Name: El método CryoAPEX para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Aprende el método cryoAPEX para localizar proteínas de membrana en células HEK293 con microscopía electrónica, preservando la ultraestructura celular mediante criofijación y sustitución por congelación.

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El protocolo descrito aquí se deriva de una publicación de Sengupta et al., Journal of Cell Science, 132 (6), jcs222315 (2019)48. Este trabajo está respaldado por las subvenciones R01GM10092 (a S.M.) y AI081077 (R.V.S.) de los Institutos Nacionales de Salud, CTSI-106564 (a S.M.) del Instituto de Ciencias Clínicas y Traslacionales de Indiana, y PI4D-209263 (a S.M.) del Instituto de La Universidad de Purdue para la Inmunoinflamación,

1. Cultivo celular y transfección
<ol><li>Células HEK-293T de semilla en un plato de cultivo de tejido de 60 mm de diámetro o más grande y crecen a entre el 60% y el 90% de confluencia en una incubadora de cultivo celular a 37 oC y 5% de CO2.</li>
	<li>Células transfect con plásmidos de expresión de mamíferos etiquetados con APEX2 utilizando reactivo de transfección (ver Tabla de Materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>A 12–15 h después de la transfección, lave las células una vez con solución salina tamponada de fosfato (PBS). Retire las células del plato lavándolo suavemente con PBS. Se puede utilizar un reactivo de disociación, como la tripsina, si es necesario para un tipo de célula determinado. Centrífuga a 500 x g durante 5 min para formar unpellet.
</li>
</ol>2. Fijación química y reacción de peroxidasa
<ol><li>Retire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 2 ml de 2% de glutaraldehído (v/v) en tampón de cadilato sódico de 0,1 M, pH 7,4, a temperatura ambiente. Colocar la muestra sobre hielo e incubar durante 30 min. Pellet la muestra a 500 x g durante 5 min a 4 oC. Desde este punto hasta el paso 2.3.3, mantenga la muestra y las soluciones en hielo, y realice la centrifugación a 4oC. ADVERTENCIA: Tanto el glutaraldehído como el tampón de cacodilato sódico (que contiene arsénico) son tóxicos. Durante la manipulación se deben utilizar los procedimientos de seguridad adecuados y el equipo de protección personal. Las soluciones que contengan glutaraldehído y/o tampón de cacodilato sódico deben eliminarse como residuos químicos peligrosos.</li>
	<li>Lavar el pellet 3x durante 5 min con 2 ml de tampón de cacodilato sódico de 0,1 M. Para estos, así como los lavados posteriores, resuspenda suavemente el pellet celular en la solución requerida, luego centrífuga durante 5 min a 500 x g y retire cuidadosamente y deseche el sobrenadante. Se debe tener cuidado con los repetidos pasos de peletización y resuspensión, con el fin de minimizar la pérdida de muestra.</li>
	<li>Llevar a cabo la reacción de peroxidasa<ol>
<li>Preparar una solución fresca que contenga 1 mg/ml de tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) en tampón de cacodilato sódico de 0,1 M. Disolver el DAB mediante un vórtice vigoroso durante 5-10 min. ADVERTENCIA: DAB es tóxico y un carcinógeno potencial y debe manejarse con procedimientos de seguridad adecuados y equipo de protección personal. Las soluciones que contengan DAB deben tratarse como residuos químicos peligrosos.</li>
		<li>Lavar el pellet resuponiendo en 3 ml de solución DAB seguido de peletización a 500 x g durante 5 min.</li>
		<li>Resuspenda el pellet en una solución DAB de 3 ml a la que se haya añadido peróxido de hidrógeno para lograr una concentración final de 5,88 mM. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. El pellet se vuelve visiblemente de color marrón indicando la presencia del producto de reacción DAB insoluble. NOTA: Es posible que sea necesario optimizar el tiempo de incubación de DAB para cada muestra. El cambio de color se puede monitorear en el microscopio de luz. En nuestra experiencia, una incubación de 15-45 minutos es adecuada para la mayoría de las proteínas. El peróxido de hidrógeno debe obtenerse de una botella recién abierta o de una que se haya mantenido bien sellada después de la apertura.</li>
		<li>Pelet las células, luego lavar 2 veces durante 5 min con tampón de cacodilato sódico de 0,1 M, seguido de un lavado en el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco o medios celulares de elección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspenda el gránulo celular en 500 ml de una solución crioprotectora de DMEM (u otros medios celulares de elección) que contenga un 10% de suero bovino fetal y un 15% de albúmina sérica bovina. Pellet de nuevo, aumentando ligeramente la velocidad de centrífuga de 500 x g si es necesario para lograr un pellet en la solución crio-protecnte gruesa. Deseche la mayoría del sobrenadante, asegurándose de que quede suficiente líquido para que el pellet no se seque. Transporte el pellet celular al instrumento de congelación de alta presión.</li>
