Name: Análisis del consumo de oxígeno de los islotes pancreáticos no humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprenda a medir el consumo de oxígeno en islotes pancreáticos de primates no humanos para evaluar la función mitocondrial y la salud de las células beta. Esta técnica mejora la reproducibilidad en estudios de diabetes.

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Los autores desean reconocer el Núcleo de Cribado de Alto Rendimiento de Vanderbilt por el uso de sus instalaciones, Agilent Biotechnologies, el Dr. Paul Kievit (Universidad de Salud y Ciencia de Oregón) para los aislamientos de islas de primates no humanos, y Eric Donahue (Universidad DeVanderbilt) para obtener ayuda con la Figura 1. J.M.E. fue apoyado por NIGMS de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio T32GM007347. M.G. fue apoyado por el NIH/NIDDK (R24DK090964-06) y el Departamento de Asuntos de Veteranos (BX003744).

1. Preparación de microplacas y cartuchos de sensores el día antes de ejecutar el ensayo
Los islotes fueron aislados de macacos japoneses de tres años como se describió anteriormente13. Este método es muy similar al utilizado para aislar los islotes humanos de los donantes de cadáveres, pero difiere de los ratones, en los que la páncreata a menudo se infla con solución de colagenasa mientras el animal está bajo sedación y antes de la extracción de órganos. La recuperación de islos se llevó a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro Nacional de Investigación de Primates de Oregón (ONPRC) y la Universidad de Salud y Ciencia de Oregón y fueron aprobados por la IACUC de la ONPRC. La ONPRC se atiene a la Ley y Reglamentos de Bienestar Animal aplicados por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) y la Política del Servicio de Salud Pública sobre El Cuidado y Uso De Animales de Laboratorio de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud.
<ol><li>Preparación de la microplaca de esferoides<ol>
<li>Preparar 3 ml de una solución de 0,1 M de bicarbonato sódico. El filtro esteriliza la solución. Utilizamos un filtro de 0,45 m(Tabla de materiales).</li>
		<li>En una campana de cultivo celular, añadir 200 l de adhesivo celular y tisular(Tabla de materiales)a 2,8 ml de bicarbonato sódico de 0,1 M. A continuación, agregue 20 l de esta solución a la parte inferior de cada pocal de la microplaca esferoide de 96pocillos (Tabla de materiales). Asegúrese de que las burbujas de aire se eliminan de la punta del pipeteo y sólo la parte inferior de la placa está cubierta. El recubrimiento de la microplaca evita que los islotes se muevan hacia arriba por los lados de los pozos cuando se añaden medicamentos y se mezclan en el pozo durante el ensayo. NOTA: Sólo es necesario recubrir tantos pozos como se utilizará para los islotes cuando se ejecute el ensayo. Si sólo se utilizan unos pocos pozos, la solución adhesiva de la célula se puede reducir adecuadamente. El adhesivo celular utilizado en el ensayo es una solución proteica formulada extraída del mejillón marino. Alternativamente, los pozos de microplacas se pueden recubrir con 20 sL de poli-D-lisina de 100 g/ml.</li>
		<li>Incubar la placa en una incubadora de 37oC, no CO2 durante una hora.</li>
		<li>En un entorno estéril, aspirar la solución adhesiva celular de la placa. Lave cada pocal dos veces con 400 oC de agua estéril de 37 oC utilizando un pipeta multicanal. Dejar secar al aire.</li>
		<li>Después de 30-40 minutos, cubra la placa y guárdela durante la noche a 4oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hidratación del cartucho del sensor<ol>
<li>En un entorno estéril, abra el paquete del cartucho del sensor(Tabla de materiales)y retire el contenido. Coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de servicios públicos.</li>
		<li>Llene cada pocal de la placa de servicios con 200 ml de agua estéril y baje el cartucho del sensor de nuevo en la placa de servicios públicos. Coloque el cartucho del sensor montado y la placa de servicio en una incubadora de 37 oC que no sea CO2 durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación del calibrador<ol>
<li>Aliquot 25 mL de calibrador(Tabla de Materiales)en un tubo cónico de 50 ml. Colocar el tubo en una incubadora de 37oC, que no sea CO2 durante la noche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Protocolo para la preparación de medios, carga de islotes y carga de cartucho de sensor el día del ensayo
<ol><li>Preparación de medios<ol>
<li>A 48,5 ml de soporte base (DMEM mínimo, ver Tabla de materiales), añadir 500 ml cada uno de 1 mM de piruvato sódico y 2 mM de glutamina. Además, añadir 496 ml de 200 mg/ml de glucosa (la concentración final de glucosa en los medios es de 5,5 mM). NOTA: La concentración basal de glucosa se mantuvo constante para estos experimentos. Sin embargo, la glucosa también se puede utilizar para estimular la respiración además de las manipulaciones farmacológicas descritas soplar10.</li>
