Name: Ratones NOG humanizados para la exposición y tratamiento del VIH intravaginal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprende a generar ratones NOG humanizados para investigación preclínica del VIH mediante trasplante de células madre y exposición intravaginal. Este modelo permite evaluar cepas virales y nuevas intervenciones terapéuticas.

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Los autores desean dar las gracias al personal de Biomedicine Animal Facility de la Universidad de Aarhus, en particular a la Sra. Jani Kor por los esfuerzos de mantenimiento de las colonias y por el seguimiento de los pesos de los ratones. Los autores quieren agradecer al profesor Florian Klein por desarrollar el cART estándar de atención y por su orientación. El siguiente reactivo se obtuvo a través del Programa de Reactivos de SIDA de NIH, División de SIDA, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat-11744) del Dr. John Kappes y la Dra. Christina Ochsenbauer.

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Los autores no declaran conflictos de intereses.

El ratón gravemente inmunocomprometido tensa NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) es extremadamente adecuado para el trasplante de células y tejidos humanos. Las vías inmunitarias innatas y adaptativas en estos ratones están comprometidas. Los ratones NOG y NSG albergan una mutaciónscid de Prkdc que da como resultado una función celular T y B defectuosa. Además, estos ratones carecen de una cadena funcional de receptor de interleucina-2 (cadena gam...

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es una infección crónica con más de 37 millones de personas infectadas en todo el mundo1. La terapia antiviral combinada (cART) es una terapia que salva vidas, pero una cura todavía está justificada. Por lo tanto, es necesario modelos animales que reflejen el sistema inmunitario humano y sus respuestas para facilitar la investigación continua en el VIH. Múltiples tipos de ratones humanizados que son capaces de apoyar el injerto celular y tisular se han desarrollado trasplantando células humanas en ratones gravemente inmunodeficientes2. Estos ratones humanizados son susceptibles a la infección por el VIH y proporcionan una alternativa importante a los modelos de virus de inmunodeficiencia simio primateno no humano, ya que son más baratos y más fáciles de usar que los primates no humanos. Los ratones humanizados han facilitado la investigación en transmisión viral del VIH, patogénesis, prevención y tratamiento3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Presentamos un sistema modelo humanizado flexible para la investigación del VIH desarrollado mediante el trasplante de células madre humanas derivadas de la sangre de cordón umbilical en ratones del NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) fondo. Además de ser de origen no fetal, la bioingeniería práctica de estos ratones es menos técnicamente exigente en comparación con los procedimientos microquirúrgicos involucrados en el trasplante de la construcción de sangre-hígado-timo (BLT).
Mostramos cómo establecer la infección por VIH a través de la transmisión intravaginal y cómo monitorear la carga viral plasmática con una configuración sensible basada en PCR digital de gotas (ddPCR). Posteriormente, describimos el establecimiento de cART estándar dado como parte de la dieta diaria del ratón. El objetivo de estos métodos combinados es reducir el estrés a los animales y facilitar experimentos a gran escala en los que el tiempo dedicado al manejo de cada animal es limitado12.
En los seres humanos, un genotipo CCR532/wt o CCR532/32 provoca una menor susceptibilidad a la infección por VIH con los virus del transmisor/fundador13,y se deben tomar algunas precauciones cuando se deben tomar algunas precauciones cuando se bioingeniería de ratones humanizados con células madre con el fin de realizar estudios sobre el VIH. Esto es especialmente cierto en nuestra región porque las variantes naturales en el gen CCR5, en particular las deleciones de 32, son más frecuentes en las poblaciones nativas escandinavas y bálticas en comparación con el resto del mundo14,15. Por lo tanto, nuestro protocolo incluye un ensayo fácil y de alto rendimiento para el cribado de células madre hematopoyéticas de donantes para variantes ccr5 antes del trasplante.
Para la exposición intravaginal elegimos el virus transmisor/fundador R5 RHPA4259, aislado de una mujer en una etapa temprana de la infección que fue infectada por vía intravaginal16. Explamos a los ratones a una dosis viral que fue suficiente para producir una transmisión exitosa en la mayoría de los ratones, pero por debajo de una tasa de transmisión del 100%. La elección de una dosis de este tipo permite un rango dinámico suficiente en la velocidad de transmisión, de modo que los efectos antivirales de un candidato a un medicamento pueden dar lugar a animales protegidos en experimentos de prevención del VIH y disminución de la carga viral para los estudios de tratamiento.

