estos fármacos podría modificar artefrealmente las curvas de degradación de las transcripciones.
El sistema de inducción del promotor representa un tercer enfoque para medir la vida media de un ARNm específico. Este método mide la degradación de un ARNm específico de una manera similar a los métodos que utilizan inhibidores de la transcripción. Con frecuencia se utilizan dos tipos de sistemas de inducción: el promotor c-fos inducido por suero3 y el sistema inducible Tet-Off4. Con el sistema c-fos, no es necesario el uso de inhibidores de transcripción que pueden ser tóxicos para la célula. Sin embargo, este método requiere la sincronización del ciclo celular, que impide la evaluación de la estabilidad real de una transcripción durante la interfase5. Por el contrario, el sistema Tet-Off permite la fuerte expresión del gen de interés (GOI) bajo el control de un promotor sintético regulado por tetraciclina. Este sistema requiere que la presencia de dos elementos que deben ser cotransinfectados en la célula sean funcionales. El primer plásmido (pTet-Off) expresa la proteína reguladora tTA-Adv, un factor de transcripción sintética híbrida compuesto por el represor prokariotate TetR (de Escherichia coli) fusionado a tres dominios de transactivación de transcripción de la proteína viral HSV VP16. El GOI se clona en el plásmido pTRE-Tight bajo el control de un promotor sintético (PTight),que comprende la secuencia mínima del promotor del citomegalovirus (CMV) fusionado a siete repeticiones de la secuencia del operador tetO. La transcripción del gen aguas abajo de PTight depende de la interacción de TetR con tetO. En presencia de tetraciclina o su derivado, doxiciclina, el represor TetR pierde su afinidad por el operador tetO, lo que lleva a un cese de la transcripción4. Las características del sistema Tet-Off lo convierten en un modelo ideal para el estudio de la expresión de ARNm específica en células eucariotas evitando al mismo tiempo posibles efectos pleiotrópicos que son secundarios a la ausencia de secuencias reguladoras procariotas en la célula eucariota6. Por lo general, las líneas celulares Tet-Off doblemente estables (HEK 293, HeLa y PC12) se utilizan con este sistema para integrar copias del regulador y plásmidos de respuesta para un acceso conveniente a la expresión génica controlable7,8,9.
Varios modelos de células epiteliales alveolares en cultivo se han utilizado para estudiar la biología celular y molecular del epitelio alveolar. Durante años, los investigadores han utilizado ampliamente células primarias humanas o roedores10,11, así como líneas celulares inmortalizadas como células Humanas A549 o ratas RLE-6TN12,13. Aunque generalmente son menos proliferativas y más difíciles de cultivar y transfectar, las células epiteliales alveolares en el cultivo primario siguen siendo el estándar de oro para el estudio de la función y disfunción del epitelio alveolar en condiciones fisiológicas y patológicas. De hecho, las líneas celulares inmortalizadas como las células A549 no presentan las características complejas y fenotipos de las células primarias, mientras que las células epiteliales alveolares en el cultivo primario recapitulan las principales propiedades del epitelio alveolar, en particular la capacidad de formar una barrera polarizada y estrecha14,15. Desafortunadamente, estas células son muy resistentes a las técnicas de transfección convencionales, como las que utilizan liposomas, haciendo muy difícil el uso de un sistema inducido por el promotor como Tet-Off.
La modulación posttranscripcional de los ARNM es uno de los métodos más eficaces para modular rápidamente la expresión génica de una transcripción16. La región no traducida del ARNM 3 (3' UTR) desempeña un papel importante en este mecanismo. Se ha demostrado que, a diferencia del UTR de 5', existe una correlación exponencial entre la longitud del UTR de 3' y las complejidades celulares y morfológicas de un organismo. Esta correlación sugiere que el UTR de 3', al igual que las regiones de codificación mRNA, ha sido sometido a una selección natural para permitir una modulación posttranscripcional cada vez más compleja a lo largo de la evolución17. El UTR de 3' contiene varios sitios de unión para proteínas y miRNAs que afectan a la estabilidad y traducción de la transcripción.
En el presente trabajo, desarrollamos una herramienta para investigar el papel de los dominios altamente conservados en el UTR de 3' de un GOI para el control de la estabilidad de la transcripción. Nos centramos en el canal epitelial de sodio, subunidad alfa ( ENaC), que desempeña un papel clave en la fisiología epitelial alveolar18. Las células epiteliales alveolares en el cultivo primario se transtrusaron transitoriamente con éxito con los dos componentes del sistema Tet-Off, lo que permite el estudio del papel de la UTR de 3' en la estabilidad del ARNm con un sistema que afecta mínimamente a la fisiología celular y al metabolismo en comparación con el uso de inhibidores de transcripción con otros protocolos. Se desarrolló una estrategia de clonación para diferenciar la expresión del GOI de la del gen endógeno utilizando un epítopo no endógeno (V5). La respuesta y los plásmidos reguladores se transfirieron a las células epiteliales alveolares mediante una técnica de electroporación de pipetas. Posteriormente, la expresión de la transcripción se midió incubando las células con doxiciclina en diferentes intervalos de tiempo. La vida media de la transcripción fue evaluada por RT-qPCR con un método Cq modificado utilizando el producto mRNA tTA-Ad transinfectado para su normalización. A través de nuestro protocolo, ofrecemos una manera conveniente de estudiar la modulación posttranscripcional de una transcripción en diferentes condiciones y definir la participación de las regiones no traducidas con más detalle.