</ol>3. Congelación de alta presión
<ol><li>Llene el depósito del congelador de alta presión con nitrógeno líquido (LN2)e inicie la bomba para llenar la cámara de muestra con LN2. ADVERTENCIA: Utilice los procedimientos de seguridad adecuados y el equipo de protección personal cuando trabaje con nitrógeno líquido. NOTA: Estos pasos son específicos del congelador de alta presión Leica EMPACT2.</li>
	<li>Elimina cualquier líquido restante del pellet celular usando la esquina de una toallita de laboratorio o una toalla de papel. Suficiente líquido debe permanecer que el pellet forma una pasta similar en consistencia a la pasta de dientes. Debe ser lo suficientemente delgado como para aspirarse en una punta de pipeteo de 20 l.</li>
	<li>Aspirar 2–3 l del pellet celular y depositarlo en un portador de membrana. Llene el pozo del portador de la membrana completamente, de modo que la tensión superficial cree una ligera cúpula en la parte superior, pero el líquido no se derrama fuera del pozo. No deben estar presentes burbujas de aire.</li>
	<li>Deslice el soporte de membrana en el cartucho y asegúrelo. Coloque el cartucho en la máquina HPF que ha sido preparada y preparada, y presione Iniciar para congelar.</li>
	<li>Inspeccione la temperatura frente a los gráficos de tiempo y presión frente a los gráficos de tiempo para verificar que la presión alcanzó 2100 bar y la temperatura alcanzó -196 oC dentro de 200 ms, y ambos parámetros se mantuvieron estables durante los 600 ms de medición.</li>
	<li>Repita los pasos 3.3 a 3.5 hasta que se haya utilizado el pellet celular o se haya congelado el número deseado de muestras.</li>
	<li>Manteniendo los cartuchos sumergidos en LN2,retire cada portador de membrana de su cartucho, colóquelos en una cápsula de plástico y coloque la cápsula de plástico en un criovial lleno de LN2. NOTA: El protocolo puede estar en pausa aquí. Los crioviales con muestras se pueden almacenar en un LN2 dewar en criocañas o crio-cajas.</li>
</ol>4. Sustitución de congelación
ADVERTENCIA: Utilice los procedimientos de seguridad adecuados y el equipo de protección personal cuando trabaje con nitrógeno líquido. Además, muchos de los productos químicos utilizados en el paso 4 son tóxicos, incluyendo ácido tánico, tetróxido de osmio, y acetato de ursionl. Estos productos químicos deben manipularse de acuerdo con los procedimientos de seguridad adecuados y eliminarse como residuos químicos peligrosos.
<ol><li>Llene la unidad de sustitución de congelación automatizada con LN2. Llevar la temperatura a -90 oC.</li>
	<li>Prepare FS Mix 1 y comience FS.<ol>
<li>En una campana química, prepare una solución de ácido tánico al 0,2% (p/v) y un 5% de agua DI en acetona y alícuota 1 ml por muestra en crioviales. Colóquelo en LN2 para congelarlo.</li>
		<li>Coloque los viales de FS Mix 1 y los crioviales que contienen los pellets de células congeladas en la cámara de muestra de la unidad FS. Transfiera la cápsula interna que contiene el portador de membrana del vial LN2 al vial correspondiente que contenga FS Mix 1.</li>
		<li>Inicie un protocolo FS con su primer paso siendo 24 h a -90 oC. Después de las 24 h, pausar el FS, y lavar las muestras 3x durante 5 min con acetona que se ha enfriado a -90 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar FS Mix 2 y completar FS ADVERTENCIA: El tetróxido de osmio es un producto químico altamente tóxico y oxidante que sólo debe ser manejado por individuos entrenados de acuerdo con los protocolos de seguridad establecidos. Deben seguirse los protocolos para el almacenamiento y eliminación de soluciones que contengan osmio, así como el etiquetado de las áreas de laboratorio en las que se esté utilizando tetróxido de osmio. El tetróxido de osmio debe manipularse en una campana química con equipo de protección personal, incluida la protección de los ojos, una capa de laboratorio que proporciona protección completa del brazo, guantes de nitrilo dobles y un respirador opcional.<ol>
<li>En una campana química, preparar una solución de 1% tetróxido de osmio, 0,2% acetato de urani y 5% de agua DI en acetona. Aliquot 1 ml por muestra en crioviales y colóquelo en LN2 para congelarlo. NOTA: Las soluciones de stock de ácido tánico (10% p/v en acetona), tetróxido de osmio (10% p/v en acetona) y acetato de ursionl (8% p/v en metanol) se pueden preparar y almacenar en crioviales en una dewar LN2 para facilitar la preparación de las mezclas FS.</li>
		<li>Coloque los crioviales con FS Mix 2 en la unidad FS y transfiera las cápsulas del tercer lavado de acetona a los viales de FS Mix 2. Incubar en FS Mix 2 para 72 h a -90 oC, seguido de un calentamiento gradual a 0 oC sobre 12-18 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantener la temperatura a 0 oC y lavar 3 x durante 30 minutos con acetona preenfriada de una botella recién abierta.</li>
