Name: Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprende a caracterizar el sistema de secreción tipo IV de Legionella pneumophila mediante imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica. Este protocolo integrado permite visualizar complejos proteicos en bacterias intactas.

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D.C. y C.R.R. fueron apoyados por los NIH (R37AI041699 y R21AI130671). D.P., B.H. y J.L fueron apoyados por los Institutos Nacionales de Salud (R01AI087946 y R01GM107629).

NOTA: Todos los procedimientos relacionados con el crecimiento, manipulación e imágenes de L. pneumophila deben realizarse en un laboratorio de nivel de seguridad biológica 2 de conformidad con las directrices locales.
1. Inserción de sfGFP en el cromosoma L. pneumophila utilizando el intercambio alélico y la estrategia de doble selección(Figura 2, Figura 3)
<ol><li>Clonar en el vector de reemplazo genético pSR47S11 la siguiente secuencia: la 1.000 bp aguas arriba del sitio de interés, luego la secuencia sfGFP, luego la 1.000 bp aguas abajo del sitio de interés(Figura 2). La secuencia sfGFP debe colocarse en el marco de los extremos De N-terminus o C-terminus con un vinculador que contenga de cuatro a ocho aminoácidos. Transforme el vector resultante en E. coli DH5-pir. Más tarde, la raya L. pneumophila (el receptor) para colonias individuales en el agar extracto de carbón-levadura (CYE)12 que contiene 100 g/ml de estreptomicina y crecer durante 5 días a 37 oC(Figura 3).</li>
	<li>Racha L. pneumophila en CYE-agar-estreptomicina y crecer durante 2 días a 37 oC (parche pesado)10. La racha E. coli DH5, transformada con plásmido auxiliar pRK600 (ayudante)13 en el agar LB que contiene 25 g/ml de cloramphenicol. Raya el E. coli DH5-pir (donante) en el agar LB que contiene 50 g/ml de kanamicina.</li>
	<li>Realizar apareamiento triparental: incubar una colonia del ayudante, una colonia del donante y el receptor superponiendo parches de las tres cepas en una placa de agar CYE sin selección e incubando durante 4-8 h a 37oC. A medida que los controles negativos incuban una mezcla de cepa auxiliar+receptor y una mezcla de cepa donante+receptor durante los mismos períodos de tiempo.</li>
	<li>Resuspenda las reacciones de apareamiento en 500 sL de ddH2O. Placa 20 l y 50 l de las reacciones en el agar CYE que contenga 100 g/ml de estreptomicina y 10 g/ml de kanamicina y crezca durante 5 días a 37 oC. Raya cuatro de los clones resultantes en el agar CYE que contiene 100 g/ml de estreptomicina y crece durante 5 días a 37 oC.</li>
	<li>Racha 16 clones en agar CYE que contiene 5% de sacarosa y 100 g/ml de estreptomicina y crece durante 5 días a 37 oC. Luego, la raya 32 de estos clones en el agar CYE que contiene 100 g/ml de estreptomicina y en el agar CYE que contiene 100 g/ml de estreptomicina y 10 g/ml de kanamicina y crece durante 5 días a 37 oC.</li>
</ol>2. Aislamiento de clones que integraron sfGFP en el cromosoma L. pneumophila
<ol><li>Clones de rayas que eran sensibles a la kanamicina en placas CYE-agar-estreptomicina y confirman la inserción de sfGFP en el cromosoma con PCR de colonia. Utilice imprimadores complementarios al gen sfGFP y a la región cromosómica de interés para amplificar la unión de inserción.<ol>
<li>Mezclar 0,5 ml de cada una de las soluciones de imprimación de 10 m y una colonia a un volumen final de 12,5 ml y desnaturalizar durante 10 min a 95 oC. Enfríe en hielo durante 10 min, agregue 12,5 l de solución de mezcla maestra de PCR 2 x y realice un análisis de PCR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultivar manchas pesadas de las colonias aisladas en placas CYE-agar-estreptomicina durante 2 días a 37 oC. Examine los niveles de expresión y la estabilidad de las fusiones sfGFP inmunoblotando con un anticuerpo anti-GFP.</li>