<table><tbody><tr><td>Actinomicina D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>Bright-LineHemacitómetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo - Grado de biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>DM IL LED Microscopio invertido con contraste de fase</td><td></td><td></td> Leica-DNasa <td></td></tr><tr><td>I, grado de amplificación</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td></td></tr><tr><td>Hiclato de doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (D-PBS), sin calcio ni magnesio</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol - Grado de biología molecular</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25 ConsolaIncubadoraShaker</td><td>Eppendorf</td><td>1220G76</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7.3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51026420</td><td></td></tr><tr><td>iScript Kit de síntesis de ADNc</td><td>Bio-Rad Laboratories 1708890</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol - Grado de biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo con agar (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacáridos dePseudomonas aeruginosa10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9143</td><td></td></tr><tr><td>MEM, polvo</td><td>Gibco</td><td>61100103</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Placa de reacción óptica de 96 pocillos</td><td>Biosystems aplicados</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>Película adhesiva óptica MicroAmp</td><td>Biosystems aplicados</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Cabinas de seguridad biológica MSC-Advantage Clase II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51025413</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis Mupid-exU</td><td>Takara Bio</td><td>AD140</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de transfección de neón 10 &micro; L Kit</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System Starter Pack</td><td>Invitrogen MPK5000S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td></td></tr><tr><td>One Shot OmniMAX 2 T1RCémicamente competenteE. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C854003</td><td></td></tr><tr><td>pcVector DNA3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>plásmido pcDNA3-EGFP</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>PlatinumTaqDNA Polimerasa de alta fidelidad</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>pTet-Off Vector avanzado</td><td>Takara Bio</td><td>631070</td><td></td></tr><tr><td>pTRE-Tight</td><td>vector Takara Bio 631059</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Células epiteliales alveolares purificadas</td> n.a.n.a.QIAEX <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>II Kit de extracción de gel</td><td>QIAGEN</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 y 7 Flex Sistema de PCR en tiempo real</td> Software <td>Applied Biosystems</td><td>n.a.QuantStudio</td><td></td></tr> <tr><td>6 Flex Sistema de PCR en tiempo real, 96 pocillos Biosystems</td> de <td>aplicación</td> rápida <td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Rata recombinante TNF-alfa Proteína</td><td>R& amperio; D Systems</td><td>510-RT-010</td><td></td></tr><tr><td>Septra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2487</td><td></td></tr><tr><td>Camarones Fosfatasa alcalina (rSAP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green</td><td>Supermix Bio-Rad Laboratories</td><td>1725270</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Transcriptasa inversa</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Tet Aprobado por el sistema FBS</td><td>Takara Bio</td><td>631367</td><td></td></tr><tr><td>Tobramicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa UltraPura</td><td>Invitrogen 16500500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua, Biología molecular Grado</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-EL</td><td></td></tr></tbody></table>

sistema eficiente de expresión de plásmido controlado por transcripción para la investigación de la estabilidad de las transcripciones de arnm en células epiteliales alveolares primarias