</ol>5. Infiltración e incrustación de resina
ADVERTENCIA: La resina utilizada aquí (ver Tabla de Materiales)es tóxica antes de la polimerización, y debe ser manejada con procedimientos de seguridad adecuados y equipo de protección personal. Cualquier resina no polimerizada debe eliminarse como residuo químico peligroso.
<ol><li>Infiltrar las muestras con concentraciones crecientes de resina disuelta en acetona de una botella recién abierta. Preparar una mezcla de componentes de resina A, B y D en un vaso de precipitados de plástico de acuerdo con las instrucciones del fabricante, e incubar muestras en las siguientes concentraciones de resina: 2%, 4% y 8% para 2 h cada una a 0 oC. Incubar en 15%, 30%, 60%, 90%, y 100% resina para 4 h cada una a temperatura ambiente. Incubar durante 4 h en una mezcla de componentes A, B, C y D.</li>
	<li>Coloque los soportes de membrana con el lado del pellet celular en moldes de incrustación planos y llene con resina (A, B, C y D). Las etiquetas de papel para las muestras se pueden añadir a los pozos en este momento.</li>
	<li>Polimerizar en un horno a 60oC durante 24-36 h. NOTA: El protocolo se puede pausar después de la polimerización.</li>
	<li>Retire los bloques del molde y deje enfriar. Para extraer el soporte de membrana, coloque primero la muestra en el portabrocas vertical del ultramicrotome donde se pueda visualizar con aumento. Separe el portador de membrana del bloque mediante una combinación de nitrógeno líquido de dabbing en el portador de membrana para separar el metal del plástico y utilizando una cuchilla de afeitar para astillar la resina alrededor del portador de membrana. Cuando esté separado, levante suavemente el portador de membrana dejando la cúpula de pellet salinada en la cara del bloque.</li>
	<li>Coloque el bloque con el pellet de celda expuesto mirando hacia arriba en un molde de incrustación plana que sea ligeramente más profundo que el primer molde, y llene con resina. Polimerizar a 60oC durante 24–36 h. NOTA: El protocolo se puede pausar después de la polimerización.</li>
</ol>6. Seccionamiento
<ol><li>Recorte el bloque alrededor del pellet celular usando una cuchilla de afeitar. A continuación, coloque el bloque en el mandril de muestra en el brazo de sección de un ultramicrotoma. Usando un cuchillo de vidrio o diamante, recorta el bloque en una forma trapezoidal que rodea el pellet celular.</li>
	<li>Obtener 90 nm secciones ultrafinas del pellet celular utilizando un cuchillo de vidrio o diamante.</li>
	<li>Recoja una cinta de secciones en una rejilla TEM. Las rejillas de ranura de cobre recubiertas de Formvar (1 ranura de 2 mm2) son útiles para las secciones seriales de imagen. Seque la rejilla hinchando el borde en un trozo de papel de filtro y guárdelo en una caja de almacenamiento de rejilla TEM. NOTA: El protocolo se puede pausar después de la sección.</li>
</ol>7. IMÁGenes TEM
<ol><li>Monte la rejilla en el soporte TEM y colóquela en el microscopio. Utilizamos habitualmente un Tecnai T12 a 80 kV para la detección de muestras crioAPEX. Adquirir imágenes de células y estructuras subcelulares de interés con etiquetado APEX2.</li>
	<li>Si lo desea, obtenga un contraste de membrana adicional mediante el uso de plomo después de la tinción. Consulte la Figura 2 para la comparación de muestras no manchadas(Figura 2I–K) y muestras posteriores a la teñida de plomo(Figura 2A–H).<ol>
<li>Flotar rejillas secas de lado de sección hacia abajo en una gota de solución diluida de cloruro de sodio (1,5 mM), 2 veces por 1 min cada una, luego 1x durante 10 min.</li>
		<li>Flotar rejillas en una gota de la solución de plomo de Sato durante 1 min. Lavar flotando en la solución de cloruro de sodio 3x durante 1 min, luego en agua DI 3x durante 1 min. Blot exceso de líquido de las rejillas y almacenar en una caja de rejilla. ADVERTENCIA: El plomo es un producto químico tóxico y debe manipularse con los procedimientos de seguridad adecuados y el equipo de protección personal. Las soluciones que contengan plomo deben eliminarse como residuos químicos peligrosos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Muestras de imagen postmanchadas en el TEM. NOTA: En la preparación de muestras tradicional para TEM, el paso de contraste de plomo se realiza antes de la toma de imágenes TEM. Sin embargo, se recomienda que para las muestras crioAPEX, las imágenes se lleven a cabo primero en muestras no contrastadas. Esto garantiza que la señal de la etiqueta se puede ubicar fácilmente por su fuerte contraste con las estructuras celulares más ligeramente manchadas. Para muchas muestras, no se requerirá ninguna otra tinción; sin embargo, si se desea un contraste de membrana adicional, se puede realizar la post-manchación de plomo (Paso 7.2) y la muestra re-imagen.</li>
</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