</ol>3. Imagen de celda viva de L. pneumophila con componentes de punto/icm etiquetados fluorescentemente
<ol><li>Preparación de almohadillas de agarosa<ol>
<li>Hacer unos 30 ml de una solución de agarosa 1% baja en agua. Microondas en un matraz de vidrio durante unos 90 s, girando ocasionalmente, hasta que la agarosa se disuelva por completo.</li>
		<li>Coloque dos portaobjetos de vidrio de 22 x 22 x 0,15 mm3 en el borde de un portaobjetos de vidrio de 25 x 75 x 1,1 mm3, uno encima del otro. Apilar dos diapositivas de vidrio más de 22 x 22 x 0,15 mm3 en el otro borde.</li>
		<li>Pipetear aproximadamente 1 ml de la agarosa fundida en el tobogán central entre los dos portaobjetos de vidrio superior, luego coloque otro tobogán de 25 x 75 x 1,1 mm3 en la parte superior de la agarosa fundida. Trate de evitar la formación de burbujas de aire. Enfríe los portaobjetos a 4 oC durante 15 min.</li>
		<li>Usando un bisturí o una cuchilla de afeitar, corte suavemente la almohadilla en cuadrados pequeños, 5 x 5 mm2. Fije un adhesivo de doble cara 17 x 28 x 0.25 mm3 marco en un portacristales de 25 x 75 x 1.1 mm3 y coloque varias almohadillas en la diapositiva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adquisición de imágenes NOTA: Los siguientes pasos se describen para un microscopio que está bajo el control de SlideBook 6.0 y está equipado con iluminadores de estado sólido, cámara monocromática CCD y una lente objetivo de 100x (1.4 apertura numérica). Si es necesario, utilice dispositivos de microscopía alternativos con configuraciones de hardware y software adecuadas que se pueden personalizar de acuerdo con la configuración del protocolo.<ol>
<li>Disolver un parche pesado de L. pneumophila en 1 ml de ddH2O, vórtice e pipeteo 2–3 l de la dilución en las almohadillas. Coloque un cubreobjetos de 50 x 24 x 0,15 mm3 suavemente sobre el marco adhesivo.</li>
		<li>En la ventana de captura ajuste el ND a 180. Ajustar el binning a 2 x 2 y utilizar el canal de 488 nm para exponer la muestra entre 500–1.000 ms. Validar la especificidad de la señal de fluorescencia mediante imágenes sin etiquetar L. pneumophila con los mismos parámetros (Figura 4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cuantificación de la Localización Polar y Dinámica de Componentes De Punto/Icm
NOTA: Los siguientes pasos están diseñados para imágenes con 0,129 m por píxel que se adquirieron con 2 x 2 binning.
<ol><li>Cuantificación de la polaridad para proteínas de fusión sfGFP (Figura 5)<ol>
<li>Ajuste el contraste de la imagen para que las bacterias sean claramente visibles. Utilice la herramienta de región para colocar un rectángulo de 0,25 x 1,3m2 comenzando en el polo y extendiéndose hasta el citoplasma. El rectángulo debe permanecer precisamente dentro de los bordes bacterianos.</li>
		<li>Marca al menos 200 bacterias y usa el botón Región para enmascarar para crear máscaras para las regiones de interés. En Estadísticas de máscara y Alcance de máscara, elija Objeto. A continuación, en Características e intensidad, marque Intensidad media y varianza.</li>
		<li>Exporte los datos y calcule las puntuaciones de polaridad de cada bacteria como la relación entre la varianza y la intensidad media.</li>
		<li>Para aplicaciones de alto rendimiento, utilice un objetivo de fase y una configuración de condensador adecuada para adquirir imágenes con los canales de fase y 488 nm. Asegúrese de elegir los campos de visión donde las bacterias están completamente separadas.</li>
		<li>Ajuste el contraste del canal de fase de la imagen a un nivel donde las bacterias sean claramente visibles. Abra la imagen de canal dual, inicie la ventana Crear máscara de segmento y cambie el canal a fase.</li>
		<li>Ajuste un umbral adecuado y elimine objetos pequeños con el botón Definir objetos. En Refine Mask,elija Remove Edges Objects y, posteriormente, máscaras separadas de bacterias adyacentes entre sí.</li>