<table><tbody><tr><td>Almohadilla azul</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td>Debe esterilizarse antes de su uso</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>CD19 (clon sj25c1) PE-Cy7</td><td>BD Bioscience</td><td>557835</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (clon OKT3) FITC</td><td>Biolegend</td><td>317306</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (clon SK7) BUV395</td><td>BD Bioscience</td><td>564001</td><td></td></tr><tr><td>CD34 (clon AC136) FITC</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-740</td><td></td></tr><tr><td>CD4 (clon SK3) BUV 496</td><td>BD Bioscience</td><td>564652/51</td><td></td></tr><tr><td>CD45 (clon 2D1) APC</td><td>Biolegend</td><td>368511/12</td><td></td></tr><tr><td>CD8 (clon RPA-T8) BV421</td><td>BD Bioscience</td><td>562428</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863025</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>10,02,95,21,000</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>D4263</td><td>Para tampón de suspensión</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Life Technologies</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Biowest</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Sangre de Cordón Umbilical Humano CD34 Positive Selection Kit II</td><td>Stemcell</td><td>17896</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>FACS Solución de lisis 10X</td><td>BD</td><td>349202</td><td>Diluir 1:10 en dH20 inmediatamente antes</td></tr><tr><td>de usar tubos FACS (Falcon 5 mL redondo)</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Fc Solución bloqueadora de receptores (Human Trustain FcX)</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma</td><td>F8192-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v.10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Mesoft</td><td>157300</td><td>Debe esterilizarse antes de usar</td></tr><tr><td>Lámpara</td><td></td><td></td> de calefacción <td></td></tr><tr><td>Hemacitómetro hecho a medida (B&uuml; rker-T&uuml; rk)</td><td>VWR</td><td>DOWC1597418</td><td></td></tr><tr><td>Gas isoflurano</td><td>Orion Pharma</td><td>9658</td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa X20 citómetro de flujo</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, aprobados por PCR-PT</td><td>Sarstedt</td><td>72692405</td><td></td></tr><tr><td>Mouse cART food</td><td>ssniff Spezialdi&auml; ten GmbH</td><td>Producto</td><td></td>a medida</tr><tr><td>Sujetador</td><td></td> de ratón <td>Producto</td><td></td>a medida</tr><tr><td>Aguja, Microlance 3, 30G y frac12; "</td><td>BD</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>ratones NOG NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac</td><td></td><td>NOG-F</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td> Productos <td>químicos VWR</td><td>436912C</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin 96 Kit de aislamiento de ADN y ARN de virus</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740691</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga aprobados por PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.405</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina 100X</td><td>Biowest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II ADN polimerasa</td><td>Life Technologies</td><td>F549S</td> Puntas de <td></td></tr><tr><td>pipeta, estériles, ART 20P Barrera</td><td>ThermoScientific</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>NEB 100005398</td><td></td><td></td></tr><tr><td>software QuantaSoft</td><td>Bio-Rad</td> QX100 Generador de gotas Bio-Rad <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>1886-3008</td><td></td></tr><tr><td>QX100 Lector de gotas</td><td>Bio-Rad</td><td>186-3003</td><td></td></tr><tr><td>Solución de lisis RBC</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de reacción de tamaño F + DNAasa libre de RNasa</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740963</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Inhibidor recombinante de la ribonucleasa</td><td>ThermoScientific</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Biowest</td><td>L0501-500</td><td>Disolver en</td></tr><tr><td>jeringa H20 Softject de 1 mL</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010-200V0</td><td></td></tr><tr><td>Superíndice III Transcriptasa inversa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>VWR</td><td>89370-910</td><td></td></tr><tr><td>Trypane azul</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 0,5 EDTA, pH 8,0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Virkon S (desinfectante de virus)</td><td>Dupont</td><td>7511</td><td></td></tr></tbody></table>