El protocolo crioAPEX presentado aquí proporciona un método robusto para caracterizar la localización de proteínas de membrana dentro del entorno celular. El uso de una etiqueta APEX2 codificada genéticamente no sólo proporciona una localización precisa de una proteína de interés, sino que el uso de criofixación y deshidratación a baja temperatura proporciona una excelente preservación y tinción de la ultraestructura celular circundante. Combinados, estos enfoques son una poderosa herramienta para localizar una proteína ...

Los estudios biológicos a menudo incluyen preguntas sobre cómo resolver la localización de proteínas subcelulares dentro de las células y orgánulos. La microscopía de inmunofluorescencia proporciona una vista útil de baja resolución de la localización de proteínas, y los avances recientes en imágenes de superresolución están empujando los límites de la resolución de proteínas etiquetadas fluorescentes1,2,3. Sin embargo, la microscopía electrónica (EM) sigue siendo el estándar de oro para la imagen de la ultraestructura celular de alta resolución, aunque el etiquetado de proteínas es un desafío.
Históricamente, se han utilizado varios métodos EM para abordar cuestiones de localización de proteínas ultraestructurales. Uno de los métodos más utilizados es la microscopía inmunoelectrón (IEM), donde se utilizan anticuerpos primarios específicos de antígeno para detectar la proteína de interés. La señal EM se genera mediante la aplicación de anticuerpos secundarios conjugados con partículas de densidad de electrones, más comúnmente oro coloidal4,5. Alternativamente, los anticuerpos conjugados con enzimas como la peroxidasa de rábano de caballo (HRP) se pueden utilizar para producir un precipitado denso de electrones6,7,8. Existen dos enfoques principales para el IEM, denominados etiquetado de preincrustación y post-inserción. En iEM pre-incrustación, los anticuerpos se introducen directamente en las células, lo que requiere la fijación de la luz y la permeabilización de las células9,10,11. Ambos pasos pueden dañar la ultraestructura12,13. El desarrollo de anticuerpos significativamente más pequeños consistentes en un fragmento de Fab de anticuerpos conjugado con nanooro de 1,4 nm permite utilizar condiciones de permeabilización muy suaves; sin embargo, el nanooro es demasiado pequeño para la visualización directa bajo TEM y requiere pasos de mejora adicionales para ser visible14,15,16. En IEM posterior a la incrustación, los anticuerpos se aplican en secciones delgadas de células que han sido completamente procesadas por fijación, deshidratación e incrustación en resina17. Si bien este enfoque evita el paso de permeabilización, preservar el epítome de interés a lo largo de la preparación de la muestra es un reto18,19,20. El método Tokuyasu de fijación de la luz seguido de congelación, criosección y detección de anticuerpos proporciona una mejor conservación del epítopo21,22. Sin embargo, los requisitos técnicos de la crioultramicrotomía, así como el contraste subóptimo alcanzado en la célula, son desventajas23.
El uso de etiquetas codificadas genéticamente elimina muchas de las dificultades de IEM relacionadas con la detección de la proteína de interés. Una variedad de etiquetas están disponibles, incluyendo HRP, ferritina, ReAsH, miniSOG, y metallotionina24,25,26,27,28,29,30,31,32. Cada uno de ellos tiene ventajas sobre los métodos anteriores, pero cada uno también tiene inconvenientes que impiden el uso generalizado. Estos inconvenientes van desde la inactividad de HRP en el citosol hasta el gran tamaño de la etiqueta de ferritina, la sensibilidad a la luz de ReAsH, y el pequeño tamaño y la falta de compatibilidad con la tinción celular de metalotionina. Recientemente, una proteína derivada de ascorbato peroxidasa ha sido diseñada como una etiqueta EM, llamada APEX233,34. Como peroxidasa, APEX2 puede catalizar la oxidación de 3,3' diaminobenzidina (DAB), produciendo un precipitado que reacciona con tetróxido de osmio para proporcionar contraste LOCAL EM con una difusión mínima de la proteína de interés (menos de 25 nm)33,35. A diferencia de los métodos tradicionales basados en HRP, APEX2 es extremadamente estable y permanece activo en todos los compartimentos celulares33. Las muestras se pueden procesar para TEM utilizando la tinción de muestras EM tradicional y métodos que permiten una buena visualización de las estructuras circundantes33,34,36. Debido a su pequeño tamaño, estabilidad y versatilidad, APEX2 ha surgido como una etiqueta EM con gran potencial.
Muchos de los enfoques mencionados anteriormente no pueden ser o aún no se han combinado con el estado actual de la técnica en la preservación ultraestructural, la criofixación y la sustitución de congelación a baja temperatura. Por lo tanto, sufren de una falta de preservación de la membrana y / o tinción celular para determinar la localización precisa de proteínas. Esto limita necesariamente la resolución e interpretación de los datos que se pueden obtener. La criofixación por congelación a alta presión (HPF) implica la congelación rápida de muestras en nitrógeno líquido a alta presión (2.100 bar), lo que provoca vitrificación en lugar de cristalización de muestras acuosas, preservando así las células en un estado casi nativo37,38,39. HpF es seguido por la sustitución por congelación (FS), una deshidratación a baja temperatura (-90 oC) en acetona combinada con incubación con manchas EM típicas como tetróxido de osmio y acetato de ursionlo. HpF y FS juntos proporcionan una clara ventaja sobre la fijación química tradicional (un proceso más largo que puede conducir a artefactos) y la deshidratación del alcohol a temperatura ambiente o en hielo (que puede conducir a la extracción de lípidos y azúcares), y por lo tanto son deseables para combinar con las mejores etiquetas EM para la detección de proteínas.
Una razón por la que HPF/FS no se ha combinado con el etiquetado APEX2 es que la fijación química ligera es un requisito previo para la reacción de peroxidasa, limitando la difusión del producto de reacción DAB. En los estudios APEX2 realizados hasta ahora, la fijación y la reacción de peroxidasa son seguidas por los métodos tradicionales EM para la tinción y la deshidratación del alcohol33,36. Sin embargo, se ha demostrado que la siguiente fijación química con HPF/FS proporciona una clara ventaja en la preservación sobre la fijación química tradicional y la deshidratación de alcohol por sí sola40. La pérdida de integridad ultraestructural que se ve en las muestras tradicionales de TEM parece estar menos relacionada con la fijación que con la deshidratación, que normalmente se realiza con alcohol a temperatura ambiente o en hielo, y puede conducir a la extracción de lípidos y azúcares40,41. Para desarrollar el método crioAPEX, hipotetizaron que la fijación química y la reacción de peroxidasa, seguidas de HPF y FS, producirían un resultado óptimo en términos de preservación ultraestructural.
Aquí presentamos el protocolo cryoAPEX, que combina el etiquetado APEX2 con los métodos de sustitución criofixation y freeze(Figura 1). Este protocolo sencillo consiste en la transfección de una proteína de interés con la etiqueta APEX2, la fijación química de las células y la reacción de la peroxidasa. HpF y FS se realizan seguidos de la incrustación típica de resina y el corte fino. Las imágenes TEM revelan una excelente preservación de la ultraestructura utilizando este método. Además, se observó la localización subcelular de alta resolución y la distribución espacial de una proteína lumenal endoplasmática (ER). Este método es ampliamente útil para la detección de la localización de proteínas de membrana dentro de las células para el análisis de microscopía electrónica. En nuestras manos, el método ha trabajado con éxito para una variedad de líneas celulares cultivadas en el cultivo de tejidos, incluyendo HEK-293T (riñón embrionario humano), HeLa (cáncer cervical humano), Cos7 (fibroblasto renal de mono verde africano), y BHK (riñón de hámster bebé). Las instrucciones detalladas se describen a continuación utilizando células HEK-293T.

