Name: Preparación De Pellets De Células Mononucleares De Sangre Periférica Y Plasma De Una Sola Extracción De Sangre En Los Sitios De Ensayos Clínicos Para El Análisis De Biomarcadores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprende a preparar pellets de células mononucleares de sangre periférica y plasma de una sola extracción sanguínea para análisis de biomarcadores en ensayos clínicos oncológicos.

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Nos gustaría agradecer a todos los miembros de Medicina Traslacional en AstraZeneca Oncology Research and Early Development por sus comentarios sobre el protocolo, especialmente a Hedley Carr, Tammie Yeh y Nathan Standifer por su asesoramiento sobre la preparación de plasma para el análisis de ctDNA, sobre el aislamiento de PBMC y la criopreservación e inmunofenotipación de PBMC, respectivamente.

El consentimiento informado del paciente y el pleno cumplimiento de los requisitos éticos nacionales pertinentes en cada jurisdicción, por ejemplo, la Ley de Tejidos Humanos (HTA – Reino Unido, 2004) y la Ley de Portabilidad y Responsabilidad del Seguro Médico (HIPAA – Estados Unidos, 1996) son obligatorios. Asegúrese de tener una aprobación ética completamente documentada antes de comenzar cualquier trabajo en materiales derivados del ser humano. La sangre utilizada en la optimización de este protocolo se proporcionó con el consentimiento apropiado del Volunteers Advancing Medicine Panel (VAMP) (referencia ética 16/EE/0459, estudio CRF494, sub estudio 001) dirigido por el NIHR Cambridge Clinical Research Facility, Cambridge, Reino Unido, en virtud de un acuerdo de suministro de muestras biológicas humanas con el National Institute for Health Research (NIHR) Cambridge Biomedical Research Centre. El Biobanco de AstraZeneca en el Reino Unido está autorizado por la Autoridad de Tejidos Humanos (Licencia No. 12109) y cuenta con la Aprobación del Comité Nacional de Ética en Investigación (NREC) como Banco de Tejidos de Investigación (RTB) (REC No 17/NW/0207).
1. Orientación general para la preparación
NOTA: Todo el trabajo con material humano no fijado, como la sangre, el plasma y los PBMCs en este protocolo, debe funcionar bajo el supuesto de que estos materiales pueden transportar agentes potencialmente infecciosos y, por lo tanto, deben realizarse bajo las precauciones de bioseguridad adecuadas. Para los pacientes que han sido probados como negativos para patógenos conocidos, no asuma que las muestras no son infecciosas y, por lo tanto, aún se deben aplicar las precauciones de seguridad adecuadas. Los productos de desecho generados a partir de estos materiales deben tratarse con las mismas precauciones de bioseguridad y eliminarse de acuerdo con las normas locales.
<ol><li>Elija entre los dos tipos de tubos mononucleares de la preparación de la célula que utilicen el citrato de sodio o la heparina del sodio como anticoagulantes. Para muchas aplicaciones posteriores, estos dos anticoagulantes se pueden usar indistintamente, pero ambos anticoagulantes deben probarse antes de seleccionar uno para el ensayo.</li>
	<li>Etiquete un tubo de preparación de células mononucleares de 8 mL que se utilizará para la extracción de sangre con la identificación codificada del paciente. Mantenga los tubos a temperatura ambiente (18-25 °C).</li>
	<li>Guarde 1x PBS a temperatura ambiente (18-25 °C). Utilice 30 mL por preparación.</li>
	<li>Asegúrese de que los tubos para muestras de plasma separadas y el criovial para la muestra de PBMC estén etiquetados con precisión con identificadores únicos, como se especifica en la sección correspondiente del manual de laboratorio.</li>
	<li>Si los PBMCs se van a utilizar para monitorizar proteínas fosforiladas, prepare PBS suplementado con inhibidores de la fosfatasa: mezcle 5 mL de PBS con 50 μL de cóctel inhibidor de la fosfatasa 2 + 50 μL de cóctel inhibidor de la fosfatasa 3. Preparar fresco y mantener en hielo hasta su uso.</li>
	<li>Si los PBMCs van a ser criopreservados, prepare 1 mL de mezcla de congelación por muestra mezclando 90% de FBS + 10% de DMSO.</li>
</ol>2. Colección de PBMC (Figura 1A)
