Detección de especies totales reactivas de oxígeno en células adherentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining
23 de junio de 2020
Aquí, presentamos un protocolo para detectar especies totales de oxígeno reactivo celular (ROS) usando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Este método puede visualizar la localización de ROS celular en células adherentes con un microscopio de fluorescencia y cuantificar la intensidad ROS con un lector de placas de fluorescencia. Este protocolo es simple, eficiente y rentable.
Este método se puede utilizar para analizar especies celulares reactivas de oxígeno en células adherentes con solo un microscopio de fluorescencia, y cuantificar la intensidad reactiva de las especies de oxígeno con lector de placas de fluorescencia. Este protocolo es simple, eficiente y rentable. Comience por sembrar dos veces 10 a la quinta células de cáncer colorrectal HCT116 en DMEM en cada pozo de una placa de 24 pozos.
Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, sustituya el medio de cultivo por 100 sulfatos ferrosos micromolares, o 10 medios micromolares que contengan doxorubicina, e incubar la placa durante otras 24 horas. Prepare la solución DCFH-DA disolviendo 4,85 miligramos de DCFH-DA en un mililitro de DMSO para hacer una solución de stock de 10 milimolar.
Justo antes de añadirlo a los pozos, diluir el caldo con DMEM precalentó para hacer una solución de trabajo de 10 micromolares, y vórtice durante 10 segundos. Para manchar las células, retire el medio que contiene el medicamento y lávelos una vez con DMEM. Agregue 500 microlitros de solución de trabajo DCFH-DA en cada pozo e incubar la placa a 37 grados Celsius durante 30 minutos.
Después de la incubación, retire el DCFH-DA de los pozos, y lávelos dos veces con DMEM, y una vez con PBS. A continuación, agregue 500 microlitros de PBS a cada pozo. Utilice el canal de proteína fluorescente verde en el microscopio de fluorescencia para tomar imágenes representativas de las células.
A continuación, retire el PBS y agregue 200 microlitros de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación a cada pozo. Incubar la placa sobre hielo durante cinco minutos y recoger los lysates celulares en tubos de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos a 21, 130 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
A continuación, transfiera 100 microlitros del sobrenadante a una placa negra de 96 pozos. Utilice un lector de microplacas a una longitud de onda de excitación de 485 nanómetros, y una longitud de onda de emisión de 530 nanómetros, para medir la fluorescencia en cada pozo. A continuación, mida la concentración de proteínas con el ensayo Bradford transfiriendo un microlitro del sobrenadante a una placa clara de 96 pozos con 100 microlitros de solución de ensayo de proteínas.
Utilice las concentraciones de proteínas para normalizar las intensidades de fluorescencia. Las células cancerosas colorrectales HCT116 fueron tratadas con 100 sulfatos ferrosos micromolares, o 10 doxorubicina micromolares, para el estrés oxidativo inductor. Como era de esperar, la fluorescencia verde se incrementó dramáticamente con ambos tratamientos.
Para cuantificar los cambios de intensidad relativa, las células se normalizaron y normalizaron con concentraciones de proteínas. La intensidad relativa de fluorescencia se incrementó significativamente por sulfato ferroso o doxorubicina. Al realizar este procedimiento, es importante hacer que la solución DCFH-DA sea fresca y evitar la exposición a la luz, así como minimizar la perturbación del estado celular, y realizar un lavado extenso de PBS justo antes de tomar la imagen.
Además de la detección del ROS total por este protocolo, específicamente ROS como peróxido se puede realizar.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para detectar especies reactivas de oxígeno (ROS) totales en células mediante el uso de DCFH-DA. El método permite la visualización de la localización de ROS en células adherentes y la cuantificación de la intensidad de ROS.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Análisis de Especies Reactivas de Oxígeno
- Microscopía de Fluorescencia
Antecedentes
- Las especies reactivas de oxígeno desempeñan un papel fundamental en la señalización celular.
- Comprender la localización de las ROS puede proporcionar información sobre los procesos celulares.