<table><tbody><tr><td>3,3'-diaminobencidina tetraclorhidrato hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5637-1G</td><td></td></tr><tr><td>acetona (destilada en vidrio)</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>vasos de precipitados; Plástico, Desechable 120 cc</td><td>Microscopía Electrónica Sciences</td><td>60952</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Viales de almacenamiento criogénico, 2 mL</td><td>VWR</td><td>82050-168</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, resina epoxi monocomponente A, M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44611-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, monocomponente B, endurecedor 964</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44612-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, monocomponente C, acelerador 960 (DY 060)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44613-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan ACM Fluka, monocomponente D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44614-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Molde de inclusión, estándar plano, 14 mm x 5 mm x 6 mm</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>70901</td><td></td></tr><tr><td>Molde de inclusión, estándar plano, 14 mm x 5 mm x 4 mm</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>70900</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino; Nu-Serum IV Suplemento de Medio de Crecimiento</td><td>Corning</td><td>355104</td><td></td></tr><tr><td>Bote de cuchillos de vidrio, 6,4 mm</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>71008</td><td></td></tr><tr><td>Fabricante de cuchillos de vidrio</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM KMR3</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído 10% Solución acuosa</td> Ciencias <td>de la microscopía electrónica</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293 Celdas</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Congelador de alta presión con sistema de transferencia rápida</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM PACT2</td><td>Producto archivado reemplazado por Leica EM</td></tr><tr><td>ICE Solución de peróxido de hidrógeno al 30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-266-27</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Reactivo de transfección</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Portador de membrana para EM PACT2, 1,5 mm x 0,1 mm</td><td>Mager Scientific</td><td>16707898</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio, cristalino</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 20X, grado ultrapuro</td><td>VWR</td><td>97062-950</td><td></td></tr><tr><td>Cápsulas de plástico para AFS/AFS2, 5 mm x 15 mm</td> Rejillas de ranura <td>Mager Scientific</td><td>16702738</td><td></td></tr><tr><td>, cobre de 2 x 1 mm con película de soporte Formvar</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>FF2010-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de cacodilato de sodio, 0,2 m, pH 7,4</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>102090-962</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio, pellet 500 g (ACS)</td><td>Avantor Macron Fine Chemicals</td><td>7708-10</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tánico</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>21710</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos, poliestireno, estériles, cornisas, 100 mm</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Glass Tiras de cuchillas</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>71012</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo Dihidrato</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

