Name: Un novedoso modelo de esferoides de tumor 3D modulado por fibroblastos para el estudio de la interacción tumor-Stroma y el descubrimiento de fármacos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Aprende a desarrollar esferoides tumorales 3D mediante cocultivo de células de melanoma y fibroblastos para estudiar interacciones tumor-estroma y evaluar respuestas a fármacos. Este modelo imita condiciones in vivo.

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Agradecemos a la Dra. Omaida C. Velázquez (Universidad de Miami) por su útil colaboración, consulta y discusión; Dra. Jie Li (Universidad de Miami) por proporcionar células MeWo; y el Dr. Meenhard Herlyn (Instituto Wistar) por proporcionar todas las demás células del melanoma. También agradecemos a la Dra. Marcia Boulina, Directora de Analytical Imaging Core Facility, Universidad de Miami, por el análisis de imágenes. Zhao-Jun Liu recibió el apoyo de subvenciones del Programa de Investigación del Cáncer Bankhead-Coley (Premio 09BN-11), la Asociación contra el Cáncer de La Mujer (la subvenciónanual 53) y fondos internos de la Universidad de Miami.

1. Culturing Melanoma Cells and Skin Fibroblasts
<ol><li>Culturing células de melanoma humano<ol>
<li>Cultivo de células de melanoma humano, C816131 bajo condiciones de cultivo celular adherente convencionales en medio completo W489 (ver paso 1.2) en una incubadora de 37 oC suministrada con 5% CO2 como se describió anteriormente32. Divida las celdas en una proporción de 1:5 cuando alcancen una confluencia del 90 %.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medio de cultivo celular de melanoma (W489)<ol>
<li>Para un medio W489 completo, utilice 80% MCDB153 medio, 20% l-15 medio (ver Tabla de materiales),2% de suero bovino fetal (FBS), insulina de 5 g/ml, 1,68 mM CaCl2y 0,11% bicarbonato sódico. Para la cocultura, no agregue FBS, insulina y CaCl2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aislamiento de fibroblastos de piel de ratón<ol>
<li>Corte un fragmento de piel de 1 cm x 1 cm de un ratón de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes del Comité de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la institución.</li>
		<li>Digerir la piel por dispase (ver Tabla de Materiales)a 4oC durante la noche. Retire la dermis de la epidermis y digerir más con colagenasa (1 mg/ml en DMEM, ver Tabla de materiales)a temperatura ambiente (RT) durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultivo de fibroblastos de piel de ratón<ol>
<li>Lavar los gránulos de tejido con PBS y cultivarlos en DMEM con 10% FBS y 1% penicilina-estreptomicina en 37oC/5% CO2. Divida las celdas en una proporción de 1:2 cuando alcancen una confluencia del 90 %.</li>
		<li>Transducir los fibroblastos de la piel con GFP/lentivirus utilizando métodos estándar antes del cocultivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Caracterización de fibroblastos de piel de ratón mediante inmunomancha<ol>
<li>Preparación celular para la tinción<ol>
<li>Semilla de los fibroblastos de la piel en 24 placas de pozo a una densidad de 2 x 104 células /bien. El día 2, lave las células con PBS 2x y fijelas en formalina tamponada neutra al 2% durante 10 minutos. Retire la formalina y lave las células fijas con PBS dos veces.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Immunostaining<ol>
<li>Añadir 200 l de solución de bloqueo a cada poca y acubar la placa durante 30 minutos a RT, luego añadir el ratón anti-SMA diluido a 1:200 e incubar a 37 oC durante 1 h. Lavar con PBS 3x, 5 min cada uno.</li>
			<li>Añadir Alex Fluor 488 cabra anti-ratón IgG a 1:400 dilución e incubar a RT durante 1 h. Lavar los anticuerpos 3x con PBS, 5 min cada uno.</li>
			<li>Añadir 1 G/ml dAPI e incubar a RT durante 2 min. Retire la solución de DAPI y agregue 500 sL de PBS en cada poca.</li>
			<li>Observe las células y tome imágenes con un microscopio de fluorescencia invertida.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preetiquetado de fibroblastos y células de melanoma<ol>
<li>La semilla se convierte en un plato de 100 mm el día 1 para que la confluencia celular alcance el 60% al día siguiente. En el día 2, retire el medio de cultivo y agregue GFP/lentivirus (1:3–1:5 diluido de stock) en un medio de cultivo regular con 4 g/ml de polibrino. Incubar células en una incubadora de 37oC durante 6 h, retirar el medio y reemplazarlo por un medio de cultivo regular fresco. Después de 2 días, observe la señal GFP de las células utilizando un microscopio de fluorescencia. Transduce las células C8161 con DsRed/lentivirus en condiciones similares. Los protocolos para la preparación de GFP/lentivirus y DsRed/lentivirus se han descrito previamente14,34.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cocultura celular
<ol><li>Semilla de la cocultura C8161-fibroblasto.<ol>
<li>En el día 0 del ensayo de formación de esferoides, separa tanto el C8161 como los fibroblastos de la piel usando 0.25% trypsin-EDTA. Gire las células a 250 g durante 5 minutos en RT y lave una vez con PBS.</li>
		<li>Resuspender las células en el medio de cocultivo celular (sin suero, sin insulina, y el medio w489 libre de calcio mezclado con DMEM libre de suero en una proporción de 1:1). Ajuste la concentración celular a 2 x 104 celdas/ml.</li>
		<li>Mezcle las células C8161 con los fibroblastos en una proporción de 1:1 y agregue 2 ml de las mezclas celulares a cada pocal de una placa de 24 pocillos. Cada pozo debe contener 2 x 104 de cada tipo de celdas. Cada condición debe hacerse por triplicado. NOTA: Es importante utilizar una placa tratada con cultivo no tisular (ver Tabla de Materiales). De lo contrario, las células se unirán fuertemente a una placa y no podrán suspender los esferoides.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar células a 37 oC durante 4 horas hasta que las células se adhieran a la placa, y luego realizar imágenes de lapso de tiempo o exploración confocal en los puntos de tiempo indicados para cada ensayo.</li>
</ol>3. Imágenes de lapso de tiempo de celda sin vida
<ol><li>Antes de la cocultura, encienda el sistema de imágenes de lapso de tiempo (ver Tabla de Materiales)siguiendo las instrucciones del fabricante y deje que la incubadora alcance los 37 oC y el 5% de CO2. Por lo general, el sistema tarda 1 h en alcanzar el equilibrio. Coloque cuidadosamente la placa de cultivo en el escenario del microscopio dentro de la incubadora y cierre la puerta de forma segura.</li>
	<li>Abra el software del sistema de imágenes de lapso de tiempo (consulte Tabla de materiales)y elija el tipo de placa y el fabricante para que el microscopio pueda localizar el área de escaneo con precisión. Elige los pozos de interés y una lente objetivo 10x. Elija la configuración para el área de escaneado, el tiempo de intervalo entre los escaneos y un tiempo de inicio y de finalización. En este protocolo, el número de formato máximo para el área de escaneo para 1 pozo es 36 y el tiempo de intervalo es 1 h.</li>
	<li>Registre imágenes de lapso de tiempo de 4 a 52 h. NOTA: La hora de inicio, la hora de finalización y la duración deben optimizarse por tipo de celda y el propósito del experimento.</li>
	<li>Al completar la grabación de imágenes, utilice el software del sistema de imágenes de lapso de tiempo para recuperar los datos y exportar vídeos o conjuntos de imágenes.</li>
</ol>4. Microscopía confocal y películas 3D
<ol><li>Coloque la placa de cocultivo celular en el escenario de un microscopio de fluorescencia invertido (ver Tabla de Materiales)y utilice rayos láser rojos y verdes. Observe las células bajo una lente objetivo de 5x o 10x y elija un esferoide para comenzar a escanear.</li>
