Síntesis enzimática mediada por OaAEP1 e inmovilización de proteína polimerizada para espectroscopia de fuerza de una sola molécula

Nuestro método enzimático utiliza oligómero de proteínas con un número controlado de grado de polimerización. Es una preparación de muestra perfecta para el estudio de espectroscopia de fuerza de una sola molécula, así como para la construcción de materiales a base de proteínas. Nuestro método no introduce cisteína en la proteína diana.

Debido a que la cisteína es uno de los residuos funcionales más importantes para la proteína, facilita la construcción de proteínas o enzimas de materia polimerizada. Demostrando el procedimiento serán Yibing Deng y Shengchao Shi, estudiantes de posgrado de mi laboratorio. Para empezar, disolver 20 gramos de cromato de potasio en 40 mililitros de agua ultrapura en un vaso de precipitados.

Agregue lentamente 360 mililitros de ácido sulfúrico concentrado a la solución de dicromato de potasio y utilice una varilla de vidrio para agitar suavemente. Coloque un cubreobjetos de vidrio en el ácido cromático y transfiéralo a un horno a 80 grados Centígrados durante 30 minutos. Limpie el cubreobjetos con agua y luego alcohol etílico absoluto y seque el cubreobjetos con una corriente de nitrógeno.

Sumerja completamente el cubreobjetos en una solución de tolueno APTES de 1% de volumen durante una hora a temperatura ambiente mientras las protege de la luz. Lavar el cubreobjetos con tolueno primero y luego con alcohol etílico absoluto y secar el cubreobjetos con una corriente de nitrógeno. Incubar el cubreobjetos a 80 grados celsius durante 15 minutos y luego dejar que se enfríe a temperatura ambiente.

Utilice una pipeta para añadir 200 microlitros de un miligramo por mililitro Sulfo-SMCC en solución DMSO entre dos cubreobjetos inmovilizados e incubar durante una hora protegida de la luz. Después de una hora, lave primero los cubreobjetos con DMSO y luego con alcohol etílico absoluto para eliminar el Sulfo-SMCC residual. Seque el cubreobjetos bajo una corriente de nitrógeno.

Pipetear 60 microlitros de 200 micromolares GL-ELP-50 cys-protein solución en un cubrelip funcionalizado e incubar a 25 grados Celsius durante unas tres horas. Después de eso, lave el cubreobjetos con agua ultrapura para eliminar el GL-ELP-50-cys no reaccionado. Para preparar la superficie voladiza funcionalizada, primero sumerja los voladizos en ácido cromático y limpie los voladizos a 80 grados Celsius durante 10 minutos.

Use agua y alcohol etílico absoluto para lavar el ácido. Sumergir el voladizo con una solución de tolueno APTES de 1% de volumen para realizar una salinización amino en una tapa de tubo de plástico durante una hora. Enjuague el voladizo con alcohol etílico absoluto y luego hornee el voladizo a 80 grados Celsius durante 15 minutos.

Sumerja el voladizo en la solución Sulfo-SMCC durante una hora y luego enjuague el voladizo con alcohol etílico absoluto. Para vincular el cys-ELP-50-NGL a la superficie, sumerja los voladizos en el cys-ELP-50-NGL con el grupo de maleimidos de Sulfo-SMCC durante 1,5 horas. A continuación, lave el cys-ELP-50-NGL no reaccionado en el voladizo por agua ultrapura.

A continuación, sumerja un voladizo funcionalizado en una solución que contenga 200 microlitros de 50 micromolares de solución proteica GL-CBM-XDockerin con 200 nanomolares OaAEP1 y colóquelos a 25 grados Celsius durante 20 a 30 minutos. A continuación, utilice el tampón AFM para lavar la proteína no reaccionada. Es fundamental lavar la proteína residual no reaccionada antes del experimento AFM porque formará un par de cohesina-dockerína y bloqueará el voladizo para tomar nueva proteína en la superficie.

Para vincular la unidad de ligadura cohesin-T-L-protein de interest-NGL con el GL-ELP-50 inmovilizado en la superficie del cubreobjetos, añadir 15 microlitros de OaAEP1 en la cubierta y dejar que se incuba durante 30 minutos. Utilice de 15 a 20 mililitros de tampón AFM para lavar las proteínas no reaccionadas. Añadir 100 microlitros de TEV proteasa para cortar la unidad de proteínas en el sitio de reconocimiento TEV durante una hora a 25 grados centígrados.

Luego usa de 15 a 20 mililitros de tampón AFM para lavar las proteínas residuales. Enlace la unidad de ligadura cohesina-T-L-proteína de interés-NGL al vidrio GL-ubiquitina-NGL de OaAEP1 durante 30 minutos. Dependiendo de las construcciones proteicas GL-ubiquitina-NGL que se construirá sobre la superficie de vidrio, repita los pasos de preparación de poliproteína n1 veces.

Omita la última reacción de escote teví para reservar cohesina en el polímero proteico como vidrio cohesina-TEV-L-ubiquitina-n-NGL. Añadir un mililitro de tampón AFM con 10 cloruros de calcio mili evolucionadores y cinco milimolares ascórbicos a la cámara de fluido AFM. Elija la punta D de la sonda AFM funcionalizada para el experimento.

Sumerja la sonda en el búfer AFM. Retirar el voladizo a una velocidad constante de 400 nanómetros por segundo de la superficie. Mientras tanto, registre la curva de extensión de fuerza a una frecuencia de muestreo de 4.000 hercios.

Utilice el teorema de la equiparción para calibrar el voladizo en búfer AFM con un valor K constante de resorte preciso antes de cada experimento. Fije la punta en voladizo funcionalizada con dockerin a la superficie depositada funcionalizada con cohesina para formar el par de cohesina-dockerin. A continuación, abra el software de procesamiento de datos JPK y seleccione la curva de extensión de fuerza con el patrón característico de corte de sierra y una fuerza de desprendimiento alta.

En este estudio, los residuos de NGL introducidos entre proteínas adyacentes por ligadura OaAEP1 no afectaron a la estabilidad del monómero proteico en el polímero expresado ya que la fuerza de desdoblamiento y el incremento de contra-longitud fue comparable con el estudio anterior. La purificación de rubredox de forma férrica presentó picos típicos de absorción visualizados por UV en 495 nanómetros y 575 nanómetros, mientras que la forma de zinc no.

También se muestran la mezcla de ligadura de GL-ubiquitina y cohesina-TEV-L-ubiquitina con o sin OaAEP1 y OaAEP1 puro. Es fundamental funcionalizar la superficie con Sulfo-SMCC activo para una fijación de péptidos con éxito. Aquí proporcionamos un nuevo método para construir proteína polimerizada.

Facilita a los investigadores estudiar el complejo sistema de proteínas utilizando espectroscopia de fuerza de una sola molécula. El ácido cromático es fuertemente corrosivo y ácido. Tenga cuidado cuando se prepare y maneje.