		<li>Calcule las puntuaciones de polaridad de la señal en el canal 488 para cada celda como se describió anteriormente en los pasos 4.1.2–4.1.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuantificación de la dinámica de las proteínas de fusión sfGFP (Figura 6) NOTA: Siga las instrucciones de la sección 3 para preparar una muestra para la adquisición de imágenes. La dinámica se define como cambios en la intensidad a lo largo del tiempo y los pasos siguientes están diseñados para períodos de imágenes cortos (es decir, varios minutos). Agregue a la almohadilla los suplementos apropiados si se desean períodos de diagnóstico por imágenes más largos.<ol>
<li>En la ventana Captura de imagen, marque Timelapse, escriba el tiempo de intervalos en el cuadro intervalo e introduzca 2 en el cuadro Puntos de tiempo. Adquirir dos imágenes sucesivas de L. pneumophila expresando la proteína fluorescente de interés.</li>
		<li>Ajuste el contraste de la imagen hasta que las celdas sean claramente visibles. Siga la Figura 6A y las descripciones a continuación para colocar tres máscaras diferentes. Utilice la herramienta de región para colocar un cuadrado de 0,25 x 0,25 m en el centro de al menos 400 celdas.</li>
		<li>Utilice el botón Región para enmascarar para crear una máscara (máscara 1) de los cuadrados de interés. Cree una nueva máscara vacía (máscara 2) y utilice la herramienta píxel o la herramienta poligonal para marcar toda el área de celda de al menos 25 celdas aleatorias, que se utilizarán para calcular el blanqueo de fluorescencia. Cree una nueva máscara vacía (máscara 3) y utilice la herramienta de pincel grande para marcar áreas entre las celdas, que se utilizarán para la resta de fondo.</li>
		<li>En Estadísticas de máscara y Alcance de máscara, elija Objeto para máscara 1 y máscara 2. A continuación, en Características e intensidad, elija Intensidad media y exporte los datos de las dos máscaras. Para la máscara 3, exporte la intensidad media de toda la máscara.</li>
		<li>Calcule el cambio en la intensidad de la fluorescencia para cada objeto en la máscara 1 utilizando las siguientes fórmulas:</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60693/60693eq1v2.jpg">
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60693/60693eq2b.jpg">
donde la máscara 1 es un cuadrado de 0,25 m a 0,25 m colocado en el centro de la célula, la máscara 2 cubre toda la celda, la máscara 3 es el fondo entre las células, t1 es la intensidad media en el primer punto de tiempo, y t2 es la intensidad media en el segundo punto de tiempo.
5. Detección de densidad de masa sfGFP con Cryo-ET
<ol><li>Preparación de muestras, recopilación de datos y reconstrucción<ol>
<li>Cultivar un parche pesado de L. pneumophila expresando una proteína Dot/Icm etiquetada fluorescentemente en placas CYE-agar-streptomicina durante 48 horas a 37 oC. Resuspenda las celdas en ddH2O a OD600 a 0,7. Añadir 5 l de partículas de oro coloidal (BSA Tracer, 10 nm) a 20 l de la suspensión celular.</li>
		<li>Pipetear 5 l de la mezcla de células en una rejilla de carbono perforada recién descargada por el brillo (R 2/1 en malla Cu 200) y dejar reposar durante 1 min. Blot con papel de filtro y congelar en etantano líquido utilizando un aparato de émbolo impulsado por gravedad como se describió anteriormente14,15.</li>
		<li>Imagen de las muestras hidratadas congeladas con un microscopio electrónico de transmisión de 300 kV equipado con una pistola de emisión de campo, un filtro de energía, una placa de fase Volta y un dispositivo de detección directa. Recoge series de inclinación de un solo eje con aumentos de 26.000x y 42.000x, que dan como resultado tamaños de píxeles a un nivel de muestra de 5,4 o píxeles o 3,4 o píxeles, respectivamente.</li>