	<li>Utilice un paso z de 1 m para escanear de abajo a arriba del esferoide. Procesar los datos utilizando el software de procesamiento de imágenes (consulte Tabla de materiales)para reconstruir una imagen 3D que se puede girar y guardar aún más como una película 3D.</li>
</ol>5. Cultivo en solitario de células de melanoma y formación de grupos/agregados 2D
<ol><li>Semilla 2 x 104 C8161 células de melanoma en cada pocal de una placa de 24 pozos como se describe en la sección 2.1. Cultivo de las células durante 7-10 días y fotografiarlas usando un microscopio de fluorescencia invertida.</li>
</ol>6. Comprobación de si los esferoides 3D y los clústeres de celdas/agregados 2D están suspendidos en el medio o unidos a las placas
<ol><li>Para la cocultura celular, compruebe los esferoides 3D formados el día 7. Para el cultivo de una sola celda, compruebe los clústeres/agregados 2D formados el día 10.</li>
	<li>Establezca las placas de cultivo celular en la plataforma de un microscopio de fluorescencia invertido. Coloque una aguja doblada con una jeringa en un pozo y aspire suavemente el medio de cultivo para perturbar el medio de cultivo en los pozos. Grabe este proceso utilizando el modo de película del software de película (consulte Tabla de materiales). Los esferoides 3D serán móviles, pero los clústeres/agregados de celdas 2D permanecerán firmes.</li>
</ol>7. Imagen confocal de esferoides 3D
NOTA: Las células cocultivadas comienzan a formar esferoides de 48-72 h dependiendo del tipo de fibroblastos utilizados. Generalmente, los esferoides se agrandan gradualmente con el tiempo. Los esferoides pequeños pueden fusionarse para formar esferoides más grandes hasta el día 7. Después de que los esferoides se estabilizan en tamaño, pueden durar más de 10 días. Después de eso, los esferoides a menudo se separan de la parte inferior de la placa de cultivo y se congregan en el centro de los pozos. Durante el agrandamiento de los esferoides, las células en el centro generalmente mueren debido a una nutrición insuficiente y / o un microambiente tóxico. Por lo tanto, el pico de formación de esferoides 3D y el tiempo para crear imágenes de los esferoides maduros deben optimizarse mediante experimentos piloto. Para este protocolo, la microscopía confocal se realizó alrededor del día 7 cuando los esferoides eran maduros y las células en el centro de los esferoides seguían vivas de acuerdo con la fluorescencia y morfología de las células en el centro.
<ol><li>Para hacer microscopía confocal, utilice un láser verde y rojo para escanear los esferoides. Determinar el área de escaneo bajo un objetivo de 10x y mover de la parte inferior a la parte superior del esferoide con un paso z de 1 m.</li>
	<li>Genere los videos de formación y rotación de esferoides 3D utilizando la función de proyección 3D del software de procesamiento de imágenes (por ejemplo, ImageJ).</li>
</ol>8. Actividad de la vía de señalización Intracelular Notch1 en la determinación de la regulación estromal del tallo del cáncer/células de iniciación
<ol><li>Aislamiento y caracterización de fibroblastos cutáneos de ratones Notch1 de ganancia y pérdida de función<ol>
<li>Aislar fibroblastos cutáneos de dos pares de ratones modificados genéticamente: Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; ROSALSL-N1IC+/+) frente a su control homólogo (GOFctrl : FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC+/+) ratones y Notch1 de pérdida de función (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) frente a su control homólogo (LOFctrl : FSP1. Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) ratones31, respectivamente. Aislar y caracterizar los fibroblastos cutáneos utilizando el protocolo descrito en las secciones 1.3-1.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transducir los fibroblastos de la piel del ratón con GFP/lentivirus.<ol>
<li>Consulte la sección 1 del método para transducir las células con el vector lentiviral.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cocultivo de fibroblastos y células de melanoma<ol>
<li>Lleve a cabo el experimento de cocultivo celular como se describe en la sección 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Evaluar el efecto de la actividad de la vía Notch1 intracelular en los fibroblastos en la determinación de la regulación estromal del tallo del cáncer/células que inician midiendo los tamaños de los esferoides 3D<ol>
<li>Llevar a cabo la cuantificación de la formación de esferoides bajo cada condición fotografiando los esferoides en el momento en que los esferoides están maduros (indicado por la parada del crecimiento alrededor del día 5-7 dependiendo de los tipos de fibroblastos). Mida los tamaños de los esferoides 3D utilizando el software de procesamiento de imágenes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. Prueba de la respuesta a los medicamentos del tallo del cáncer/células de iniciación utilizando el ensayo esferoide 3D
NOTA: CAF puede regular la heterogenicidad del cáncer e inducir el fenotipo de las células madre/iniciadoras del cáncer. CAF también apoya las células madre/iniciadoras del cáncer para soportar tratamientos clínicos. Se ha demostrado que las células madre cancerosas son responsables de la resistencia a los medicamentos. Por lo tanto, utilizamos este modelo de esferoides 3D para evaluar la respuesta farmacológica del tallo del cáncer/células que inician. El resultado puede evaluar la eficacia clínica potencial de los medicamentos contra el cáncer.
<ol><li>Administración de medicamentos<ol>
<li>Justo después de cocultacar las células en una placa de 24 pocillos, prepare los fármacos en una dilución en serie en un medio de cultivo para alcanzar 5 veces un rango deseado de concentraciones basadas en experimentos piloto (es decir, 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM y 25 nM). Añadir 0,5 ml de soluciones farmacológicas correspondientes a cada pocal de las células cocultivadas. Trate al grupo de control con medios de cocultura regulares como se mencionó anteriormente.</li>
		<li>NOTA: El inhibidor MEK es soluble en medios de cultivo celular. Por lo tanto, los controles en blanco son 2,5 ml de medio de cultivo celular. Sin embargo, si el fármaco no es soluble en solución acuosa y requiere disolventes como DMSO, entonces los medios de cultivo celular con la misma concentración de DMSO deben aplicarse al grupo de control.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuantificación de la respuesta a los medicamentos mediante el recuento de esferoides<ol>
<li>Observe las células tratadas y las células no tratadas utilizando un microscopio de fluorescencia y fotografíe las células todos los días. Cuantificar la formación de esferoides en los diferentes grupos experimentales y comparar la capacidad de formación de esferoides de los cultivos celulares bajo diferentes concentraciones de fármacos. NOTA: Los esferoides tienden a aparecer de 5 a 7 días después de la cocultura. Los efectos de la droga se harán notables en ese momento.</li>