		<li>Confirme que el pH es 7,4 +/- 0,1, ajustando si es necesario.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del cartucho del sensor<ol>
<li>Saque el cartucho del sensor de la incubadora, retire la tapa del cartucho del sensor y vierta el agua de los pozos. Coloque 200 ml de calibrador precalentado en cada pocil y reemplace la tapa del cartucho del sensor.</li>
		<li>Vuelva a colocar el cartucho del sensor en la incubadora durante aproximadamente 1 hora (hasta que sea necesario).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de medicamentos para el ensayo de estrés mitocondrial<ol>
<li>Abra el kit de prueba de esfuerzo(Tabla de materiales)y elimine el contenido. Inventa stock y soluciones de trabajo para Oligomicina, Carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) y Rotenone/Antimycin A (AA) de la siguiente manera.<ol>
<li>Oligomicina: añadir 630 l de medios montados al tubo para hacer un stock de 100 m. A continuación, diluir a 45 m con medios para obtener la concentración de puerto (la concentración final del pozo después de la inyección será de 4,5 m)</li>
			<li>FCCP: añadir 720 l de medios montados al tubo para hacer un stock de 100 m. Diluir a 10 m con medios para obtener la concentración de puertos (la concentración final del pozo será de 1 M) NOTA: BSA y/o FBS no deben añadirse a los medios, ya que esto puede afectar a la acción de los desacopladores mitocondriales14.</li>
			<li>Rotenona/AA: añadir 540 l de medios montados al tubo para hacer 50 m de stock. Diluir a 25 m con medios para obtener la concentración de puertos (la concentración final del pozo será de 2,5 m) NOTA: Las concentraciones anteriores han producido resultados consistentes en nuestras manos. El FCCP adicional no dio lugar a un mayor aumento de la respiración. Sin embargo, las concentraciones de fármacos pueden necesitar ser ajustadas dependiendo del tamaño de los islotes, y especialmente con islotes de diferentes especies o esferoides no islotes. Como referencia, el diámetro medio de un isla de primate no humano es de aproximadamente 150 m15.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de placa esferoide y transferencia de islotes<ol>
<li>Pisera a mano en un plato de cultivo celular de 60 mm x 15 mm que contiene medios ensamblados para obtener una pureza cercana al 100%. NOTA: Los islotes deben aparecer redondeados, con una periferia claramente definida, y parecen más densos que los contaminantes del tejido exocrina. Evite los islotes que aparecen dañados o deshilachados. En este experimento, el tamaño del islote no se midió directamente, aunque intentamos seleccionar islotes de tamaño aproximadamente equivalente para cada pozo y muestra.</li>
		<li>Cargue cada pozo de microplaca esferoide con 175 ml de soporte ensamblado utilizando una pipeta multicanal.</li>
		<li>Usando una pipeta P20 establecida en 15 l, aspirar 15 islotes de la placa de cultivo celular. Los islotes deben ser visibles en la punta de la pipeta a simple vista.</li>
		<li>Para transferir islotes a microplaca esferoide, baje la punta de la pipeta hasta la parte inferior del pozo, apenas levante y pipetee lentamente un volumen muy pequeño (5 l). Confirme que todos los islotes han salido de la punta de la pipeta. Cada pozo debe recibir 15 islotes. Ocasionalmente revise la microplaca esferoide bajo el microscopio para verificar que los islotes están en la parte inferior de cada pozo en lugar de pegados a los lados. NOTA: Evite cargar los pozos de esquina con islotes. El oxígeno y el flujo de pH del plástico pueden ocurrir durante el ensayo, y esto se exacerba en los cuatro pozos de esquina.</li>
		<li>Una vez que todos los islotes han sido transferidos a la microplaca esferoide, incubar la microplaca en una incubadora de 37 oC, no CO2 mientras completa los pasos a continuación.</li>
	</ol></li>
	<li>Carga del cartucho del sensor y ejecución del ensayo<ol>
<li>Retire el cartucho del sensor de la incubadora. Los puertos A-C para cada pozo deben cargarse con medicamentos o medios. Los pozos que contienen islotes y los cuatro pozos de esquina deben estar cargados con droga. Los pozos que no son de esquina sin islotes deben cargarse con medios. El puerto D se puede dejar vacío. Puerto de carga A (arriba a la izquierda de cada sensor) con 20 ml de oligomicina o medios. Cargue el puerto B (arriba a la derecha) con 22 sl de FCCP o de medios. Puerto de carga C (abajo a la izquierda) con 25 s de Rotenone/AA o medios.</li>