el método cryoapex para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Los eventos celulares clave como la transducción de señales y el tráfico de membranas dependen de la ubicación adecuada de las proteínas dentro de los compartimentos celulares. Entender la localización subcelular precisa de las proteínas es por lo tanto importante para responder a muchas preguntas biológicas. La búsqueda de una etiqueta robusta para identificar la localización de proteínas combinada con la preservación celular adecuada y la tinción ha sido históricamente difícil. Los avances recientes en la microscopía electrónica (EM) han llevado al desarrollo de muchos métodos y estrategias para aumentar la preservación celular y etiquetar las proteínas diana. Una etiqueta genética relativamente nueva basada en peroxidasa, APEX2, es un líder prometedor en etiquetas EM-activas clonables. La preparación de muestras para la microscopía electrónica de transmisión (TEM) también ha avanzado en los últimos años con la llegada de la crioexposición por congelación a alta presión (HPF) y deshidratación y tinción a baja temperatura mediante sustitución por congelación (FS). HPF y FS proporcionan una excelente preservación de la ultraestructura celular para imágenes TEM, solo por sitoma directa de muestras vítreas. Aquí presentamos un protocolo para el método crioAPEX, que combina el uso de la etiqueta APEX2 con HPF y FS. En este protocolo, una proteína de interés se etiqueta con APEX2, seguido de la fijación química y la reacción de peroxidasa. En lugar de la tradicional tinción y deshidratación del alcohol a temperatura ambiente, la muestra se criofija y se somete a deshidratación y tinción a baja temperatura a través de FS. Usando crioAPEX, no sólo se puede identificar una proteína de interés dentro de los compartimentos subcelulares, sino que también se puede resolver información adicional con respecto a su topología dentro de una membrana estructuralmente conservada. Mostramos que este método puede proporcionar una resolución lo suficientemente alta como para descifrar patrones de distribución de proteínas dentro de un lumen de organelo, y para distinguir la compartimentación de una proteína dentro de un orgelle cerca de otros orgánulos sin etiquetar. Además, el crioAPEX es procedimentalmente sencillo y susceptible de células cultivadas en el cultivo de tejidos. No es técnicamente más difícil que los métodos típicos de sustitución de criofixación y congelación. CryoAPEX es ampliamente aplicable para el análisis TEM de cualquier proteína de membrana que pueda ser etiquetada genéticamente.