		<li>Utilice el microscopio de fluorescencia para fotografiar/fotografiar los esferoides y las células de los pozos y luego utilizar el software de imagen para calcular el tamaño promedio de los esferoides y el número de esferoides formados por campo de baja potencia (LPF x 4) en cada grupo de tratamiento a lo largo del tiempo. NOTA: Las células que reciben un tratamiento farmacológico eficaz deben formar menos esferoides o no en comparación con el grupo de control. Esto es una indicación de la eficacia del fármaco probado en la supresión de las células madre cancerosas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Las técnicas de cultivo de células 3D in vitro han sido ampliamente empleadas durante décadas en la investigación del cáncer. En comparación con los sistemas de cultivo celular 2D convencionales, el microambiente 3D recapitula las interacciones células y/o matriz celular y permite imitar las condiciones genuinas observadas en los tejidos tumorales. Sin embargo, un sistema 3D formado sólo por células cancerosas e interacciones homotípicas de células celulares no tiene en cuenta la importancia de las conversaciones cruzadas heterotípicas y puede proporcionar resultados inexactos en la investigación. Recientemente hemos desarrollado un novedoso sistema 3D que combina células cancerosas y CAF para imitar mejor el microambiente tumoral heterogéneo in vivo y su reacción nativa y rígida desmoplástica.
Los fibroblastos son componentes principales del estroma tumoral. CAF participa en la regulación de la progresión tumoral mediante la provocación de factores solubles, ECM/enzimas de remodelación10,11y exosomas. Además, CAF juega un papel en la resistencia a los fármacos y la recurrencia tumoral16,17. Nuestro sistema de esferoides 3D multicelular se puede utilizar para explorar los mecanismos moleculares de las interacciones tumor-stromal y para abordar la resistencia a los fármacos y la recurrencia tumoral. CAF se derivan principalmente de fibroblastos de reposo locales activados y se ha reclutado la médula ósea circulante MSC, que se someten a una diferenciación in situ en CAF en el tejido tumoral37,38,39. En el estudio actual, utilizamos fibroblastos de la piel para crear un modelo de esferoides 3D multicelular. Sin embargo, otro tipo de fibroblastos (por ejemplo, MSC-DF), también funcionan de una manera muy similar a los fibroblastos de la piel para regular la formación de esferoides34de células tumorales. MSC-DF se puede generar a partir de la médula ósea murina MSC, que se enriquece mediante el cultivo de células mononucleares de médula ósea en el medio de cultivo celular MSC durante unos 10 días con cambios medios periódicos cada 3 días. Estos MSC se caracterizan como CD73+/CD105+/Lin-. Para diferenciar MSC en fibroblastos, MSC se cultiva posteriormente con DMEM completo durante 2 semanas adicionales. MSC-DF se caracterizan como SMA+/Vimentin+/FSP-1+ celdas36. MSC-DF puede ser un regulador de tumores importante. Debido a que una fracción de CAF en muchos tipos de tumores sólidos se diferencia de msc circulante reclutado liberado de la médula ósea36,MSC-DF puede ser objetivos de tratamiento prometedores. También son mucho más fácilmente manipulados terapéuticamente o dirigidos antes de ser reclutados a los tejidos tumorales y diferenciados en CAF. Por lo tanto, nuestro modelo 3D ofrece un sistema ideal para estudiar y probar no sólo las células cancerosas, sino también diferentes fracciones o subpoblaciones de CAF. El método para la formación de esferoides 3D es sencillo. Los pasos críticos incluyen el uso de un medio libre de suero para la cocultura, la aplicación de la proporción correcta de fibroblastos a las células tumorales y el uso de las placas de cultivo adecuadas para la cocultura. La limitación potencial de nuestro método es que la formación de esferoides 3D depende en gran medida de la línea celular del cáncer. Nuestro protocolo de formación de esferoides puede requerir la optimización de la relación entre los fibroblastos y las células cancerosas si se emplean diferentes líneas celulares cancerosas. Cabe señalar que utilizamos un modelo de cocultivo de células de melanoma humano y fibroblastos de ratón para la formación de esferoides 3D, ya que es mucho más fácil crear células GOF o LOF en fibroblastos de ratón para el estudio del papel de una molécula o vía de señalización en la regulación de la formación de esferoides tumorales. La capacidad de las células de melanoma humano y los fibroblastos de ratón para formar esferoides indica que las moléculas necesarias para las comunicaciones celulares funcionan entre especies. Recientemente hemos probado la cocultura de los fibroblastos humanos con células de melanoma humano y encontramos que los fibroblastos humanos también pueden regular las células de melanoma humano para formar esferoides 3D.
Empleamos células de melanoma metastásico humano, C8161, en nuestro modelo de esferoides 3D multicelular. También probamos otras células de melanoma humano, por ejemplo, 1205Lu32, que lleva la mutación BRAFV600E, y MeWo, que expresa altos niveles de CDK4/Kit (ATCC HTB-65), y descubrió que también son capaces de formar esferoides 3D en la cocultura. Esto indica que la formación de esferoides 3D por células tumorales es independiente de los tipos de mutaciones oncogénicas. Aunque no hemos probado si otros tipos de células tumorales no melanoma son capaces de formar esferoides 3D con fibroblastos, nuestros hallazgos indican que la formación de esferoides 3D no se limita a una línea celular de melanoma y puede no depender de una línea celular de cáncer específica.
Mostramos dos ejemplos de aplicaciones prácticas de nuestro modelo de esferoides 3D. Un ejemplo fue dilucidar la actividad de la vía de señalización intracelular Notch en la regulación del fenotipo del tallo/célula que inicia el cáncer y la formación de esferoides 3D. Demostramos que la vía de señalización intracelular Notch en CAF es un interruptor molecular que controla el fenotipo de las células madre/iniciadoras del cáncer utilizando este modelo de esferoides 3D. Nuestros hallazgos no sólo descubren un mecanismo molecular subyacente a la regulación estromal del tallo/células de inicio del cáncer y la heterogenicidad del cáncer, sino que también destacan que la vía Notch en CAF es un objetivo crítico para la terapia del melanoma. Este ejemplo indica que nuestro modelo de esferoides 3D es muy útil para estudiar los mecanismos para las interacciones de fibroblastos células cancerosas e identificar posibles dianas terapéuticas. Otro ejemplo fue probar la respuesta farmacológica de las células madre/iniciadoras del cáncer en presencia de CAF. Es bien sabido que la respuesta farmacológica de las células cancerosas, incluyendo el tallo del cáncer/células que inician, varía en la presencia y ausencia de CAF. La presencia de CAF en este sistema in vitro hace que este modelo sea más relevante clínicamente y genera resultados de pruebas más fiables. Además, nuestro sistema de esferoides 3D es versátil. Se puede utilizar para varios propósitos. Por ejemplo, si las células cancerosas resistentes a los medicamentos se emplean en este modelo 3D, se puede cambiar para abordar la resistencia a los medicamentos y tal vez la recurrencia del tumor. También se puede modificar para probar o analizar los medicamentos que se dirigen principalmente a CAF para el tratamiento del cáncer. CAF se han convertido recientemente en objetivos terapéuticos prometedores. Hay ventajas para apuntar a CAF. En primer lugar, en comparación con las células tumorales que son anormales (a menudo con alteraciones genéticas) e inteligentes (ganan fácilmente resistencia a quimioterapias y radioterapias), CAF en el tejido tumoral son células normales y genéticamente más estables, por lo que son menos propensos a desarrollar resistencia a los tratamientos. En segundo lugar, dirigirse a CAF no depende del tipo de mutaciones oncogénicas en las células tumorales. En tercer lugar, apuntar a CAF puede lograr múltiples efectos de golpe a través de un antitutumor dependiente de fibroblastos, anti-angiogénesis y/o la respuesta inmunitaria del cáncer modulador. Nuestro modelo de esferoides 3D es una poderosa herramienta para el descubrimiento de diversos conjuntos de estrategias terapéuticas contra el cáncer.

