Modelo de trasplante de tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal (ISWAT) de islotes murinos

El trasplante de islotes es uno de los enfoques más prometedores para tratar la diabetes mellitus tipo I. Y la búsqueda de un sitio adecuado para el trasplante de islotes está en curso. El trasplante de islotes al tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal es un método simple pero eficaz que puede tener implicaciones clínicas.

La extrapolación de este procedimiento a la clínica puede conducir al desarrollo de una cura para los diabéticos de tipo I. Este método podría proporcionar información sobre el trasplante clínico de islotes, ya que se ha determinado que el lingual no es un sitio ideal para el injerto de islotes. Es importante seguir cuidadosamente cada paso del procedimiento, especialmente los pasos clave, como la digestión del páncreas.

La demostración visual ayudará a los investigadores nuevos en la técnica a determinar mejor cómo realizar el aislamiento del islote y la transmutación. Para la cosecha de islotes, primero rocíe el pelaje de un ratón C57 negro de 10 semanas con 75% de etanol, y llene una jeringa de cinco mililitros con solución de colágeno recién preparada. Equipe la jeringa con una aguja de perfusión puntiaguda contundente de calibre 32 y coloque el ratón en la posición supina en una bolsa de hielo.

Utilice tijeras oftálmicas puntiagudas rectas para hacer una abertura transversal en la piel de la zona púbica, y extender la incisión hacia la cabeza del animal. Abra completamente el abdomen a través de una incisión en V desde la región púbica hasta el proceso de xifoide, y mueva el hígado para exponer la vesícula biliar y toda la longitud del conducto biliar común. Luego usa una abrazadera vascular para cerrar la abertura duodenal del conducto biliar común y corta una pequeña abertura en la vesícula biliar.

Cannular el conducto biliar común a través de la abertura con la aguja de perfusión previamente preparada, e inyectar aproximadamente dos mililitros de solución de colagenasa en el páncreas. Cuando se haya entregado toda la colagenasa, utilice dos pares de micro pinzas no invasivas para separar el páncreas perfundido de los intestinos, el estómago y el bazo, y coloque el páncreas en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. Una vez recogidas todas las muestras, añada 100 microlitros de dnasa I por páncreas a los tubos de 50 mililitros y agite vigorosamente cada tubo unas 40 veces durante un período de 10 segundos antes de colocar los tejidos en un baño de agua de 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos con un temblor moderado.

Al final de la incubación, sume un volumen final de 50 mililitros de Stop Solution para detener la digestión. Y centrifuga los tubos a una velocidad de 750 veces G a cuatro grados Celsius antes de detener rápidamente la centrífuga. Después de desechar los sobrenadantes, lave los pellets dos veces en 15 a 25 mililitros de Stop Solution per wash en las mismas condiciones de centrifugación que acabamos de demostrar.

Después del segundo lavado, acarone tres pellets por tubo en nuevos tubos cónicos de 50 mililitros. Y resuspender las células pancreáticas en un volumen total de diez mililitros de Histopaque 1119. A continuación añadir cuidadosamente cinco mililitros de Histopaque 1077 por el lado de cada tubo, seguido de cinco mililitros de HBSS.

Separe las células por centrifugación y utilice una pipeta Pasteur de cinco mililitros para recoger los islotes de la interfaz HBSS Histopaque 1077. Acoja los islotes en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros en un volumen final de 50 mililitros de Stop Solution para centrifugación por pulsos, y deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet en 30 mililitros de solución de parada fresca para una centrifugación de un minuto, y resuspender los islotes en 30 mililitros de medio de cultivo.

Decantar los islotes en un plato de cultivo ligero de 10 centímetros por tubo. Y coloca el plato debajo del microscopio estéreo. Usando puntas de pipeta de carga de gel de 200 microlitros, escoja a mano los islotes esferoidales blancos de la solución.