		<li>Programe un ensayo analizador de flujo extracelular para un período de respiración basal de 30 minutos (5 ciclos de mezcla de 3 minutos, medida de 3 minutos), período de medición de oligomicina de 42 minutos (7 ciclos de mezcla de 3 minutos, medida de 3 minutos), 30 minutos FCCP (5 ciclos de mezcla de 3 minutos, 3 minutos de medida) y 30 minutos Rotenone/AA (5 ciclos de mezcla de 3 minutos, 3 minutos de medida).</li>
		<li>Ejecute el ensayo y siga las instrucciones en pantalla para calibrar el sensor e insertar la microplaca.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Mulder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcribing+%CE%B2-cell+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcribing β-cell mitochondria in health and disease.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).</li>
<li>Maechler, P., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+signals+in+glucose-stimulated+insulin+secretion+in+the+beta+cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell.</a> The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).</li>
<li>Curry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+Potentiation+of+Insulin+Secretion+by+the+Perfused+Rat+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas.</a> Diabetes. 19 (6), 420(1970).</li>
<li>Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagon+Increases+Insulin+Levels+by+Stimulating+Insulin+Secretion+Without+Effect+on+Insulin+Clearance+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice.</a> Peptides. 88, 74-79 (2017).</li>
<li>Vergari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+inhibits+glucagon+release+by+SGLT2-induced+stimulation+of+somatostatin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion.</a> Nature Communications. 10 (1), 139(2019).</li>
<li>Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+glucagon+secretion%3A+the+%CE%B2%2F%CE%B1%2F%CE%B4+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology--Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model.</a> American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).</li>
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<li>Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019).</li>
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<li>Taddeo, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+islet+respirometry+reveals+functional+diversity+within+the+islet+population+of+mice+and+human+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors.</a> Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).</li>
<li>Conrad, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAFB+transcription+factor+impacts+islet+alpha-cell+function+in+rodents+and+represents+a+unique+signature+of+primate+islet+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology--Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells.</a> American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).</li>
<li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+islet+plasticity%3A+interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li>
<li>Elsakr, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Western-style+diet+affects+offspring+islet+composition+and+function+in+a+non-human+primate+model+of+maternal+over-nutrition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition.</a> Molecular Metabolism. , (2019).</li>
<li>Soutar, M. P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FBS%2FBSA+media+concentration+determines+CCCP%27s+ability+to+depolarize+mitochondria+and+activate+PINK1-PRKN+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy.</a> Autophagy. , 1-10 (2019).</li>
<li>Hirshberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Islet+Transplantation+Using+the+Nonhuman+Primate+%28Rhesus%29+Model+Predicts+That+the+Portal+Vein+Is+Superior+to+the+Celiac+Artery+as+the+Islet+Infusion+Site%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site.</a> Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Papas, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+Oxygen+Consumption+Rate+%28OCR%29+Dose+Predicts+Insulin+Independence+in+Clinical+Islet+Autotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation.</a> PLoS One. 10 (8), e0134428(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El estudio del consumo de oxígeno de los islotes se ha visto obstaculizado anteriormente por la forma esférica de los islotes, su falta de adherencia a las superficies de cultivo y el número de islotes requeridos por pozo. En este protocolo, destacamos la eficacia de la microplaca esferoide de 96 pocillos para medir el consumo de oxígeno de los islotes en un pequeño número de islotes y demostramos una técnica para manipular y cargar islotes que es técnicamente factible y produce Resultados.