		<li>Utilice el paquete tomográfico SerialEM para recoger pilas de imágenes a un desenfoque de 0 m, con una gama de ángulos de inclinación entre -60o y +60o con incremento de paso de 3o y dosis acumulada de 60e -/a2,16. Alinee las imágenes de película fraccionadas por dosis en cada pila utilizando MotionCor217. Ensamble pilas corregidas a la deriva utilizando TOMOAUTO14.</li>
		<li>Alinee las pilas corregidas por deriva mediante la alineación dependiente del marcador IMOD18. Reconstruir mamografías con el método SIRT19 para segmentaciones y análisis directo de imágenes y el método WBP20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis de subtomogramas de muestras de fusiones sfGFP<ol>
<li>Utilice el paquete tomográfico I3 (0.9.9.3) para el análisis de subtomogramas14,21,22. NOTA: La alineación continúa de forma iterativa, con cada iteración que consta de tres partes en las que se generan referencias y máscaras de clasificación, los subtomogramas se alinean y clasifican, y los promedios de clase se alinean entre sí.</li>
		<li>Utilice 4 x 4 x 4 subtomogramas binned para una alineación inicial. Combinar partículas que pertenecen a promedios de clase y mostrar la densidad de electrones correspondiente a sfGFP. Después de clasificar partículas con fusiones sfGFP, utilice subtogramas de 2 x 2 x 2 binned para una alineación enfocada de una región de interés (como el complejo ATPase citoplasma Dedo/Icm) para obtener una estructura de alta resolución.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Elaclarar las funciones de los sistemas de secreción bacteriana es clave para una comprensión completa de las interacciones huésped-patógeno. Los sistemas de secreción son máquinas complejas que pueden inyectar proteínas efectoras en las células huésped, y en algunos casos promueven el establecimiento de un nicho subcelular que apoya la replicación bacteriana. El método anterior proporciona nuevas herramientas importantes para el estudio del sistema de secreción de puntos/mic del patógeno bacteriano respiratorio Legi...

Legionella pneumophila (L. pneumophila), el agente etiológico de la enfermedad de los legionarios, habita en los reservorios de agua dulce, donde las bacterias se propagan infectando y replicando dentro de los protozoos acuáticos de natación libre. L. pneumophila causa brotes de enfermedades en los seres humanos cuando se produce la inhalación de bacterias aerosolizadas de fuentes de agua potable. En las células infectadas, la subversión de las vías huésped permite a L. pneumophila retrasar la maduración endocítica de la vacuola en la que reside y promover la biogénesis de un compartimento celular que apoya la replicación bacteriana. Este proceso es impulsado por un sistema especializado de secreción IVB de tipo bacteriano (T4BSS) conocido como Dot/Icm y su repertorio de más de 300 proteínas "efectoras" que se trasladan al citosol huésped durante la infección para facilitar la manipulación de las funciones celulares1,2,3,4,5. Los mutantes que carecen de un aparato funcional Dedo/Cm no entregan efectores en el citosol del huésped, son defectuosos para la replicación intracelular y son avirulentes en modelos animales de enfermedad6,7.
Muchas especies bacterianas han desarrollado máquinas multicomponente extremadamente complejas y dinámicas que son necesarias para los procesos de infección. Otros T4BSS como el sistema Dot/Icm también son esenciales para la replicación intracelular de patógenos bacterianos como Coxiella burnetii y Rickettsiella grylli. Aunque el T4BSS está relacionado evolutivamente con los sistemas prototípicos de tipo IVA, que median la transferencia de ADN y pueden ofrecer un repertorio limitado de proteínas de efectores, el sistema Dot/Icm tiene casi el doble de componentes de la máquina y ofrece una amplia variedad de efectores. Presumiblemente, esta expansión en el número de componentes ha permitido que el aparato Dot/Icm acomode e integre nuevos efectores fácilmente8,9.