Con el fin de comparar la preservación ultraestructural utilizando el método crioAPEX con la fijación y deshidratación tradicional, preparamos muestras en las que una membrana de retículo endoplasmático (ERM; ER membrane) fue etiquetado con APEX2 y transfectó en células HEK-293T. ERM-APEX2 localiza la cara citoplasmática del ER y remodela la estructura de ER en estructuras morfológicamente distintas conocidas como ER suave organizado (OSER)34,42,<sup c...

Este protocolo describe el método crioAPEX, en el que una proteína de membrana etiquetada con APEX2 puede ser localizada por microscopía electrónica de transmisión dentro de la ultraestructura celular óptimamente conservada.

El método CryoAPEX para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Este método combina la capacidad de manchar una proteína de membrana al mismo tiempo que preserva la integridad de la membrana y la arquitectura subcelular. Así que es realmente potente para localizar con precisión una proteína asociada a la membrana. La principal ventaja de esta técnica es que combina el uso de una etiqueta robusta clonable genéticamente, APEX2, con métodos de vanguardia en preservación celular para microscopía electrónica, incluyendo criofija y sustitución por congelación.Juntos, permiten una localización precisa de proteínas dentro de una célula bien conservada. Este protocolo se puede utilizar para diseccionar mecanismos mediante los cuales los virus se replican dentro de la célula host. Los virus a menudo secuestrarán las proteínas del huésped durante su esquema de infección.Los virus son los pequeños genomas, que utilizan para replicar dentro de estas células huésped. Recientemente, hemos sido capaces de en datos no publicados, etiquetar estas proteínas utilizando esta tecnología para entender cómo se replican los virus. Esta técnica resultó muy crítica en un estudio colaborativo reciente sobre una toxina bacteriana que causa la descomposición del golgi.Usand

the-cryoapex-method-for-electron-microscopy-analysis-membrane-protein

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Investigación

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Biology

Biología

Fuente: Schönherr, S., et. al. Inmunomarcaje combinado optogenético y réplica de fractura por congelación para examinar la disposición específica de entrada de los receptores de glutamato en la amígdala de ratón. J. vis. exp. (2016)Este vídeo muestra el inmunomarcaje de réplicas fracturadas por congelación de tejido cerebral de ratón para microscopía electrónica. Las réplicas fracturadas y recubiertas se digieren para exponer los receptores. Se añaden anticuerpos primarios y secundarios...

Inmunomarcaje de proteínas de membrana neuronal en un espécimen de tejido cerebral de ratón fracturado por congelación

Para preservar los procesos neuronales para el análisis ultraestructural, se describe un protocolo para la siembra de las neuronas primarias en rejillas de microscopía electrónica, seguido de congelación instantánea, dando muestras en suspensión en una capa de hielo vítreo. Estas muestras pueden ser examinados con un crio-microscopio electrónico para visualizar estructuras a escala nanométrica.