<ol><li>Extraiga 8 mL de sangre en el tubo de preparación celular mononuclear utilizando la técnica estándar descrita por el fabricante. Invierta el tubo suavemente de 8 a 10 veces para mezclar el aditivo anticoagulante con la sangre. No agite para evitar la hemólisis. Registre la hora en que se extrajo la sangre.</li>
	<li>Después de la recolección, guarde el tubo en posición vertical a temperatura ambiente hasta la centrifugación. Procesar las muestras tan pronto como sea posible, idealmente dentro de una hora de esta extracción de sangre, pero no más tarde de 4 h después de la recolección. Registre el momento al iniciar el procesamiento de la sangre.</li>
	<li>Inmediatamente antes de la centrifugación remezcle la muestra de sangre invirtiendo suavemente el tubo de 8 a 10 veces más.</li>
	<li>Centrifugar los tubos de tubo/muestra de sangre en un rotor horizontal (cabezal oscilante) a 1.500 – 1.800 x g durante 30 min a temperatura ambiente (18-25 °C). Asegúrese de que todos los tubos estén equilibrados correctamente.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general del protocolo e imágenes representativas de la centrifugadora. (A) Descripción esquemática del protocolo para la preparación de PBMCs y plasma. *Si hay limitaciones de tiempo, el paso 2.4 se puede acortar a 20 minutos y los pasos 3.3 a 3.6 se pueden eliminar. ** Tome una alícuota para contar las celdas, si es necesario. 2 pasos de centrifugación adicionales requeridos para el análisis de ctDNA / metabolómica(B)imagen de una centrífuga de rotor de cabeza giratoria establecida para el paso 2.4. (C) Imagen del rotor, que incluye dos cubos que contienen los adaptadores para hacer girar los tubos de preparación de células mononucleares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
NOTA: x g (también conocido como RCF, unidades centrífugas relativas) y RPM (revoluciones por minuto) son unidades diferentes. Asegúrese de establecer la centrífuga para x g (RCF). Utilice la calculadora en línea (consulte Tabla de materiales) para la conversión. Si solo está disponible el rotor de ángulo fijo, realice este paso durante 10 minutos a 1.500 – 1.800 x g.
<ol start="5"><li>Después de la centrifugación, compruebe la presencia de una capa de color rojo oscuro debajo de la barrera (que contiene principalmente glóbulos rojos) y 2 capas por encima de la barrera. La capa superior es el plasma (de color pajizo) y la capa blanquecina debajo es la capa buffy que contiene los PBMCs. Estas capas se pueden distinguir fácilmente al ver el tubo contra un fondo oscuro / negro.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig02.jpg"> Figura 2: Tubos para aislar PBMCs. (A)Imagen de los tubos antes de la centrifugación (paso 2.4), ya sea vacíos (izquierda) o con sangre (derecha). (B) Separación exitosa de la capa PBMC después de la centrifugación (paso 2.5). (C)Imagen de la capa de PBMC después de la centrifugación y un poco de plasma dejado para asegurar que se recogen todos los PBMCs (paso 2.7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
Nota : si estas capas no son visibles, esto probablemente indica un error en la configuración de las unidades de centrifugación. Asegúrese de que se utiliza el adaptador de centrífuga correcto y de que se establece la "x g" correcta. Repita el paso 2.4.
<ol start="6"><li>Inmediatamente después de la centrifugación, use una pipeta serológica para transferir aproximadamente la mitad del plasma a un tubo de centrífuga cónica de tamaño de 15 mL etiquetado con tapa, teniendo cuidado de no perturbar la capa de PBMC (aproximadamente 4-5 mL). Guarde temporalmente este tubo con plasma sobre hielo húmedo para ser utilizado más adelante en el paso 4. Reserva por ahora.</li>
	<li>Recoja toda la capa de PBMC con una pipeta Pasteur colocando la pipeta dentro de la capa de células y transfiéralo a un tubo de centrífuga cónica de tamaño diferente de 15 mL con tapa. Es aceptable tomar también una pequeña cantidad de plasma, si es necesario, para obtener completamente toda la capa de PBMC. El volumen suele ser de 1-2 mL. Continúe inmediatamente con el paso 3 a continuación.</li>
</ol>3. Pasos de lavado de PBMC
NOTA: El propósito de los pasos de lavado es diluir y eliminar las plaquetas residuales y el plasma del pellet de PBMC. Todos los pasos de centrifugación deben realizarse a temperatura ambiente (18-25 °C).