Recientemente usamos la tomografía crioelectrónica (crio-ET) para resolver la estructura del aparato Dot/Icm in situ y mostramos que forma un canal de expansión celular que se conecta a un complejo citoplasmático. Análisis posterior reveló que el citosólico ATPase DotB se asocia con el sistema Dot/Icm en el polo celular L. pneumophila a través de interacciones con el citosólico ATPase DotO. Hemos descubierto que DotB muestra un movimiento citosólico en la mayoría de las células bacterianas, lo que indica que este ATPase está presente en una población citosólica dinámica, pero también se asocia con los complejos de puntos polares/icm. Además, DotO forma un conjunto hexamerico de dimers DotO asociados con el complejo de membrana interna, y un hexamer DotB se une a la base de este complejo citoplasmático. El conjunto de la energía DotB-DotO crea un canal citoplasmático que dirige la translocación de sustratos a través del T4SS(Figura 1)10.
A pesar de estos avances recientes, poco se sabe sobre cómo funciona el sistema Dot/Icm y cómo cada proteína se ensambla para formar un aparato activo8. Descubrir los circuitos reguladores del Dot/Icm T4SS es fundamental para entender los mecanismos moleculares de las interacciones huésped-patógeno. Por lo tanto, analizamos cómo utilizar la microscopía de células vivas y crio-ET para detectar y caracterizar los componentes esenciales del sistema L. pneumophila Dot/Icm que están etiquetados con la supercarpeta GFP (sfGFP). Mediante la microscopía cuantitativa de fluorescencia, la localización polar de DotB se definirá en un fondo de tipo salvaje o cuando se elimine el sistema de tipo IV. La microscopía de lapso de tiempo se utilizará para cuantificar las diferencias en la localización y la dinámica entre las ATPases citosólicas Dot/Icm.
La aplicación combinada de dos enfoques complementarios como la imagen en vivo y el crio-ET proporciona una ventaja en comparación con otros sistemas in vitro. Ambos métodos se realizan en celdas intactas y preservan el entorno natural del T4BSS, minimizando así la interrupción de la estructura nativa durante la preparación de la muestra. Debido a que la sobreexpresión de proteínas puede afectar a la estequiometría del aparato de secreción, las fusiones sfGFP se devuelven a través del intercambio alélico al cromosoma Legionella para que cada fusión esté codificada en una sola copia y la expresión sea impulsada por el promotor endógeno. La visualización de fusiones codificadas cromosómicamente permite cuantificar el nivel exacto de proteína expresada en un momento dado definido. Cryo-ET también tiene muchas ventajas para determinar la estructura de los sistemas de secreción. La ventaja más notable es que las muestras crio-ET se componen de células intactas congeladas que preservan complejos nativos en el contexto de la arquitectura celular bacteriana. En consecuencia, el crio-ET puede ser preferible a los enfoques de purificación bioquímica, que extraen complejos de membrana y pueden extraer proteínas periféricas del aparato central o modificar la estructura general. Además, el etiquetado de una proteína de interés con una proteína voluminosa como el sfGFP añade una masa que es detectable por crio-ET y puede ayudar a mapear los diferentes subcomplejos del aparato Punto/Cm en la estructura obtenida por crio-ET.
Este enfoque es una poderosa herramienta para descubrir información estructural sobre complejos multimoleculares que se ensamblan en la membrana celular bacteriana. La interpretación de las estructuras dilucidadas utilizando estas técnicas ayudará al campo a entender cómo funcionan los componentes t4BSS, por qué se requieren tantos componentes para la función, cómo interactúan los componentes dentro del complejo más grande y qué funciones estos subensamblajes de ejecución.