Los tumores sólidos representan tejidos complejos compuestos de células neoplásicas y una gran variedad de células estromales1,2,3,4. Los fibroblastos estromales, o fibroblastos asociados al cáncer (CAF), son una de las poblaciones prominentes de células estromales en la mayoría de los tipos de tumores sólidos. Están en la regulación del crecimiento tumoral, tallo, metástasis, angiogénesis y resistencia a los medicamentos a través de la producción de factores de crecimiento, citoquinas/quimioquinas, síntesis de ECM y enzimas de remodelación (p. ej., colágeno, fibronectina y metaloproteasas matriciales), liberación de exosomas, e interacción célula-célula heterotípica5,6,7,8, . CAF también participa en la determinación de la metástasis específica de órganos cancerosos mediante la preselección de un subconjunto de clones tumorales de poblaciones de células tumorales heterogéneas en la lesión primaria y el fomento de estos clones seleccionados para ser preparados para la metástasis en un órgano distante específico cuyo microambiente es óptimo para la recolonización de clones seleccionados12. Por otra parte, los fibroblastos y sus factores solubles secretados y ECM participan en la modulación de la angiogénesis tumoral13,14, respuesta inmune antitumoral15, e incluso están involucrados en la resistencia a los fármacos y la recurrencia tumoral16,17.
Los modelos de esferoides tumorales 3D in vitro se han desarrollado y utilizado en la investigación del cáncer como modelo intermedio entre cultivos celulares de cáncer in vitro y modelos de tumores in vivo18,19,20,21. Los modelos de esferoides tumorales 3D han ganado popularidad en la investigación de células madre de cáncer, la investigación preclínica del cáncer y la detección de drogas porque estos modelos reproducen algunas características importantes de tumores reales que están ausentes en las monocapas 2D tradicionales22. Muchos modelos de esferoides tumorales 3D existentes están constituidos únicamente de células tumorales y carecen de la participación de células estromales tumorales. Esto a menudo resulta en esferoides tumorales que tienen suficiente deposición de ECM y ausencia de interacciones células-células heterotípicas. Los esferoides 3D convencionales formados exclusivamente por células cancerosas y la adhesión homotípica de células celulares sólo pueden imitar parcialmente las condiciones in vivo de los tejidos tumorales. Para superar algunas de estas limitaciones, los investigadores han propuesto incorporar múltiples tipos de células estromales en cocultivos 3D y han desarrollado varios modelos de esferoides tumorales 3D heterotipo23,24,25,26,27. Además, los investigadores han empleado matrices 3D exógenas, incluyendo hidrogeles naturales o polímeros sintéticos como polietilenglicol, poli(lactide- co-glicolide) y poli(N-isopropylacrilamida), para incrustar modelos de esferoides monocelulares y multicelulares como polietilenglicol, poli(lactide- co-glicolide) y poli(N-isopropylacrilamida), para incrustar modelos de esferoides monocelulares y multicelulares, creando un entorno de apoyo celular y reproduciendo interacciones célula-matriz28,29,haciendo así que estos sistemas sean más biológicos y relevantes30. Sin embargo, la incorporación de ciertos tipos de células estromales, como las células endoteliales, en los cocultivos 3D produce complejidad adicional para un sistema in vitro y dificulta el estudio de las interacciones células celulares heterotípicas entre dos tipos específicos de células, como las interacciones entre células cancerosas y fibroblastos. Además, las células endoteliales en los tejidos reales no siempre interactúan directamente con las células cancerosas y otras células estromales porque hay una capa de membrana del sótano envuelta fuera de los capilares que impide que las células endoteliales interactúen directamente con las células cancerosas y otras células estromales. En esos modelos de esferoides 3D, las células endoteliales incorporadas no forman realmente vasos sanguíneos, pero interactúan directamente con las células cancerosas y otras células estromales, algo que rara vez ocurre in vivo. Del mismo modo, las matrices exógenas empleadas en algunos de los modelos de esferoides 3D no son idénticas al ECM en tejidos tumorales reales en términos de estructura y composición. Todas estas condiciones artificiales pueden dar lugar a datos engañosos.
Recientemente hemos creado un nuevo modelo de esferoides 3D multicelular compuesto de células tumorales y CAF. En nuestro modelo, la formación de esferoides tumorales 3D está totalmente determinada por CAF. Caf induce y regula el fenotipo de las células madre/iniciadoras tumorales. El ECM producido por CAF es natural y permite que la estructura desmoplástica imite mejor el microambiente tumoral in vivo. Este nuevo modelo 3D puede ser una herramienta útil para la detección de fármacos contra el cáncer y ofrece una plataforma única para estudiar la interacción tumor-stroma, aclarar cómo CAF regula las células madre/iniciadora del cáncer, y explorar la participación de interacciones estromales en la sensibilidad y resistencia de los fármacos contra el cáncer.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-253-CI</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>351147</td><td>Placa tratada sin cultivo de tejidos, 24 pocillos, fondo plano con tapa de baja evaporación</td></tr><tr><td>Alex Fluor 488 cabra anti-ratón IgG</td><td>Life Technology</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 1.5 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa, Tipo 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2674</td><td>500 mg, concentración de 1 mg/mL en DMEM.</td></tr><tr><td>DakoCytomation</td><td>Dako</td><td>x0909</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispasa Grado II</td><td>Roche Diagnostics</td><td>165859</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>VMR</td><td>97068-085</td><td>Premium Grade</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>Gratis para Descarga, no se necesita licencia.</td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom 2016A</td><td>Essen Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de zoom IncuCyte</td><td>Essen Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medio (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP5 Microscopio Confocal Invertido</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MCDB 153 Medio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7403-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Ratón anti &alpha;-SMA (actina de músculo liso), monoclon</td><td>Abcam</td><td>ab18640</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia invertida Olympus IX51</td><td>Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>Olymupus CellSens</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Selleckchem Chemicals</td><td>S1036</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina Solución</td><td>Corning</td><td>30-002- CI</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sodio 7.5%</td><td>Corning</td><td>25-035-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