<ol><li>Agregue PBS a temperatura ambiente al tubo PBMC para llevar el volumen a 15 mL. Tapa el tubo. Mezcle las células invirtiendo suavemente el tubo 5 veces.</li>
	<li>Centrífuga durante 15 min a 300 x g. Nótese que se trata de una centrifugación mucho más suave que la centrifugación inicial.</li>
	<li>Visualice el pellet viendo el tubo contra un fondo oscuro / negro. Retirar el sobrenadante por aspiración al vacío o con una pipeta (Figura 3A). Deseche el sobrenadante dejando un volumen de aproximadamente 500 μL por encima del pellet de PBMC de color blanquecino.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig03.jpg"> Figura 3: Pellets de PBMC. (A) Pellet obtenido en la primera etapa de lavado 3.3. (B) Pellet aislado en el segundo lavado (paso 3.7). (C)Pellet con alto nivel de hemólisis obtenido de sangre procesada después de 4 h de la extracción de sangre aislada en el segundo lavado (paso 3.6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<ol start="4"><li>Resuspend el pellet de la célula pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo en el sobrenadante residual.</li>
	<li>Agregue 1x PBS adicionales para llevar el volumen a 10 mL. Tapa el tubo. Mezcle las células invirtiendo el tubo suavemente 5x. Si se requiere el conteo de células en el protocolo del estudio, vaya al paso 3.5.1, si no es necesario, vaya directamente al paso 3.6.<ol>
<li>Tome una alícuota de 40 μL de las células re-suspendidas y mezcle con 40 μL de azul trypan. Cuente las células viables usando un hemocytometer o un contador automático de la célula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar la suspensión de la etapa 3.5 durante 10 min a 300 x g. Retire tanto sobrenadante como sea razonablemente posible sin molestar el pellet celular.</li>
	<li>Retire y deseche cuidadosamente cualquier sobrenadante restante por encima del pellet de la célula pipeteando usando una pipeta Pasteur de punta fina o una micropipeta sin molestar el pellet de la célula. Deje poco o ningún líquido por encima del pellet después de completar este paso. Si el punto final de este protocolo es un pellet pbmc mover al paso 3.8; si el punto final es PBMCs cryopreserved vaya al paso 3.10.</li>
	<li>Agregue 50 μL de PBS nuevo (o el PBS suplementado preparado en el paso 1.5, si corresponde a su punto final) al pellet y la pipeta hacia arriba y hacia abajo suavemente usando una micropipeta para resuspensar homogéneamente todas las células. Transfiera toda la suspensión celular a un criovial etiquetado de 1,5 mL y colóquela inmediatamente sobre hielo húmedo hasta que congele las muestras.</li>
	<li>Congele las muestras etiquetadas colocándolas en nitrógeno líquido o directamente en hielo seco. Las celdas también se pueden congelar a -80 °C de congelador utilizando cajas de congelación de celdas. En este caso, prechill las cajas completamente en -80 °C antes de añadir los tubos celulares. Registre el momento en que se congelaron los pellets celulares. Una vez que las células se congelen, almacenar a -80 °C, enviar congelado en hielo seco.</li>
	<li>Opcionalmente, para criopreserrar los PBMCs re-suspender el pellet en 1 mL de la mezcla de congelación (paso 1.6) y transferir a un criovial marcado. Continúe como se describe en el paso 3.9, pero, en este caso, sólo es aceptable utilizar cajas de congelación de células para congelar las muestras. Transferencia a nitrógeno líquido para su envío y almacenamiento después de estar en la caja de congelación durante un mínimo de 24 h.</li>
</ol>4. Pasos de preparación del plasma (Figura 1A)
<ol><li>Después del almacenamiento de -80 °C de los pellets de PBMC, ahora prepare la alícuota de plasma que se almacenó temporalmente en hielo húmedo en el paso 2.6. Realice los siguientes pasos de centrifugación para aclarar el plasma si el propósito de la muestra es el análisis de ctDNA, de lo contrario, pase directamente al paso 4.2.<ol>
<li>Centrifugar el plasma durante 10 min a 1.600 - 2.000 x g a 4 – 8 °C en un rotor de ángulo fijo (o 15 min en un rotor giratorio).</li>
		<li>Pipetee cuidadosamente el sobrenadante de plasma, teniendo cuidado de no molestar a ningún pellet y transferirlo a un nuevo tubo de 15 mL. Deseche el tubo que contiene el material peletizado.</li>
		<li>Centrifugar el plasma durante 10 min a 1.600 - 2.000 x g a 4 – 8 °C en un rotor de ángulo fijo (o 15 min en un rotor giratorio).</li>
		<li>Transfiera cuidadosamente el sobrenadante de plasma a un nuevo tubo de 15 mL, asegurándonos de no molestar a ningún material peletizado. Deseche el tubo que contiene el material peletizado. NOTA: Si una centrífuga refrigerada no está disponible, mantenga las células en el hielo durante 5 minutos entre cada giro, o muestras de centrífuga en una cámara frigorífica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir plasma en alícuotas de 1 mL en 5 microtubos frescos de 2 mL. Use menos de 5 viales si no hay suficiente plasma para llenar 5 viales con alícuotas de 1 ml y se espera que el último vial contenga menos de 1 ml de plasma. Si hay más de 5 mL de plasma, deseche el resto. Registre el volumen total de plasma en cada tubo.</li>
	<li>Congele inmediatamente las alícuotas de plasma en posición vertical, almacenándolas a -80 °C.</li>
</ol>5. Envío de muestras
<ol><li>Envíe tanto pellets de PBMC como muestras de plasma en hielo seco.</li>
	<li>Asegúrese de que la muestra no se descongele antes y durante el envío. Empaque suficiente hielo seco con las muestras para asegurarse de que permanezcan congeladas durante la totalidad del proceso de envío, considerando los posibles retrasos que puedan ocurrir en el tránsito.</li>
</ol>6. Irradiación de sangre entera y análisis de western blot de biomarcadores DDR (Figura 4A)
NOTA: Este es un tratamiento ex vivo que no será requerido en la mayoría de los casos en la clínica, pero estos experimentos son una estrategia exploratoria valiosa para encontrar biomarcadores clínicos adecuados. Las muestras de sangre deben tratarse tan pronto como sea posible en el momento de la recolección para garantizar los mejores resultados.