<table><tbody><tr><td>Partículas de oro coloidal de 10 nm</td><td>Aurion</td><td>25486</td><td></td></tr><tr><td>100x Plan Apo objetivo (1.4 NA)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9758</td><td></td></tr><tr><td>Carbón activado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5510</td><td></td></tr><tr><td>Agaroze GPG/LMP, bajo punto de fusión</td><td>AB00981</td><td></td><td>bioanalítico estadounidense</td></tr><tr><td>Bacto agar deshidratado</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cámara digital monocromática CoolSNAP EZ 20 MHz</td><td>Fotometría</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene Frame, 1.7x2.8 cm, 125 y micro; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-0578</td><td></td></tr><tr><td>Holey Rejilla de carbono Malla R 2/1 Cu 200</td><td>Quantifoil</td><td>Q225-CR1</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de hierro (III) nonahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216828</td><td></td></tr><tr><td>K2 Cámara Summit para crio-EM</td><td>GATAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de cubierta de microscopio 22x22 mm</td><td>Fisher Portaobjetos</td> de cubierta de microscopio <td>Scientific 12-542B</td><td></td></tr><tr><td>24x50 mm Portaobjetos</td> de microscopio <td>Fisher Scientific</td><td>12-545K</td> 25x75x1 <td></td></tr><tr><td>mm</td><td>Globe Scientific</td><td>1380</td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 6.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations Motor de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>luz Spectra X</td><td>Lumencor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taq 2X Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0270</td><td></td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>Thermo Fisher Extracto de</td> Levadura Científica <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/icm

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

El sistema de secreción de Punto/Cm de Legionella pneumophila es una nanomáquina compleja del sistema de secreción tipo IV (T4SS) que se localiza en el polo bacteriano y media la entrega de proteínas y sustratos de ADN a las células diana, un proceso que generalmente requiere contacto directo de célula a célula. Recientemente hemos resuelto la estructura del aparato Dot/Icm mediante tomografía crioelectrónica (crio-ET) y hemos demostrado que forma un canal de expansión celular que se conecta a un complejo citoplasmático. La aplicación de dos enfoques complementarios que preservan la estructura nativa de la muestra, la microscopía fluorescente en células vivas y crio-ET, permite la visualización in situ de proteínas y la asimilación de la estequiometría y el momento de producción de cada componente de la máquina en relación con otras subunidades Dot/Icm. Para investigar los requisitos para el posicionamiento polar y caracterizar las características dinámicas asociadas con la biogénesis de la máquina T4SS, hemos fusionado un gen que codifica la proteína fluorescente verde de la supercarpeta a los genes DOT/Icm ATPase en sus posiciones nativas en el cromosoma. El siguiente método integra la microscopía cuantitativa de fluorescencia de células vivas y crio-ET para cuantificar la localización polar, la dinámica y la estructura de estas proteínas en células bacterianas intactas. La aplicación de estos enfoques para el estudio de la Legionella pneumophila T4SS es útil para caracterizar la función del sistema Punto/Icm y se puede adaptar para estudiar una amplia variedad de patógenos bacterianos que utilizan el T4SS u otros tipos de complejos de secreción bacteriana.

La recombinación homóloga con doble selección en dos pasos se utilizó para construir la inserción definida de sfGFP. En el primer paso, se realizó el acoplamiento triparental, donde el plásmido conjugado pRK600 (un plásmido IncP) de la cepa auxiliar E. coli MT616 se movilizó a la cepa del donante E. coli con el vector suicida pSR47S que contiene el flanco sfGFP geneado por las dos regiones homólogas, el origen de la orita de transferencia y el gen de la subselección Bacillus subistitulación. <e...

La imagen de células bacterianas es un enfoque de biología de sistemas emergentes centrado en la definición de procesos estáticos y dinámicos que dictan la función de grandes máquinas macromoleculares. Aquí, la integración de imágenes cuantitativas de células vivas y tomografía crioelectrónica se utiliza para estudiar la arquitectura y las funciones del sistema de secreción de legionela pneumophila tipo IV.

Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Este protocolo es útil para caracterizar las funciones de montaje de las complejidades de la secreción bacteriana y puede conducir a una comprensión fundamental de los mecanismos moleculares que se requieren para las interacciones de patógenos del huésped. Esta técnica integra enfoques complementarios que preservan la estructura nativa de la muestra y permite y ve a la visualización de complejos de proteínas en células bacterianas intactas. Aumenta nuestra comprensión de las relaciones de función estructural de los sistemas de secreción bacteriana.Este método se puede adaptar para estudiar otros tipos de sistemas de secreción u otros complejos celulares en una amplia variedad de especies bacterianas. Comience por hacer almohadillas de agarosa para imágenes de células vivas. Preparar unos 30 ml de solución de agarosa de fusión 1% baja en agua y microondas en un matraz de vidrio durante unos 90 segundos arremolinando ocasionalmente hasta que la agarosa se disuelva por completo.Coloque dos diapositivas de vidrio de 22 por 22 por 0,15 mm en el borde de un deslizable de vidrio de 25 por 75 por 1,1 mm uno encima del otro. A continuación, apile dos diapositivas más más en el otro borde. Pipetear aproximadamente 1 ml de la agarosa fundida en el tobogán central entre los dos portaobjetos de vidrio superior y colocar otro gran portaobjetos en la parte superior de la agarosa fundida asegurándose de evitar la formación de burbujas de aire.Enfríe los portaobjetos a cuatro grados centígrados durante 15 minutos y luego use un bisturí o una cuchilla de afeitar para cortar suavemente la almohadilla en cuadrados pequeños. Fije un marco adhesivo de doble cara en una diapositiva de vidrio de 25 por 75 por 1,1 mm y coloque varias almohadillas en la diapositiva. Disolver un parche pesado de Legionella Pneumophila en 1 ml de agua doble destilada.A continuación, vórtice y pipeta de dos a tres microlitros de la dilución en las almohadillas. Coloque suavemente un resbalón de cubierta de 58 por 24 por 0,15 mm sobre el marco adhesivo. Seleccione celdas para imágenes utilizando iluminación de campo brillante.A continuación, en la ventana de captura del software del microscopio, ajuste el ND a 180 y el binning a dos por dos. Utilice el canal de 488 nanómetros para exponer la muestra durante 500 a 1000 milisegundos y validar la especificidad de la fluorescencia mediante la toma de imágenes de Legionella Pneumophila sin etiquetar con los mismos parámetros. Para cuantificar la polaridad, ajuste el contraste de la imagen para que las bacterias sean claramente visibles.A continuación, haga zoom en la región de interés y utilice la herramienta de región para colocar un rectángulo de 0,25 por 1,3 micrómetros comenzando en el polo y extendiéndose en el citoplasma asegurándose de que el rectángulo permanezca dentro de los bordes bacterianos. Marque al menos 200 bacterias y cree máscaras utilizando el botón región para enmascarar en el menú Analizar. Haga clic en las estadísticas de la máscara y elija el objeto bajo el alcance de la máscara.A continuación, marque la intensidad media y la varianza en características e intensidad. Exporte los datos como un archivo de texto y utilice la aplicación de hoja de cálculo para calcular las puntuaciones de polaridad de cada bacteria como la relación entre la varianza y la intensidad media. Para aplicaciones de alto rendimiento, utilice la microscopía de contraste facial para adquirir imágenes de doble canal.Asegúrese de elegir los campos de vista donde las bacterias están completamente separadas. A continuación, ajuste el contraste del canal facial de la imagen a un nivel en el que las bacterias sean claramente visibles. Abra la imagen de doble canal e inicie la ventana crear máscara de segmento.Ajuste el umbral adecuado y, a continuación, elimine los objetos pequeños haciendo clic en el botón Definir objetos y ajustando el tamaño mínimo a 100 píxeles. En Máscara de refinamiento, seleccione Eliminar objetos de bordes y máscaras separadas de bacterias adyacentes entre sí. Para cuantificar la dinámica de las proteínas de fusión, abra la ventana de captura de imágenes y marque el lapso de tiempo.Introduzca dos en el cuadro Número de puntos de tiempo. Adquiera dos imágenes exitosas de Legionella Pneumophila expresando la proteína fluorescente de interés. Ajuste el contraste de la imagen hasta que las celdas sean claramente visibles.A continuación, utilice la herramienta de región para colocar un cuadrado de 0,25 por 0,25 micrómetros en el medio de al menos 400 celdas. A continuación, utilice el botón región para enmascarar en el menú Analizar para crear