Pa...

Con el fin de mantener los niveles normales de glucosa en sangre, la célula pancreática debe sentir elevaciones en la glucosa y secretar insulina en consecuencia. El acoplamiento de la secreción de insulina con los niveles de glucosa está directamente relacionado con el metabolismo de la glucosa y la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa mitocondrial. Por lo tanto, las mitocondrias desempeñan un papel crítico en el acoplamiento estímulo-secreción1. La evaluación de la función mitocondrial de las células puede revelar defectos que conducen a una secreción de insulina deteriorada. La secreción de glucagón por células pancreáticas también está estrechamente ligada a la función mitocondrial2. Aunque las líneas celulares de islotes inmortalizadas han demostrado ser útiles para algunos tipos de ensayos, la fisiología de estas células no recapitula con precisión la función de islotes enteros, como lo ilustra la potenciación de la secreción de insulina por glucagón3,4 y la inhibición de la secreción de glucagón por insulina/somatostatina5,6 en islotes intactos. Esto demuestra la necesidad de medir el consumo de oxígeno utilizando islotes enteros e intactos.
Las técnicas para la medición de la respirometría de células de islotes han evolucionado con el tiempo, desde el uso de colorantes fluorescentes sensibles al oxígeno7 hasta sensores de estado sólido que miden directamente el consumo de oxígeno8. Inicialmente diseñadopara células monocapa y adherentes, los sistemas de placas de cultivo celular comúnmente utilizados han demostrado ser ineficaces para los islotes pancreáticos. Como los islotes no se adhieren naturalmente a los pozos, son propensos a ser empujados a la periferia del cultivo bien resultando en una medición inexacta del consumo de oxígeno9. Para combatir este problema, se desarrollaron placas especializadas de 24 pocillos con una depresión central que podría contener islotes9. Sin embargo, el sistema de placas de 24 pocillos estaba limitado por el gran número de islotes requeridos (50-80 por pozo) y el número de condiciones que se podían probar simultáneamente10. El reciente desarrollo de microplacas de 96 pocillos diseñadas específicamente para el análisis de flujo extracelular en esferoides ha superado estas barreras, permitiendo la medición de la respirometría de islotes con 20 o menos islotes por pozo10.
Aquí, demostramos el uso de este sistema para medir el consumo de oxígeno en los islotes del macaco japonés (Macaca fuscata), un modelo animal con biología de islotes similar a los humanos11,12. En este protocolo, se analizan 15 islotes macacos por pozo. En nuestras manos, 15 islotes por pozo produjeron un mayor consumo de oxígeno basal que menos islotes, con activación robusta y represión de la respiración en respuesta a la manipulación farmacológica. Destacamos los pasos para prepararnos para el ensayo, un método eficaz para la carga constante de islotes en el centro de cada pozo, y desafíos comunes al realizar este ensayo.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultivo celular, 60 mm X 15 mm estilo</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak Adhesivo para células y tejidos</td><td>Corning</td><td>354240</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico, 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa anhidra</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td>Para solución de glucosa, 200 mg/ml, fileteada estéril</td></tr><tr><td>Depósitos desechables (estériles), 25 ML</td><td>Vistalab</td><td>3054-1033</td><td>para la carga de pipeta multicanal</td></tr><tr><td>EZFlow Sterile 0.45 &mu; m PES Filtro de jeringa, 13 mm</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>371-3115-OEM</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM (100x)</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta multicanal</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>94410810</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta multicanal, 15-1250 &mu; L ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>4672100BT</td><td>Pipetas</td></tr><tr><td>P20, P200 y P1000</td><td>recomendadas Sonda</td><td>de pH 2231000602</td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td></td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2210-01</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta, 20 &mu; L, 200 &mu; L, 1000 &mu; L</td><td>Olympus</td><td>24-404, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Media</td><td>Agilent</td><td>103334-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit</td><td>Agilent</td><td>103015-100</td><td>Incluye oligomicina, FCCP y rotenona/antimicina A</td></tr><tr><td>Analizador