un novedoso modelo de esferoides de tumor 3d modulado por fibroblastos para el estudio de la interacción tumor-stroma y el descubrimiento de fármacos

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Las interacciones tumor-stroma desempeñan un papel importante en la progresión del cáncer. Los modelos de esferoides tumorales tridimensionales (3D) son el modelo in vitro más utilizado en el estudio de células cancerosas madre/iniciadora, investigación preclínica del cáncer y detección de fármacos. Los modelos de esferoides 3D son superiores al cultivo celular tumoral convencional y reproducen algunos caracteres importantes de tumores sólidos reales. Sin embargo, los esferoides tumorales 3D convencionales se componen exclusivamente de células tumorales. Carecen de la participación de células estromales tumorales y tienen una deposición de matriz extracelular (ECM) insuficiente, por lo que sólo imita parcialmente las condiciones in vivo de los tejidos tumorales. Hemos establecido un nuevo modelo esferoide 3D multicelular compuesto de células tumorales y fibroblastos estromales que imita mejor el microambiente tumoral heterogéneo in vivo y su demoplasia nativa. La formación de esferoides está estrictamente regulada por los fibroblastos estromales tumorales y está determinada por la actividad de ciertas vías cruciales de señalización intracelular (por ejemplo, señalización de muesca) en fibroblastos estromales. En este artículo, presentamos las técnicas para la cocultura de las células tumorales-fibroblastos estromales, imágenes de lapso de tiempo para visualizar las interacciones células celulares, y la microscopía confocal para mostrar las características arquitectónicas 3D de los esferoides. También mostramos dos ejemplos de la aplicación práctica de este modelo de esferoides 3D. Este novedoso modelo de esferoides 3D multicelular ofrece una plataforma útil para estudiar la interacción tumor-stroma, esclarecer cómo los fibroblastos estromales regulan el tallo/células que inician el cáncer, que determinan la progresión del tumor y la agresividad, y explorar la participación de la reacción estromal en la sensibilidad y resistencia de los fármacos contra el cáncer. Esta plataforma también puede ser un modelo in vitro pertinente para el descubrimiento de fármacos.