ratones nog humanizados para la exposición y tratamiento del vih intravaginal

Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection

Los ratones humanizados proporcionan una plataforma sofisticada para estudiar la virología del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y para probar los medicamentos antivirales. Este protocolo describe el establecimiento de un sistema inmunitario humano en ratones NOG adultos. Aquí, explicamos todos los pasos prácticos desde el aislamiento de las células CD34+ humanas derivadas de la sangre del cordón umbilical y su posterior trasplante intravenoso en ratones, hasta la manipulación del modelo a través de la infección por VIH, la terapia antirretroviral combinada ( cART), y el muestreo de sangre. Aproximadamente 75.000 células hCD34+ se inyectan por vía intravenosa en los ratones y el nivel de chimerismo humano, también conocido como humanización, en la sangre periférica se estima longitudinalmente durante meses por citometría de flujo. Un total de 75.000 células hCD34+ produce entre un 20% y un 50% de células CD45+ humanas en la sangre periférica. Los ratones son susceptibles a la infección intravaginal con VIH y la sangre se puede tomar muestras una vez por semana para su análisis, y dos veces al mes durante períodos prolongados. Este protocolo describe un ensayo para la cuantificación de la carga viral plasmática utilizando PCR digital de gotas (ddPCR). Mostramos cómo los ratones pueden ser tratados eficazmente con un régimen de cART estándar de cuidado en la dieta. La entrega de cART en forma de chow de ratón regular es un refinamiento significativo del modelo experimental. Este modelo se puede utilizar para el análisis preclínico de compuestos de profilaxis previas a la exposición sistémicas y tópicas, así como para la prueba de nuevos tratamientos y estrategias de curación del VIH.

La estrategia de gating para el análisis de la pureza de las células madre se muestra en la Figura 1. La Figura 1A–C muestra la población CD34+ purificada y la Figura 1D–F el flujo-a través del CD34 utilizado para ilustrar que la cantidad mínima de la población CD34+ se pierde en el proceso de aislamiento. La pureza de las células madre aisladas CD34+ fue de entre 85%-95% con menos del 1% de contami...

Hemos desarrollado un protocolo para la generación y evaluación de un modelo de ratón NOG infectado por el virus de inmunodeficiencia humana y humanizado basado en el trasplante de células madre, la exposición al virus de inmunodeficiencia humana intravaginal y el ARN PCR digital de gotas Cuantificación.

Ratones NOG humanizados para la exposición y tratamiento del VIH intravaginal

Humanized mice provide a sophisticated platform to study human immunodeficiency virus (HIV) virology and to test antiviral drugs. This protocol describes ...

Establecer este modelo de ratón humanizado puede ayudar en estudios de investigación preclínicos sobre el VIH. Por ejemplo, se pueden evaluar tanto diferentes cepas virales como nuevas intervenciones contra el VIH. Estos protocolos se pueden utilizar para evaluar el estado de la variante CCR5 del donante de células madre e infectar eficientemente ratones humanizados con VIH y para cuantificar las cargas virales del plasma de ratón.El protocolo de cuantificación de ARN se puede adaptar fácilmente para cuantificar cualquier secuencia de ARN viral de elección que sea detectable en muestras de plasma. Para el cribado genético de muestras de sangre de cordón umP5 para ccR5 delta 32 variantes, incubar 1,25 microlitros de flujo no peletizador con 11,25 microlitros de mezcla de PCR que contienen 200 micromolares dNTP mezcla, 0,01 unidades por microlitro de polimerasa de ADN de alta fidelidad, y imprimaciones delanteras e inversas como se detalla en la tabla. Ajuste el volumen con agua sin nucleasas a aproximadamente 12,5 microlitros para cada reacción PCR y amplificar los fragmentos genómicos con el programa de ciclismo PCR como se indica en la tabla.Al final de la reacción, separar los pr

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra un ensayo para evaluar la efectividad de la terapia antirretroviral combinada oral (cART oral) en un modelo de ratón humanizado infectado con el virus de inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1). Se administra una combinación de fármacos dirigidos al VIH-1, incluidos los inhibidores de la transcriptasa inversa análogos y los inhibidores de la transferencia de la cadena de integrasa, junto con un suplemento nutricional y antibióticos. Tras el consumo de esta mezcla por parte de los...