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

El estudio de la regulación posttranscripcional es fundamental para entender la modulación de un ARN mensajero (ARNm) dado y su impacto en la homeostasis celular y el metabolismo. De hecho, las fluctuaciones en la expresión de transcripción podrían modificar la eficiencia de la traducción y, en última instancia, la actividad celular de una transcripción. Se han desarrollado varios enfoques experimentales para investigar la vida media del ARNm, aunque algunos de estos métodos tienen limitaciones que impiden el estudio adecuado de la modulación posttranscripcional. Un sistema de inducción promotor puede expresar un gen de interés bajo el control de un promotor sintético regulado por tetraciclina. Este método permite la estimación de la vida media de un ARNm dado bajo cualquier condición experimental sin perturbar la homeostasis celular. Un inconveniente importante de este método es la necesidad de transfectar las células, lo que limita el uso de esta técnica en células primarias aisladas que son altamente resistentes a las técnicas de transfección convencionales. Células epiteliales alveolares en el cultivo primario se han utilizado ampliamente para estudiar la biología celular y molecular del epitelio alveolar. Las características únicas y el fenotipo de las células alveolares primarias hacen que sea esencial estudiar las modulaciones posttranscripcionales de genes de interés en estas células. Por lo tanto, nuestro objetivo era desarrollar una herramienta novedosa para investigar las modulaciones posttranscripcionales de los ARNm de interés en las células epiteliales alveolares en el cultivo primario. Diseñamos un protocolo de transfección transitoria rápido y eficiente para insertar un sistema de expresión de plásmido controlado por transcripción en células epiteliales alveolares primarias. Esta estrategia de clonación, utilizando un epítopo viral para etiquetar la construcción, permite la fácil discriminación de la expresión de la construcción a partir de la de los ARNm endógenos. Mediante el uso de un método de ciclo de cuantificación (Cq) modificado, la expresión de la transcripción se puede cuantificar en diferentes intervalos de tiempo para medir su vida media. Nuestros datos demuestran la eficiencia de este enfoque novedoso en el estudio de la regulación posttranscripcional en diversas condiciones fisiopatológicas en células epiteliales alveolares primarias.

Este protocolo se utilizó con éxito para generar un sistema de expresión de plásmido controlado transcripciónteamente Tet-Off para evaluar la importancia de diferentes porciones de la UTR de 3' en la modulación de la estabilidad de la transcripción en células epiteliales alveolares primarias.
El primer paso en la implementación de este sistema fue establecer una técnica de transfección rápida, fácil y eficiente para las células ...

Aquí, presentamos una herramienta que se puede utilizar para estudiar la modulación posttranscripcional de una transcripción en células epiteliales alveolares primarias mediante el uso de un sistema de expresión inducible acoplado a una técnica de electroporación de pipeta.

Sistema eficiente de expresión de plásmido controlado por transcripción para la investigación de la estabilidad de las transcripciones de ARNm en células epiteliales alveolares primarias

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Así que nuestro modelo permite el estudio de la modulación post-transcripción de una transcripción específica en células epiteliales alveolares en el cultivo primario y sus condiciones fisiológicas y fisiopatológicas. Por lo tanto, la transfección transitoria de las células epiteliales alveolares primarias tiene un efecto mínimo en la fisiología celular y los metabolismos, lo que supone una clara ventaja sobre los protocolos clásicos que utilizan inhibidores de la transcripción. Para la generación de un plásmido de respuesta que exprese un gen de interés, la secuencia del gen y los múltiples sitios de clonación del vector inducible deben ser analizados para identificar las secuencias de reconocimiento en los múltiples sitios de clonación que no están presentes internamente en el gen.Utilizando técnicas de alta fidelidad de taq polimerasa y PCR de superposición estándar, flanquee el gen de interés con dos sitios seleccionados de reconocimiento de enzimas de restricción utilizando imprimaciones de diseño. Debe incluirse una secuencia en la codificación del epítopo V5 aguas arriba del gen de interés para distinguir la expresión del gen trans infectado de la expresión endógena. Los mut

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

ARN polimerasa II cinética de transcripción se miden en genes específicos en células vivas. ARNm transcrito a partir del gen de interés están marcados con fluorescencia y el uso de recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP), la vivo en la cinética de la elongación de la transcripción se obtienen.