Desarrollamos un método novedoso para generar esferoides 3D con un sistema de cocultivo celular heterotípico in vitro que imita el microambiente tumoral in vivo. Los fibroblastos se derivan de los fibroblastos de la piel del ratón. Los fibroblastos de la piel se generaron como se describió anteriormente y se caracterizaron como células de SMA+/Vimentin+/FSP-1+. Las células del melanoma metastásico humano (C8161) se cultivaron en medio W489 como se describe32. Para visualizar y distinguir fibroblastos de células tumorales, se pretransdujo fibroblastos y células de melanoma con GFP/lentivirus y DsRed/lentivirus, respectivamente34,36,antes del cocultivo celular.
La Figura 1 muestra un ejemplo de esferoides 3D multicelulares formados por células de melanoma coculturantes y fibroblastos. Las células de melanoma cultivadas en ausencia de fibroblastos no formaban esferoides 3D típicos, aunque algunas células de melanoma forman grupos/agregados 2D con el cultivo extendido. El tamaño medio de los esferoides era de aproximadamente 170-360 m de diámetro (media de 275, SD a 37) el día 5-7. Usando imágenes de lapso de tiempo, observamos que los fibroblastos y las células tumorales interactuaron en la cocultura y comenzaron a formar esferoides 3D alrededor de 36 h de cocultura como se muestra en el video 1. Las imágenes de lapso de tiempo registraron el proceso dinámico de interacción célula-célula y la fase inicial de la formación de esferoides a 4-52 h de cocultivo. El pico de la formación de esferoides 3D se produjo alrededor del día 5-7. Los esferoides 3D formados estaban compuestos de fibroblastos y células de melanoma, donde la mayoría (80%) eran células tumorales. El video 2 muestra el proceso dinámico de las células de melanoma cultivadas individuales (DsRed+/C8161) en la formación de clusters celulares/agregados a partir de 4-52 h en un solo cultivo. La formación de grupos/agregados 2D alcanzó su punto máximo alrededor del día 7-10. Video 3 y Video 4 muestran las estructuras de un esferoide 3D y un cúmulo de células tumorales 2D visualizados por microscopía confocal, respectivamente. El esferoide 3D y los cúmulos de células tumorales 2D fueron examinados por microscopía confocal el día 7 de la cocultivo celular. El video 5 muestra que los esferoides 3D fueron suspendidos en el medio de cultivo y móvil, mientras que el Video 6 muestra que el cluster de células tumorales 2D estaba unido a la placa de cultivo e inmóvil. La suspensión en el medio es una característica de los esferoides 3D que los distingue de los racimos 2D. Cuando el medio en el plato de cultivo celular o pozo se ve perturbado por caer o pipetear suavemente el medio de cultivo, los esferoides 3D suspendidos se mueven, mientras que los cúmulos de células 2D son inmóviles. Sólo unas pocas células muertas son móviles.
La Figura 2A muestra un ejemplo de este modelo 3D que sirve como una plataforma única para estudiar las interacciones tumor-stroma y para dilucidar cómo la actividad intracelular de la vía de señalización Notch1 en CAF regula el tallo/células que inician el cáncer y la formación de esferoides. Dos pares de fibroblastos (Fb) aislados de la piel de Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; ROSALSL-N1IC+/+) frente a su control homólogo (GOFctrl : FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC+/+) ratones y Notch1 de pérdida de función (LOFNotch1: Fsp1.Cre+/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) frente a su control homólogo (LOFctrl : FSP1. Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP+/+) ratones35, respectivamente. Todos los fibroblastos fueron transducidos por GFP/lentivirus y cocultivos con células de melanoma C8161 pretransledcon DsRed/lentivirus. Las imágenes de lapso de tiempo muestran que Fb-GOFNotch1 impidió que las células de melanoma C8161 formaran esferoides 3D en comparación con Fb-GOFctrl durante el primer número 4-52 h de cocultivo celular. Por el contrario, Fb-LOFNotch1 promovió la formación de esferoides 3D por células de melanoma C8161 en comparación con Fb-LOFctrl. La Figura 2B,en la parte superior, muestra imágenes representativas de esferoides 3D formados en el día 7 de cocultivo celular con diferentes fibroblastos que llevan a cabo diversas actividades de la vía Notch. La Figura 2B, abajo, muestra los datos cuantitativos sobre el tamaño promedio de los esferoides 3D formados en el día 7 de la cocultura celular con diferentes fibroblastos que llevan a diversas actividades de la vía Notch.
La Figura 3 muestra un ejemplo de este modelo 3D que se utiliza para probar la respuesta farmacológica del tallo del cáncer/células que inician. Se ha demostrado que las células madre/iniciadoras del cáncer son responsables de la resistencia a los medicamentos y la recurrencia del cáncer. Por lo tanto, evaluar la respuesta de los medicamentos utilizando este modelo 3D puede revelar mejor la eficacia clínica de un fármaco potencial para el tratamiento del cáncer. Las células de melanoma C8161 dependen de la señalización activa de MAPK para el crecimiento e invasión celular. También expresan altos niveles de CDK4/Kit, pero no llevan una mutación BRAF. Para probar la respuesta farmacológica de las células madre/iniciadoras del cáncer hacia el inhibidor MAPK utilizando este modelo 3D, cocultivamos células de melanoma C8161 y fibroblastos en 24 placas de pozos. PD0325901 (ver Tabla de Materiales), un inhibidor MAPK, se preparó en una dilución en serie en una gama de concentraciones de 1 nM, 2.5 nM, 5 nM, 10 nM y 25 nM. El PD0325901 se añadió a los cocultivos celulares cuando se plateaban las mezclas celulares. Las células cocultivadas no tratadas se utilizaron como control. Evaluamos la capacidad de formación de esferoides de los cocultivos celulares bajo diferentes concentraciones de fármacos y la comparamos con el control no tratado. La Figura 3A muestra imágenes representativas de esferoides 3D formados en el día 5 de la cocultura celular bajo diferentes concentraciones de fármacos. La Figura 3B son los datos cuantitativos del tamaño promedio por esferoide y los números de esferoides 3D formados por campo de baja potencia (LPF x 4) en el día 5 de la cocultura celular bajo diferentes concentraciones de fármacos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig01.jpg"> Figura 1: Formación de esferoides 3D y clústeres 2D. (A) Imagen representativa de los esferoides 3D formados por la cocultura de células de melanoma C8161 humanas y fibroblastos de piel de ratón. Los esferoides 3D fueron fotografiados el día 7 de la cocultura de células de melanoma y fibroblastos. Los tamaños medios de los esferoides eran de 170 a 360 m de diámetro (media de 275, SD a 37) el día 5-7. El número medio de esferoides fue de 18 a 26 (20,5 x 3,6) por campo de baja potencia (LPF x4). (B) Imagen representativa de los cúmulos de células tumorales 2D formados por un solo cultivo de células de melanoma C8161. Los cúmulos de células de melanoma 2D fueron fotografiados el día 7 de un solo cultivo de células de melanoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig1alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig02.jpg"> Figura 2: Elucidación del papel de la actividad de la vía de señalización intracelular Notch1 en CAF en la regulación del tallo del cáncer/células que inician utilizando el modelo de esferoides 3D. (A) La actividad de la vía de señalización Intracelular Notch1 en CAF determinó la formación de esferoides por células de melanoma en el cocultivo celular. El video de lapso de tiempo muestra que Fb-GOFNotch1 detuvo la formación de esferoides 3D por las células del melanoma C8161, mientras que Fb-LOFNotch1 promovió la formación de más esferoides 3D por las células de melanoma C8161 durante las primeras 4-52 h de cocultivo celular. (B) Superior: Imágenes representativas de esferoides 3D formados el día 7 de cocultivo celular con diferentes fibroblastos que llevan diversas funciones de la vía Notch. Inferior: Los datos cuantitativos del tamaño promedio (diámetro [m]/esferoide) de los esferoides 3D formados en el día 7 de cocultivo celular con diferentes fibroblastos que llevan a cabo diversas actividades de la vía Notch. La prueba t del estudiante de dos colas se utilizó para el análisis estadístico. Los datos se expresan como media - desviación estándar (SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig2alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60660/60660fig03.jpg"> Figura 3: Evaluación de la respuesta farmacológica de células madre/iniciadoras de cáncer utilizando el modelo de esferoides 3D. (A) Imágenes representativas de esferoides 3D formados el día 5 de cocultivo celular bajo diferentes concentraciones de fármacos. (B) Los datos cuantitativos del tamaño medio (diámetro [m]/esferoide) y el número de esferoides 3D por campo de baja potencia (LPF x 4) formados el día 5 de cocultivo celular bajo diferentes concentraciones de fármacos. Los datos cuantitativos se expresan como media - desviación estándar (SD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60660/60660fig3alarge.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Screenshot 1" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid01.jpg"> Video 1: Proceso dinámico de formación de esferoides 3D en la fase temprana de la cocultura celular. Las imágenes de lapso de tiempo muestran interacciones células-células dinámicas entre fibroblastos y células tumorales en el cocultivo y la formación de esferoides 3D durante la primera cantidad de 4-52 h de cocultivo celular. Las células comenzaron a formar esferoides 3D alrededor de 48 h después del inicio de la cocultura. El pico de la formación de esferoides 3D ocurrió en el día 5-7 (no se muestra aquí). Los esferoides 3D estaban compuestos de fibroblastos y células de melanoma, donde la mayoría (80%) eran células tumorales. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_1.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
<img alt="Screenshot 2" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid02.jpg"> Video 2: Proceso dinámico de formación de grupos 2D en la fase temprana de la cocultura celular. Las imágenes de lapso de tiempo muestran el proceso dinámico de los clústeres 2D formados por células de c8161melanoma en un solo cultivo. La formación de los cúmulos 2D se produjo alrededor del día 7-10. Las imágenes de lapso de tiempo registran el período de 4 a 52 h en un solo cultivo de células de melanoma DsRed+/C8161. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_2.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
<img alt="Screenshot 3" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid03.jpg"> Video 3: Arquitectura y rotación de un esferoide 3D visualizado por microscopía confocal. Arquitectura y rotación de un esferoide 3D. Los láseres verdes y rojos se utilizaron para escanear los esferoides formados el día 7 en la cocultura celular. El área de escaneo se determinó bajo un objetivo 10x. La exploración comienza desde la parte inferior hasta la parte superior del esferoide en un paso z de 1 m. La película de rotación de esferoides 3D se creó utilizando el software Fiji. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_3.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
<img alt="Screenshot 4" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid04.jpg"> Video 4: Arquitectura y rotación de un cúmulo de células tumorales 2D visualizado por microscopía confocal. Arquitectura y rotación de un clúster 2D. Las imágenes confocales de los cúmulos celulares se tomaron en el día 7 del cultivo único de células de melanoma. El área de escaneo se determinó bajo un objetivo 10x. La exploración comienza desde la parte inferior hasta la parte superior del esferoide en un paso z de 1 m. La película de rotación de clúster 2D se creó utilizando el software Fiji. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_4.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
<img alt="Screenshot 5" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid05.jpg"> Video 5: Movimiento de esferoides 3D. Los esferoides 3D fueron suspendidos en el medio de cultivo y no se adhirieron al plato de cultivo/bien. Cuando todavía medio en el cultivo celular bien fue perturbado por el pipeteo suave, los esferoides 3D suspendidos se movieron. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_5.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
<img alt="Screenshot 6" src="/files/ftp_upload/60660/60660vid06.jpg"> Video 6: Firmeza de los cúmulos de células tumorales 2D. El cúmulo de células tumorales 2D estaba anclado a la placa de cultivo e inmóvil a pesar de la perturbación del medio de cultivo. Unas pocas células muertas eran móviles. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60660/Video_6.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>