una máscara de los cuadrados de interés. Crea una nueva máscara vacía y usa la herramienta de píxeles para marcar toda el área de celda de al menos 25 celdas aleatorias.Cree otra máscara y utilice la herramienta de pincel grande para marcar áreas entre las celdas. Por último, seleccione las estadísticas de máscara y asegúrese de que el objeto está seleccionado en el ámbito de máscara para la máscara uno. En Características e intensidad, elija la intensidad media.Exporte los datos y repita el proceso para la máscara 2. Para la máscara 3, seleccione toda la máscara y exporte la intensidad media. Para preparar la muestra de criotomografía de electrones, haga crecer un parche pesado de Legionella Pneumophila en placas CYE Agrastreptomisum durante 48 horas a 37 grados centígrados.Resuspender las células en agua a un OD 600 de aproximadamente 0.7. A continuación, agregue cinco microlitros de partículas de oro coloidal a 20 microlitros de la suspensión celular. Glow descarga una rejilla de carbono holey y pipeta cinco microlitros de la mezcla celular en ella.Déjalo reposar un minuto. Borre la rejilla con papel de filtro y congénelo en etano líquido utilizando un aparato de émbolo accionado por gravedad. Después de insertar la supercarpeta GFP en el cromosoma Legionella Pneumophila, se realizó una microscopía fluorescente de células vivas para comparar la señal fluorescente con la de la cepa negativa GFP supercarpeta parental.Además, se utilizó una microscopía de campo brillante para examinar la proporción de células con una señal fluorescente específica. Sólo una fracción de las células que produjeron dotB superfolder GFP mostró la localización polar de la proteína de fusión. Al caracterizar la distribución de la señal fluorescente DotB, se encontró que la intensidad de la supercarpeta DotB GFP en los polos era aproximadamente dos veces mayor que en el citosol.Para investigar si la localización polar GFP de la supercarpeta DotB dependía de un sistema de secreción de tipo cuatro completamente ensamblado, se determinaron las puntuaciones de polaridad de la supercarpeta DotB GFP para células individuales en un tipo salvaje, y en un sistema de secreción tipo cuatro mutante. De hecho, el posicionamiento polar de la supercarpeta DotB GFP desapareció cuando se eliminó el sistema Dot/ICM. Los patrones dinámicos indicaban que el DotB ATPase estaba presente en una población citosólica dinámica y fue reclutado para el sistema de secreción de tipo cuatro Punto/ICM localizado polar en una reacción de ensamblaje en etapa tardía.Crio-ET de alto rendimiento se utilizó para visualizar el aparato del sistema de secreción de tipo cuatro intacto en una cepa de Legionella Pneumophila que expresa la supercarpeta DotB GFP. La reconstrucción de la célula reveló varias máquinas Dot/ICM incrustadas en el sobre de la celda. También se determinó el posicionamiento general de DotB y superfolder GFP en relación con la máquina del sistema de secreción de tipo cuatro intacta.Las representaciones superficiales tridimensionales indicaron que la supercarpeta GFP se coloca debajo del hexámero DotB, que se ensambla como un disco en la base del complejo ATPase citoplasmático. Al intentar esta técnica, asegúrese de evaluar la estabilidad de las proteínas de fusión y la funcionalidad del sistema de secreción de etiquetas antes de proceder a la adquisición de imágenes. El modelado y el ajuste pueden ser formas eficaces de analizar los patrones dinámicos y las densidades estructurales, así como para la evaluación de los cambios de conformacionalización o la localización de subunidades en la estructura.Este enfoque puede ayudar a comprender cómo funcionan los distintos componentes secretos del sistema, cómo interactúan dentro del complejo mayor y qué funciones realizan los distintos subensamblajes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Se ilustra aquí el uso de electrones cryotomography (TEC) para estudiar la ultraestructura de las células bacterianas en casi nativo estados, a "macromoleculares" (~ 4 nm) de resolución.

Electron Cryotomography de las células bacterianas

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Luz correlativa y Microscopía Electrónica (CLEM) como una herramienta para visualizar moléculas microinyección y sus objetivos eucariotas subcelulares

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Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm (Video) | JoVE Journal

Aplicación de imágenes de células vivas y tomografía crioelectrónica para resolver las características espaciotemporales del sistema de secreción de puntos de legionela pneumofilia/Icm

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