Terapia antirretroviral oral combinada para tratar la infección por VIH-1 en un modelo de ratón humanizado

El video muestra una técnica para generar un modelo de ratón humanizado con inmunidad de ingeniería basada en células madre contra el virus de inmunodeficiencia humana (VIH). El tejido del timo fetal humano y las células madre hematopoyéticas (HSC) modificadas genéticamente se implantan en la cápsula renal de un ratón gravemente inmunodeprimido. Las HSC, que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR) contra el VIH, se mezclan en una mezcla de proteínas gelatinosas que promueve su...

Construcción de un modelo de ratón humanizado con inmunidad modificada contra el VIH

Este protocolo describe los métodos para construir un modelo de ratón humanizado de médula ósea/hígado/timo con inmunidad modificada basada en células madre contra la infección por VIH.

-Base de células madre Inmunidad Diseñado frente a la infección por VIH en el modelo de ratón humanizado

Este protocolo proporciona un método para crear ratones humanizados (hu-NSG) vía intrahepática inyección de células madre hematopoyéticas humanas en ratones NSG neonatales radiación-condicionada. El ratón hu-NSG es susceptible a la infección por VIH y la terapia combinatoria antirretroviral (carro) y sirve como un modelo fisiopatológico adecuado para investigaciones de replicación y latencia del VIH.

(Hu-NSG) ratón humanizado del NOD/SCID/IL2rγnull modelo para estudios de latencia y replicación del VIH

Este protocolo proporciona un método confiable para establecer ratones humanizados con el sistema inmunitario humano y las células hepáticas. Los ratones inmunodeficientes duales reconstituidos logrados mediante inyección intraesplénica de hepatocitos humanos y células madre CD34+ hematopoyéticas son susceptibles a la infección por el virus de inmunodeficiencia humana-1 y al daño hepático recapitulado observado en Pacientes infectados por el VIH.

Establecimiento del modelo de ratón TK-NOG humanizado dual para la patogénesis hepática asociada al VIH

Aquí se describen tres enfoques experimentales para estudiar la dinámica de la infección por VIH en ratones humanizados. El primero permite el estudio de eventos de infección crónica, mientras que los dos últimos permiten el estudio de eventos agudos después de una infección primaria o reactivación viral.

Infección crónica, aguda y reactivada por VIH en modelos de ratón inmunodeficientes humanizados

Este protocolo describe un método novedoso para administrar medicamentos antirretrovirales combinados orales que suprimen con éxito la replicación del ARN del VIH-1 en ratones humanizados.

Tratamiento antirretroviral combinado oral en ratones humanizados infectados con VIH-1

Este protocolo describe cómo la combinación de la infección por EcoHIV con ratones Tmem119-EGFP ofrece un valioso sistema biológico para investigar las alteraciones microgliales y los reservorios virales en modelos de roedores con trastornos neurocognitivos asociados al VIH.

Identificación de células infectadas por EcoHIV en ratones transgénicos manipulados con microglía

Este experimento visualizado es una guía para la utilización de un clon de fluorescencia molecular del VIH para vivir experimentos de imagen confocal.

Visualización de la célula a célula de Transmisión del VIH utilizando clones fluorescente del VIH y la microscopía confocal en vivo

Tropismo del VIH se puede deducir de la región V3 de la envoltura viral. V3 es amplificada por PCR en triplicado, utilizando RT-PCR, secuencia, e interpretados mediante el software bioinformático. Las muestras con con la secuencia de 1 o más (s) con calificaciones bajas G2P son clasificados como no-R5 virus.

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Aprende a generar ratones NOG humanizados para investigación preclínica del VIH mediante trasplante de células madre y exposición intravaginal. Este modelo permite evaluar cepas virales y nuevas intervenciones terapéuticas.

Ratones NOG humanizados para la exposición y tratamiento del VIH intravaginal

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