Seahorse XFe96</td><td>Agilent</td><td>S7800B</td><td>Incluye estación de preparación con 37 &deg; C incubadora sin CO2</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini</td><td>Agilent</td><td>102905-100</td><td>Incluye cartucho de sensor, microplaca de esferoide y calibrante</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>100 mM (100x)</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus</td><td>SZX9</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa (estéril), 5 mL</td><td>BD</td><td>309603</td><td>Para filtración estéril</td></tr><tr><td>Agua (estéril)</td><td>Sigma</td><td>W3500-500mL</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis del consumo de oxígeno de los islotes pancreáticos no humanos

Analysis of Non-Human Primate Pancreatic Islet Oxygen Consumption

La medición del consumo de oxígeno en grupos esferoides de células, como islotes pancreáticos ex vivo, ha sido históricamente difícil. Demostramos la medición del consumo de oxígeno de los islos utilizando una microplaca de 96 pocillos diseñada para la medición del consumo de oxígeno en esferoides. En este ensayo, las microplacas esferoides están recubiertas con un adhesivo para células y tejidos el día anterior al ensayo. Utilizamos un pequeño volumen de solución adhesiva para fomentar la adherencia del isla solo a la parte inferior del pozo. El día del ensayo, 15 islotes se cargan directamente en la base de cada pozo utilizando una técnica que garantiza un posicionamiento óptimo de los islotes y una medición precisa del consumo de oxígeno. Varios aspectos de la respiración mitocondrial son sondeados farmacológicamente en islotes de primates no humanos, incluyendo respiración dependiente de ATP, respiración máxima y fuga de protones. Este método permite resultados consistentes y reproducibles utilizando sólo un pequeño número de islotes por pozo. Teóricamente se puede aplicar a cualquier esferoides cultivados de tamaño similar.

Para cargar islotes en microplacas, se deben aspirar 15 islotes en 15 ml de medios, como se muestra en la Figura 1A. Los islotes se asentarán naturalmente hacia la parte inferior de la punta del pipeteo en pocos segundos. Luego, la punta de la tubería se baja a la parte inferior del pozo. La punta se levanta ligeramente, y un pequeño volumen (alrededor de 5 ollos) se pipetea junto con los islotes. Esta técnica da como resultado la colocación ...

Este protocolo demuestra la medición precisa y reproducible del consumo de oxígeno en islotes pancreáticos de primates no humanos. Las técnicas de carga de islos y el recubrimiento de la microplaca proporcionan un marco para la medición eficiente de la respiración en otros tipos de esferoides cultivados.

Análisis del consumo de oxígeno de los islotes pancreáticos no humanos

The measurement of oxygen consumption in spheroid clusters of cells, such as ex vivo pancreatic islets, has historically been challenging. We demonstrate ...

Este método permite la cuantificación del consumo de oxígeno a partir de un pequeño número de islotes de especies relevantes, como primates no humanos y humanos, lo que permite evaluar la función mitocondrial. Esta técnica se puede realizar con un pequeño número de islotes primarios, aumentando las réplicas técnicas, permitiendo la prueba de múltiples condiciones, y mejorando el rigor y la reproducibilidad del ensayo. Esta técnica evalúa la salud mitocondrial, un importante determinante de la función de los islotes y la secreción de insulina que a menudo se deteriora en la diabetes y es un predictor significativo del trasplante exitoso de islotes.Es esencial asegurarse de que los islotes están localizados en el centro de los pozos después de la transferencia. Si no lo hace, se realizan mediciones inconsistentes de consumo de oxígeno. Demostrar este procedimiento será, Valerie Ricciardi, una estudiante de pregrado que trabaja en mi laboratorio.El día antes del ensayo, añadir 200 microlitros de células y adhesivos de tejido a 2,8 mililitros de solución de bicarbonato sódico molar 0,1 y añadir 20 microlitros de la solución resultante a la parte inferior de cada pocero de una microplaca esferoide de 96 pozos. Asegúrese de que las burbujas de aire se retiren de la punta de la pipeta. Cuando se hayan cargado todos los pozos, coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono no carbono de 37 grados Celsius.Después de una hora, aspirar la solución adhesiva celular de la placa dentro de un ambiente estéril y lavar cada pozo dos veces con 400 microlitros de 37 grados Celsius agua estéril. A continuación, deje que los pozos se sequen al aire durante 30 a 40 minutos antes de cubrir la placa para el almacenamiento durante