- Las técnicas de fluorescencia se utilizan comúnmente para la detección de ROS.
- Este protocolo está diseñado para facilitar su uso y ser rentable.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método confiable para detectar ERO en células adherentes.
- Permitir la visualización y cuantificación de ERO mediante microscopía de fluorescencia.
- Simplificar el proceso para los investigadores en el campo.
Métodos Utilizados
- Siembra de células de cáncer colorrectal HCT116 en una placa de 24 pocillos.
- Incubación de las células con sulfato ferroso o doxorrubicina.
- Preparación de la solución de DCFH-DA para la detección de ERO.
- Uso de microscopía de fluorescencia y lector de placas para el análisis.
Resultados principales
- Visualización exitosa de la localización de ERO en células.
- La cuantificación de la intensidad de ERO demostró la efectividad del método.
- El protocolo resultó ser sencillo y eficiente para los investigadores.
- Enfoque rentable para el análisis de ERO en estudios celulares.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método sencillo para la detección de ERO.
- Puede aplicarse a diversos tipos de células adherentes.
- Estudios futuros pueden basarse en este método para obtener mayores conocimientos sobre los mecanismos celulares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección cuantitativa de especies reactivas de oxígeno (ROS) totales en células adherentes mediante tinción con DCFH-DA proporciona una lectura estandarizada del estrés oxidativo, un factor clave en estudios de modelado de enfermedades y respuesta a fármacos. Este método permite una evaluación robusta del estado redox celular tras perturbaciones químicas o genéticas, apoyando la desestimación mecanicista y la validación de dianas en las fases iniciales del descubrimiento. Su bajo costo y escalabilidad lo hacen adecuado para su integración en cribados de alto rendimiento y flujos de trabajo traslacionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación cuantitativa de las vías de estrés oxidativo en modelos celulares relevantes para la enfermedad.
- Apoya la validación funcional de dianas que modulan el equilibrio redox celular.
- Facilita la desestimación mecanicista al vincular intervenciones con compuestos o genéticas con la producción de ERO.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un ensayo reproducible basado en fluorescencia para la cuantificación de ERO en células adherentes.
- Facilita la estandarización y normalización del ensayo mediante mediciones de concentración de proteína.
- Permite la evaluación confiable del estrés oxidativo inducido por compuestos en campañas de cribado.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relaciona los resultados del estrés oxidativo con modelos de enfermedades para el desarrollo traslacional de biomarcadores.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento in vitro hasta la validación preclínica de agentes que modulan la redox.
- Ofrece valor predictivo para la seguridad y eficacia de compuestos relacionados con mecanismos oxidativos.
Integración de la Secuencia de Trabajo y Flujo de Trabajo
Este protocolo de detección de ERO basado en DCFH-DA se enmarca dentro del continuo desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de compuestos activos, proporcionando una lectura cuantitativa para la modulación del estrés oxidativo en sistemas celulares.
- Biología del Descubrimiento: Permite la verificación de hipótesis sobre dianas y vías relacionadas con el estrés redox.
- Tamizaje: Proporciona mediciones cuantitativas y estandarizadas de ERO para la selección de compuestos.
- Análisis: Integra la normalización de la intensidad de fluorescencia para una comparación robusta de datos.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos de estrés oxidativo in vitro con la validación en modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un ensayo ampliamente aplicable y rentable para diversos tipos celulares y tratamientos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la biología redox y la validación de objetivos.
- Valor operativo: Agiliza la cuantificación de ERO mediante protocolos escalables y reproducibles.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al vincular intervenciones con resultados de estrés oxidativo.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de activos que modulan el estado redox.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de fluorescencia y manejo de lectoras de placas.
- Necesita acceso a infraestructura estándar para cultivo celular y cuantificación de proteínas.
- Exige un manejo cuidadoso del reactivo DCFH-DA para evitar su degradación inducida por la luz.
- La estandarización de los pasos de lavado y normalización es fundamental para la reproducibilidad.
- El protocolo es adaptable a diversas líneas celulares adherentes, aunque puede requerir optimización según el modelo específico.