Colocar los islotes en un plato de cultivo celular no tratado que contenga 10 mililitros de medio de cultivo a medida que se cosechan. Compruebe la pureza de los islotes recogidos a mano mediante tinción de dithizona bajo un microscopio de luz. Y detectar la viabilidad de los islotes por fluoresceína diacetato propidium tinción de yoduro bajo un microscopio florescente.

A continuación, cultivo de los islotes aislados en medio de cultivo fresco a 37 grados Celsius en 95%aire y 5% dióxido de carbono hasta el trasplante. A partir de los días tres y cuatro después de la inducción de la diabetes, perforar la vena caudal de cada macho C57 macho de ocho semanas de edad de edad de seis ratón negros alrededor de las 10:00 a.m. para recoger una muestra de sangre de cada animal receptor.

Utilice un instrumento básico de control de la glucosa en sangre para determinar el nivel de glucosa en sangre no en ayunas de cada ratón y luego agregue la sangre a las tiras reactivas individuales. Cuando un animal ha demostrado un nivel de glucosa en sangre de al menos 20 milimolemols por litro dos días seguidos, pesar y marcar el ratón receptor y confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal en los animales anestesiados. Coloque una alícuota de hidrogel de menos 20 grados Centígrados de almacenamiento sobre hielo para descongelar.

Y transfiera de 450 a 500 equivalentes de islotes por receptor a un tubo centrífuga estéril de 1,5 mililitros que contenga 200 microlitros de medio por tubo en hielo. Frote el área inguinal izquierda del receptor con 75% de etanol y coloque el ratón en la posición supina. Fije las extremidades con cinta quirúrgica y use cortadoras para eliminar el cabello alrededor del sitio quirúrgico.

Frotar el área quirúrgica con yodoforo y hacer una incisión vertical en la piel desinfectada. Identifique la arteria epigástrica inferior y la vena dentro del ISWAT y cree un pequeño bolsillo por encima de los vasos. Sedimentar los islotes por centrifugación y eliminar tanto sobrenadante como sea posible.

Añadir 20 microlitros de hidrogel descongelado a cada tubo, y resuspender suavemente los islotes, teniendo cuidado de evitar burbujas. Cuando se haya obtenido una suspensión homogénea, utilice una punta de pipeta de 200 microlitros para entregar cuidadosamente toda la mezcla de hidrogel de islotes de un tubo en el bolsillo. Cuando el hidrogel se haya solidificado por completo, añadir 20 microlitros de cefalosporina al sitio de trasplante, y cerrar el músculo y la piel con una sutura quirúrgica continua de 5-0.

A continuación, coloque el destinatario en una jaula limpia en una almohadilla térmica con monitoreo hasta la recumbencia completa. Después del procesamiento de islotes murinos como se ha demostrado, los islotes murine aislados serán lo suficientemente puros para el trasplante. Sólo se deben utilizar islotes aislados con una alta viabilidad para el trasplante.

Después de una mezcla exhaustiva de los injertos de islotes con hidrogel, el injerto se puede implantar en el sitio ISWAT. Después de aproximadamente un mes de trasplante en el ISWAT, los injertos de islotes invierten la hiperglucemia mientras que el peso corporal de los ratones receptores aumenta gradualmente. A los 100 días después del trasplante, la extracción de los injertos da como resultado un aumento inmediato en la 10:00 a.m.

nivel de glucosa en sangre no en ayunas. El análisis histológico en este momento.revela que los injertos de islotes han permanecido intactos. Y la tinción inmunofluorescente de insulina y glucagón indica que los islotes trasplantados también funcionan a los 100 días después del trasplante.

Tenga cuidado de no agitar las células del páncreas profundadas demasiado robustas o de lo contrario la capacidad de los islotes obtenidos se verá comprometida. Los islotes aislados se pueden trasplantar bajo la cápsula renal como control para comparar los efectos del trasplante aislado en el tejido adiposo blanco subcutáneo inguinal en el lugar. El procedimiento añadirá el inicio de ensayos clínicos de trasplante de islotes a otros sitios además del hígado.