Cuantificación de la resistencia a los antibióticos mediada por plásmido en un enfoque de evolución experimental

Los plásmidos son elementos extracromosomales que son omnipresentes en la mayoría de las especies bacterianas y hábitats donde son agentes muy importantes de transferencia de genes laterales, ya que pueden migrar entre las células y entre las poblaciones. Uno de los ejemplos más llamativos y destacados de dicha transferencia es la diseminación de genes de resistencia a antibióticos codificados en plásmidos. Para construir un plásmido modelo que codifica un gen de resistencia a los antibióticos, elija una columna vertebral del plásmido y PCR amplificar la columna vertebral utilizando una polimerasa de alta fidelidad y imprimaciones que se unen en la plantilla de plásmido. En nuestro caso utilizamos una columna vertebral de plásmido pBBR1. A continuación, amplificar el gen de resistencia nptII incluyendo el promotor nativo Tn5 usando una polimerasa de alta fidelidad. Diseñe las imprimaciones para el gen de resistencia con aproximadamente 20 pares base de complementariedad de secuencia a la columna vertebral del plásmido. Después de los PCR, fusionar la región homológica del producto PCR del gen de resistencia purificada a la columna vertebral del plásmido purificado utilizando el ensamblaje isotérmico a 50 grados durante 60 minutos. Transforme el producto fusionado en E. coli DH5-Alpha utilizando electroporación. Placa 100 microlitro de la mezcla en medios selectivos e incubar a 37 grados durante unas 24 horas. El plásmido puede ser extraído, validado y transformado en la cepa de tipo salvaje E.coli MG1655. Esto produce cepa MG1655 pCON.Durante la exposición a antibióticos, las bacterias necesitan el plásmido para sobrevivir. Por lo tanto, el plásmido está bajo selección positiva. En condiciones no selectivas, por lo que sin antibióticos, el plásmido es desechable a la célula. El objetivo de nuestro estudio era seguir los plásmidos en condiciones tan no selectivas a lo largo del tiempo. Para ello, equipamos los pequeños plásmidos con un gen de resistencia a los antibióticos y lo introdujimos en Escherichia coli. Realizamos un experimento evolutivo y monitoreamos la frecuencia de los plásmidos a través de la réplica. El plásmido que transporta la cepa mg1655 pCON se introduce ahora en un experimento de evolución. En primer lugar, placa mg1655 pCON en placas de agar LB suplementadas con antibióticos e incubar durante la noche a 37 grados. De esta placa elige al azar las 8 colonias de ancestros e incubar durante la noche a 37 grados con temblores constantes. Al día siguiente, las poblaciones se transfieren al experimento que se lleva a cabo en 96 placas de pozos profundos. Es muy importante distribuir aleatoriamente las réplicas a través de la placa. Por ejemplo, en un enfoque de tablero de ajedrez. En nuestro experimento los cultivos se diluyen y transfieren con diferentes tasas de dilución y en dos temperaturas. Durante cada evento de transferencia se aplica el tratamiento de dilución y la transferencia en serie se repite en un total de 98 transferencias. A lo largo del experimento de evolución la frecuencia de plásmidos en la población se estima a partir de la proporción de células portadoras de plásmido. La réplica fue popularizada por Esther y Joshua Lederberg en la década de 1950, donde la usaron para estudiar la resistencia a los medicamentos en bacterias. El método les permitirá ampliar su exploración en busca de fenotipos y al final del estudio reveló que la resistencia a la penicilina puede surgir en las bacterias debido a mutaciones espontáneas en el genoma. Para determinar la frecuencia del plásmido en la población durante el experimento, los cultivos estacionarios se diluyen en serie y se encuñan en placas de agar LB no selectivas. Ajuste la dilución según un rendimiento de 250 a 500 colonias por placa. Las poblaciones chapadas se incuban para un crecimiento nocturno a 37 grados durante menos de 24 horas. Las colonias se replican mejor cuando todavía son pequeñas. Después de la noche de la noche en el recuento de todas las colonias utilizando un contador automatizado de colonias de la elección del lector. Esto produce el tamaño total de la población de bacterias en los cultivos. Tenga en cuenta que las colonias en el borde de la placa deben quedar fuera. Para replicar las placas, necesita placas de agar selectivas complementadas con antibióticos, un bloque redondo, un anillo de metal que se ajusta al bloque y tela de terciopelo estéril. El paño debe ser 100%algodón, ya que esto puede ser esterilizado por autolavado. Coloque el paño en el bloque y fíjelo con el anillo de metal.Coloque cuidadosamente la placa con las colonias contadas sobre la superficie fija de tela de terciopelo. Toque la placa en movimientos circulares para que toda la superficie de la placa toque la tela. Es muy importante que todas las colonias toquen el terciopelo. Retire la placa LB y coloque la placa selectiva en el terciopelo. Repita el golpe cuidadoso. De nuevo es importante que la placa toque completamente el terciopelo. Después, retire la placa selectiva. Las placas se incuban a temperatura ambiente durante la noche. Al día siguiente, tanto el LB como la placa de antibióticos son necesarios para la evaluación. Coloque las placas una encima de la otra y compare el crecimiento. Puede detectar fácilmente espacios libres de colonias. Estas son las colonias que no son resistentes a los antibióticos. Así, estas colonias perdieron el plásmido. Al final, marca cuántas colonias faltan en la placa de antibióticos. Este número te da la pérdida de plásmido. Repita la réplica de todas las poblaciones durante el experimento de evolución semanalmente. La pérdida de plásmido puede ser causada por un plásmido multi malformación. Cuando se trabaja en una construcción de plásmido decir para la expresión de un gen dado en su cepa huésped preferida el comportamiento nativo de un plásmido in vivo con respecto a la confirmación que un estado puede tomar es generalmente algo que se pasa por alto. Pero en un contexto evolutivo, tal confirmación de cambios podría ser de gran importancia. El análisis de las confirmaciones de plásmido puede ser un esfuerzo muy complicado. Especialmente los multimers plásmidos son difíciles de analizar porque no pueden ser identificados correctamente por PCR o por secuenciación. Por otro lado, los multimers plásmidos son difíciles de analizar por electroforesis de gel debido a su tamaño potencialmente grande y su lenta movilidad electroforética. Nuestro protocolo ofrece un método sencillo y directo para el cribado e identificación de plásmidos multimers en yo diría que cualquier preparación de plásmido dado. Para extraer moléculas de plásmido visual extraer el plásmido de 5 ml de cultivo celular estacionario durante la noche utilizando lysis alcalina. La extracción de plásmido de plásmidos de copia baja a menudo conduce a la contaminación con ADN cromosómico huésped que necesita ser digerido antes de la visualización. Para eliminar la contaminación del ADN cromosómico, trate el ADN plásmido extraído con Plasmid-Safe