Se establece un novedoso modelo de esferoides tridimensional basado en la interacción heterotípica de células tumorales y fibroblastos estromales. Aquí, presentamos cocultivo de células tumorales y fibroblastos estromales, imágenes de lapso de tiempo y microscopía confocal para visualizar la formación de esferoides. Este modelo tridimensional ofrece una plataforma pertinente para estudiar las interacciones tumor-stroma y probar las terapias contra el cáncer.

Un novedoso modelo de esferoides de tumor 3D modulado por fibroblastos para el estudio de la interacción tumor-Stroma y el descubrimiento de fármacos

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Hemos desarrollado un nuevo modelo de esferoides 3D que ofrece una plataforma para estudiar las interacciones cáncer-estroma y probar las terapias contra el cáncer. Desde mi punto de vista, este sistema 3D combina células cancerosas en un fibroblasto estroma para imitar mejor las condiciones tumorales genuinas y, por lo tanto, puede ser una herramienta muy poderosa para el descubrimiento de fármacos. Además, este modelo no se limita al estudio del melanoma.Se puede utilizar para investigar otros tipos de cánceres. Hongwei Shao, un científico senior de mi laboratorio. Para el cultivo celular del melanoma humano, arroje las células bajo condiciones convencionales de cultivo celular adherente y complete el medio W489 a 37 grados centígrados en 5% dióxido de carbono.Cuando las células alcancen el 90% de confluencia, divida las celdas en una proporción de uno a cinco. Para el cultivo de fibroblastos de la piel de ratón, lave los gránulos de tejido cosechado en PBS antes de cultivar los especímenes y DMEM complementado con un 10 por ciento de suero bovino fetal, y un uno por ciento de penicilina-estreptomicina en la incubadora de cultivo celular. Divida las celdas en una proporción de uno a dos cuando alcancen una confluencia del 90 por ciento.Antes de establecer las coculturas, los fibroblastos de semillas en un plato de 100 milímetros a una concentración tal que la confluencia celular alcance aproximadamente el 60 por ciento al día siguiente. A la mañana siguiente, sustituya el sobrenadante por una concentración de uno a tres a uno a cinco de GFP a lentivirus diluido de las existencias en un medio de cultivo regular complementado con cuatro microgramos por mililitro de polibreno. Coloque las células en la incubadora de cultivo celular durante seis horas antes de reemplazar el sobrenadante por un medio de cultivo fresco.Después de dos días, observe la señal GFP de las células en un microscopio de fluorescencia. Cuando ambos cultivos celulares han sido trans infectados de forma estable, separe ambos cultivos celulares de 0.25 trypsin-EDTA para recoger las suspensiones de una sola célula por centuvigación. Re suspenda las células en una proporción de dos veces 10 a cuartas células por mililitro de la concentración media de cocultivo y mezcle las células del melanoma y los fibroblastos en una proporción de uno a uno.Luego vea dos mililitros de células a cada pozo de una placa de 24 pozos y triplicar para cada condición y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante cuatro horas para permitir que las células se adhieran a la parte inferior de la placa. Para que el cultivo en solitario de células de melanoma evalúe la formación de grupos celulares 2D, vea dos veces 10 a las cuartas células de melanoma en cada pozo de una placa de 24 pozos y esctice las células durante siete a 10 días en la incubadora de cultivo celular. A continuación, fotografíe las células en un microscopio de fluorescencia invertido de acuerdo con los protocolos de microscopía fluorescente estándar.Si el sistema de imágenes de lapso de tiempo está apagado, enciéndalo al menos una hora antes de la toma de imágenes. Cuando el sistema esté listo, transfiera cuidadosamente la placa de cultivo a la etapa del microscopio y deslice la incubadora y cierre la puerta de forma segura. Abra el software del sistema de imágenes de lapso de tiempo y haga clic en añadir recipiente para seleccionar el tipo de placa y el fabricante para que el microscopio pueda localizar el área de escaneo con precisión.Seleccione una lente objetivo 10 veces y los pozos de interés y establezca los parámetros para el área de escaneo, el tiempo de intervalo entre los escaneos y una hora de inicio y finalización. A continuación, registre la imagen de lapso de tiempo de cuatro a 52 horas. Al final de la grabación de imágenes, utilice el software del sistema de imágenes de lapso de tiempo para recuperar los datos y exportar los vídeos o conjuntos de imágenes recopilados.Para la microscopía confocal de las coculturas, coloque la placa en el escenario de un microscopio de fluorescencia invertido y seleccione los rayos láser rojo y verde. Observe las celdas bajo un objetivo de cinco o 10 veces y seleccione el esferoide para comenzar a escanear. Usando un paso z de un micrón, escanee desde la parte inferior hasta la parte superior del esferoide.A continuación, procese los datos utilizando el software de procesamiento de imágenes adecuado para reconstruir una imagen 3D que se puede rotar y guardar como una película 3D. Aquí, se muestran imágenes de esferoides 3D multicelulares formados por células de melanoma cocultivo y fibroblastos. Las células del melanoma cultivadas en ausencia de fibroblastos no forman esferoides 3D típicos, aunque algunas células del melanoma forman grupos 2D con cultivo prolongado.Usando imágenes de lapso de tiempo, se pueden observar fibroblastos y células tumorales interactuando en la cocultura, comenzando desde esferoides a unas 36 horas. En esta película, se puede observar el proceso dinámico de formación de agregados celulares de melanoma cultivado único de cuatro a 52 horas de cultivo. Aquí, una estructura esferoidosa 3D se puede observar por microscopía confocal después de siete días de cultivo, mientras que en esta película, se puede visualizar un cúmulo de células 2D.Los esferoides 3D permanecen suspendidos en el medio de cultivo y son móviles, mientras que los racimos de células tumorales 2D tienden a adherirse a la placa de cultivo y son inmóviles. Este modelo 3D sirve como una plataforma única para estudiar las interacciones tumoral-estroma. Por ejemplo, para esclarecer cómo la actividad intercelular de la vía de señalización de la vía y los fibroblastos asociados al cáncer regulan el tallo del cáncer e inician la formación de células y esferoides.Además, este modelo se puede utilizar para probar las respuestas de los medicamentos del tallo del cáncer y las células que inician. Aunque este método es simple y directo, tenga cuidado de utilizar la densidad celular correcta y la relación de celda, y utilizar las placas de cultivo adecuadas como se ha demostrado. Este modelo 3D también se puede aplicar para sedar la actividad crucial de la vía de señalización intracelular para determinar los fenotipos de las células madre cancerosas, así como para la detección de compuestos de moléculas pequeñas a los que las células madre cancerosas son altamente sensibles.