Preparación de las neuronas primarias para la visualización de neuritas en un Estado Frozen-hidratado con Cryo-tomografía electrónica

Aquí describimos un procedimiento para estudiar tejidos vegetales fracturados por congelación. Las muestras de hojas congeladas a alta presión se fracturan por congelación y se recubren de doble capa, lo que produce muestras congeladas hidratadas bien conservadas que se obtienen mediante el microscopio electrónico de criobarrido a grandes aumentos con un daño mínimo del haz.

El estudio de la Organización Supramolecular de membranas fotosintéticas dentro de los tejidos foliares fracturados-Freeze por Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido

Este manuscrito describe un método fácil de usar y criofijación bajo costo para la visualización de células en suspensión por microscopía electrónica de transmisión.

La congelación de inmersión: una herramienta para los estudios ultraestructurales e inmunolocalización de células en suspensión en Microscopía Electrónica de Transmisión

Aquí, proporcionamos una, de bajo costo fácil, y eficiente en el tiempo de protocolo para fijar químicamente el tejido cerebral de los primates con fijador acroleína, lo que permite la conservación a largo plazo que es compatible con inmunohistoquímica pre-inclusión para microscopía electrónica de transmisión.

Preparación de tejido cerebral de primates no humanos para Pre-incrustación de inmunohistoquímica y la microscopía electrónica de

Hemos desarrollado una nueva técnica de microscopía electrónica, "Flash-y-congelación", que permite la visualización de la dinámica de la membrana con ms resolución temporal. Esta técnica combina la estimulación optogenético de neuronas con la congelación de alta presión. Aquí, demostramos los procedimientos y describimos los protocolos en detalle.

Flash-y-Freeze: una técnica novedosa para capturar la dinámica de la membrana con Microscopía Electrónica

Un método de microscopía electrónica correlativos (CLEM) se aplica a estructuras intracelulares inducida por virus de imagen mediante microscopia electrónica (EM) en las células que son previamente seleccionadas por microscopía de luz (LM). EM y LM se combinan como un enfoque de imagen híbrida para lograr una visión integrada de las interacciones virus-huésped.

Correlativos luz microscopia electrónica (CLEM) para el seguimiento y proyección de imagen proteína Viral asociada a estructuras en las células inmovilizadas de Cryo

Aquí se presenta un protocolo para etiquetar proteínas de membrana en células de mamíferos y recubrir la muestra con grafeno para microscopía electrónica de transmisión de barrido en fase líquida. La estabilidad de las muestras contra el daño causado por la radiación también se puede estudiar con este protocolo.

Carcasa de grafeno de células de mamíferos fijas químicamente para microscopía electrónica de fase líquida

Este protocolo demuestra cómo obtener imágenes de muestras criopreservas biológicas utilizando microscopía de iluminación crioestructurada. Demostramos la metodología mediante la obtención de imágenes del citoesqueleto de las células U2OS.

Recopilación de datos microscópicos de iluminación crioestructurada de células preservadas criogénicamente

El objetivo de este protocolo es dirigir la adhesión y el crecimiento celular a áreas específicas de rejillas para criomicroscopía electrónica. Esto se logra mediante la aplicación de una capa antiincrustante que se ablaciona en patrones especificados por el usuario seguido de la deposición de proteínas de matriz extracelular en las áreas modeladas antes de la siembra celular.

Micropatronaje Transmisión Microscopía Microscopía Rejillas para Dirigir el Posicionamiento Celular dentro de los Flujos de Trabajo de Tomografía Crioelectrónica de Celda Entera

Este flujo de trabajo permite la producción de láminas dirigidas a estructuras biológicas marcadas con fluorescencia que son pequeñas (&lt;1 μm de extensión axial) y raras (1 copia por célula) utilizando una plataforma de imágenes criogénicas tricoincidentes. Esta plataforma integra microscopía de fluorescencia, fresado por haz de iones enfocado y microscopía electrónica de barrido en una sola posición focal y permite la microscopía de fluorescencia simultánea durante el fresado.

Flujo de trabajo que utiliza un microscopio criogénico de fluorescencia coincidente, electrones y haz de iones para la molienda dirigida de células

Aprende el método cryoAPEX para localizar proteínas de membrana en células HEK293 con microscopía electrónica, preservando la ultraestructura celular mediante criofijación y sustitución por congelación.

El método CryoAPEX para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas (Video) | JoVE Journal

El método CryoAPEX para el análisis de microscopía electrónica de la localización de proteínas de membrana dentro de células ultraestructuralmente conservadas

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