La medición de la cinética de la transcripción de ARNm en las células vivas solo

Este video describe el método de regulación de la expresión génica en células cultivadas mediante transfección con un plásmido que contiene un gen de interés y un plásmido regulador. La expresión de este plásmido puede ser controlada por tetraciclina o sus análogos sintéticos, lo que convierte a este sistema en un modelo útil para estudiar la expresión génica regulable.

Sistema regulable Tet-off inducible: un método in vitro para modular la expresión génica en células cultivadas mediante el sistema Tetraciclina-Off

Los ratones transgénicos o vectores virales se han utilizado para aumentar la expresión de la proteína en el pulmón. Sin embargo, estas técnicas son mucho tiempo, y técnicamente difícil tener efectos fuera de objetivo que pueden confundir los resultados. Nuestro protocolo de transfección de proteína utiliza un reactivo de transfección basado en lípidos y un microsprayer ultrafino para entregar de manera uniforme proteína activa a las células pulmonares.

La transfección de proteínas de ratón de pulmón

Las células epiteliales bronquiales humanas primarias son difíciles de transducir. Este protocolo describe la producción de lentivirus y su concentración, así como las condiciones óptimas de cultivo necesarias para lograr transducciones altamente eficientes en estas células a lo largo de la diferenciación a un epitelio pseudoestratificado.

Lentivirus óptimo de producción y el cultivo celular condiciones necesarias para la transducción de éxito células epiteliales bronquiales humanos primarios

El estudio de los canales iónicos a través de un sistema de expresión de forma heteróloga se ha convertido en una técnica básica en la investigación biomédica. En este manuscrito, se presenta un método eficiente de tiempo para conseguir la expresión del canal iónico fuertemente controlada mediante la realización de la transfección transitoria bajo el control de un promotor inducible.

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Los macrófagos, especialmente los macrófagos primarios, son difíciles de transfectar, ya que se especializan en la detección de moléculas de origen no propio. Describimos un protocolo que permite la transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm generados a partir de plantillas de ADN como plásmidos.

Transfección altamente eficiente de macrófagos primarios con ARNm transcrito in Vitro

Desarrollamos un ensayo informador de biogénesis de microARN intrónico para ser utilizado en células in vitro con cuatro plásmidos: uno con miARN intrónico, uno con el objetivo, uno para sobreexpresar una proteína reguladora y uno para Renilla luciferasa. El miARN se procesó y pudo controlar la expresión de luciferasa uniéndose a la secuencia objetivo.

Un ensayo reportero para analizar la maduración intrónica de microARN en células de mamíferos

Aquí se presenta un método reproducible, asequible y robusto para el aislamiento y la expansión de células epiteliales bronquiales primarias para biobancos a largo plazo y la generación de células epiteliales diferenciadas por cultivo en la interfaz aire-líquido.

Aislar células epiteliales bronquiales del tejido pulmonar resecado para biobancos y establecer cultivos de interfaz aire-líquido bien diferenciados

Este protocolo presenta un método basado en citometría de flujo para aislar células epiteliales alveolares tipo II (AECII) viables de pulmones murinos neonatales, juveniles o adultos (infectados o no infectados). Este enfoque permite que estudios moleculares y/o funcionales posteriores de AECII identifiquen sus funciones durante la inflamación e infección pulmonar.

Aislamiento de células epiteliales alveolares tipo II de pulmones murenos neonatales, juveniles y adultos adaptables a entornos experimentales infecciosos

En este artículo, presentamos un protocolo para utilizar el ARN interferente pequeño específico de la proteína de choque térmico 27 (HSP27) para evaluar la función de HSP27 durante la cicatrización de heridas epiteliales corneales. La interferencia de ARN es el mejor método para reducir eficazmente la expresión génica para investigar la función de las proteínas en varios tipos de células.

basado en la interferencia de ARN Investigación de la Función de la proteína de choque térmico 27 ​​durante la curación de la herida corneal epitelial

Aprende un sistema de expresión plasmídica inducible para estudiar la estabilidad del ARNm en células epiteliales alveolares primarias mediante electroporación con pipeta. Este método minimiza la alteración de la fisiología celular.

Sistema eficiente de expresión de plásmido controlado por transcripción para la investigación de la estabilidad de las transcripciones de ARNm en células epiteliales alveolares primarias (Video) | JoVE Journal

Sistema eficiente de expresión de plásmido controlado por transcripción para la investigación de la estabilidad de las transcripciones de ARNm en células epiteliales alveolares primarias

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