la noche a cuatro grados centígrados. Para hidratar el cartucho del sensor, en un entorno estéril abra el paquete del cartucho del sensor y retire el contenido.Coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de servicio y llene cada pozo de la placa de servicio con 200 microlitros de agua estéril. Cuando se hayan cargado todos los pozos, baje el cartucho del sensor en la placa de servicio y coloque el cartucho del sensor y la placa de utilidad montados en la incubadora de dióxido no carbono de 37 grados Celsius durante la noche. El día del ensayo, retire la tapa del cartucho del sensor y decante el agua de los pozos de la placa de servicio.Agregue 200 mililitros de calibrador preadmanificado a cada pozo y reemplace la tapa del cartucho del sensor. A continuación, vuelva a colocar el cartucho del sensor en la incubadora durante aproximadamente una hora. Para preparar los islotes para su transferencia, escoja a mano los islotes en un plato de cultivo celular de 60 por 15 milímetros que contenga un medio ensamblado a una pureza cercana al 100%.Cuando se hayan recogido todos los islotes, cargue cada pocillo de la microplaca esferoide preparada con 175 microlitros de medio ensamblado y utilice una pipeta P20 en 15 microlitros para aspirar 15 islotes en 15 microlitros de medio de la placa de cultivo celular. Para sembrar los islotes en la microplaca esferoide, baje la punta de la pipeta a la parte inferior del pozo, apenas levante la punta y dispense lentamente alrededor de cinco microlitros de medio. Para cargar los islotes en los pozos, deje que los islotes se asienten en la punta de la pipeta antes de soltarlos suavemente directamente sobre la parte inferior del centro del pozo en un pequeño volumen de medio.Confirme que todos los islotes han dejado la punta de la pipeta, revisando ocasionalmente la microplaca esferoide bajo el microscopio para verificar que los islotes se siembran en la parte inferior de la placa y no se pegan a los lados de los pozos. Cuando se hayan transferido todos los islotes, coloque la microplaca en la incubadora de dióxido de carbono celsius de 37 grados. Antes de iniciar el procedimiento de ensayo, cargue el puerto A del cartucho del sensor con 20 microlitros de oligomicina micromolar 45 recién preparada, puerto B con 22 microlitros de 10 micromolares FCCP recién preparados y puerto C con 25 microlitros de 25 micromolares AA recién preparados. A continuación, programe un ensayo de analizador de flujo extracelular para un período de respiración basal de 30 minutos, un período de medición de oligomicina de 42 minutos, un período FCCP de 30 minutos y un período de rotenona AA de 30 minutos.A continuación, ejecute el ensayo siguiendo las instrucciones de la pantalla para calibrar el sensor e insertar la microplaca. Para la entrega de islotes a la placa de ensayo, se deben aspirar 15 islotes en 15 microlitros de medio como se ilustra. Esta técnica dará lugar a la colocación constante de islotes en el centro inferior de cada pozo de microplacas, lo que permite mediciones precisas de consumo de oxígeno.En este experimento representativo que muestra el consumo de oxígeno de pozos individuales, los pozos estaban mal cargados, lo que resultó en un nivel basal muy bajo de consumo de oxígeno y poca o ninguna respuesta a FCCP. En este experimento, la mayoría de los pozos demostraron una respiración basal significativa y una respuesta a los medicamentos. Sin embargo, dos pozos no mostraron ninguna respuesta a la rotenona, lo que sugiere que la droga no fue liberada correctamente en el pozo.Estos pozos fueron excluidos de nuevos análisis. Aquí, se pueden observar los resultados de un ensayo exitoso en el que los pozos se cargaron correctamente con islotes y se inyectaron correctamente con drogas. Es beneficioso preparar los reactivos y placas el día antes de realizar el ensayo para permitir que los islotes se utilicen poco después de que se aíslen o reciban.Después del ensayo, los islotes se pueden recuperar para la extracción de proteínas o ADN para normalizar los datos de consumo de oxígeno o para cuantificar el contenido de ADN mitocondrial. La capacidad de medir la función mitocondrial en un pequeño número de islotes primarios de primates permite la prueba de múltiples fármacos y otras manipulaciones en una sola réplica biológica. Las personas que trabajan con islotes primarios de primate deben estar seguros de ser entrenados en el manejo adecuado y seguro con estos tejidos.En particular, el uso de un equipo de protección personal adecuado y la eliminación adecuada de estas muestras.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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