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En una amplia variedad de indicaciones de enfermedad, modelos más fisiológico relevantes están siendo programas de descubrimiento de drogas desarrollado e implementado en. El nuevo sistema del modelo aquí descrito muestra tumor cómo tridimensional de esferoides pueden ser cultivados y defendidos en un sistema de base de placa de alto rendimiento 1536-bien buscar nuevos medicamentos de Oncología.

Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas

Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo 3D organotypic melanoma esferoide piel que recapitula la arquitectura y complejidad multicelular de un órgano, tumor en vivo pero al mismo tiempo acomoda sistemático experimental intervención.

Un modelo de piel Organotypic Melanoma 3D esferoide

Tomografía de coherencia óptica (OCT), una tecnología de imagen tridimensional, fue utilizada para monitorear y caracterizar la cinética de crecimiento de esferoides multicelulares tumor. Cuantificación volumétrica precisa de esferoides tumorales usando un voxel contando el enfoque y la detección de tejido libre de etiqueta muerto en esferoides basado en contraste intrínseco atenuación óptica, fueron demostrados.

Longitudinal control morfológico y fisiológico de esferoides tumorales tridimensional mediante tomografía de coherencia óptica

El objetivo de este protocolo es establecer un modelo 3D in vitro para estudiar la diferenciación de los fibroblastos asociados al cáncer (CAC) en un entorno tumoral a granel, que puede abordarse en diferentes sistemas de análisis, como la inmunofluorescencia, la transcripción análisis e imágenes de células salvavidas.

Un modelo de esferoides 3D como un sistema más fisiológico para la diferenciación de fibroblastos asociados al cáncer y estudios de invasión in Vitro

Este protocolo presenta un modelo biomimético 3D con compartimento estromal fibromático que lo acompaña. Preparado con hidrogeles fisiológicamente relevantes en proporciones que imitan las propiedades biofísicas de la matriz extracelular estromal, un mediador activo de interacciones celulares, crecimiento tumoral y metástasis.

Un modelo biomimético para el cáncer de hígado para estudiar las interacciones tumorales-estroma en un entorno 3D con propiedades biofísicos ajustables

Faltan modelos integrales in vitro que recapitulen fielmente la enfermedad humana relevante. El presente estudio presenta la creación y cultivo de esferoides tumorales tridimensionales (3D), una herramienta in vitro fiable para estudiar la interacción tumor-estroma en el carcinoma hepatocelular humano.

Un modelo esferoide tridimensional para investigar la interacción tumor-estroma en el carcinoma hepatocelular

Se prepararon esferoides tumorales 3D multicelulares con células de adenocarcinoma de pulmón, fibroblastos y monocitos, seguidos del aislamiento de fibroblastos asociados al cáncer (CAF) de estos esferoides. Los CAF aislados se compararon con fibroblastos normales para evaluar la salud mitocondrial mediante el estudio del potencial transmembrana mitocondrial, las especies reactivas de oxígeno y las actividades enzimáticas.

Evaluación de la salud mitocondrial en fibroblastos asociados al cáncer aislados de esferoides tumorales de pulmón multicelulares 3D

El presente protocolo describe la generación de modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias y la evaluación de su sensibilidad a los fármacos mediante ensayos de viabilidad celular y exámenes microscópicos.

Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

Este artículo demuestra un método estandarizado para construir esferoides tumorales tridimensionales. También se describe una estrategia para la observación de esferoides y el análisis de aprendizaje profundo basado en imágenes utilizando un sistema automatizado de imágenes.

Generación de esferoides tumorales 3D para estudios de evaluación de fármacos

Aquí, presentamos un método para identificar compuestos que modulan el mecanismo ADCC, un importante mecanismo de destrucción de células cancerosas de anticuerpos antitumorales. El efecto citotóxico de las células NK se mide en esferoides de células de cáncer de mama en presencia de trastuzumab. El análisis de imágenes identifica células asesinas y diana vivas y muertas en esferoides.

Cuantificación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en un modelo de esferoide tumoral: aplicación para el descubrimiento de fármacos

Existe una necesidad crítica de modelos de cáncer en 3D que capturen la diafonía heterocelular para estudiar la metástasis del cáncer. Nuestro estudio presenta la generación de estromas-epiteliales heteromulticelulares en un entorno de andamios y libres de andamios que pueden ser utilizados para estudiar la invasión y las distribuciones espaciales celulares.

Células estromales heteromulticelulares en cultivos 3D sin andamios de células de cáncer epitelial para impulsar la invasión

Aprende a desarrollar esferoides tumorales 3D mediante cocultivo de células de melanoma y fibroblastos para estudiar interacciones tumor-estroma y evaluar respuestas a fármacos. Este modelo imita condiciones in vivo.

Un novedoso modelo de esferoides de tumor 3D modulado por fibroblastos para el estudio de la interacción tumor-Stroma y el descubrimiento de fármacos (Video) | JoVE Journal

Un novedoso modelo de esferoides de tumor 3D modulado por fibroblastos para el estudio de la interacción tumor-Stroma y el descubrimiento de fármacos

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