<ol><li>Caliente el gabinete de rayos X. Etiquete tres tubos de 15 mL como 0, 0.2 y 7 Gy, respectivamente.</li>
	<li>Tome tres tubos de preparación de células mononucleares que contengan sangre recién extraída de un solo individuo y después de invertir suavemente los tubos de 8 a 10 veces transfiera las sangres a los tres tubos de 15 mL.</li>
	<li>Coloque el tubo de 0,2 Gy en el gabinete de rayos X, cierre la puerta y aplique una dosis de 0,2 Gy al tubo seleccionando el número de estante y la dosis. Aplique la dosis de radiación de 7 Gy al tubo de 7 Gy ajustando la dosis seleccionada en el gabinete.</li>
	<li>Incubar los tres tubos a 37 °C durante una hora.</li>
	<li>Transferir la sangre de nuevo a los tubos de preparación de células mononucleares y llevar a cabo el protocolo de preparación de PBMC en cuanto a un entorno clínico de paso 2.4 a paso 3.8.</li>
	<li>Añadir un volumen de tampón de lisis complementado con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa igual al volumen del pellet celular (en este caso 70 μL de tampón RIPA) a cada uno de los pellets celulares, pipetear hacia arriba y hacia abajo e incubar sobre hielo durante 10 min. Sonicar las muestras si un sonicador está disponible (3 ciclos, 30 s ON / 30 s OFF, 4 °C), alternativamente jeringa las muestras para romper los ácidos nucleicos para eliminar la viscosidad en la muestra.</li>
	<li>Centrifugar las muestras durante 10 min a ≥ 15.000 x g,a 4 °C. Transfiera cada sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mL, evalúe cualitativamente el nivel de hemólisis (inspección visual) y mida la concentración de proteínas por cualquier método preferido.</li>
	<li>Mezcle 40 μg de lisato total con un tampón de carga de muestra que contenga SDS y agente reductor de muestras. Hervir las muestras durante 5 min en un bloque de calor.</li>
	<li>Cargue 20 μg de cada muestra por carril por duplicado en un gel de proteína bis-tris al 4-12% y ejecute un SDS-PAGE.</li>
	<li>Después de la separación, transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa utilizando un sistema disponible comercialmente (20 V, 10 min) y bloquee con leche al 5 % en TBST.</li>
	<li>Corte la membrana en los tamaños moleculares relevantes e incube con los anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C (ver Tabla de Materiales para anticuerpos y diluciones).</li>
	<li>Retire los anticuerpos primarios y lave las membranas 3 veces con TBST durante 5 minutos a temperatura ambiente. Incubar con los anticuerpos secundarios conjugados con HRP durante 45 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar 3 veces con TBST durante 5 min.</li>
	<li>Aplique el reactivo ECL y analice las imágenes obtenidas en relación con la señal HRP.</li>
</ol>

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</ol>

Todos los autores son o fueron empleados y accionistas de AstraZeneca. VM es un empleado de Acerta Pharma, posee acciones en AstraZeneca y Gilead Sciences.

Las preparaciones de alta calidad de PBMCs y plasma que se pueden preparar de manera robusta y reproducible en los sitios de ensayos clínicos son invaluables para informar los puntos finales de biomarcadores traslacionales predictivos y farmacodinámicos periféricos de los ensayos clínicos. Aquí hemos proporcionado un protocolo corto y claro que aborda los pasos típicamente problemáticos que hasta ahora han sido vulnerables a los errores de ejecución en un entorno de ensayo clínico. Sin embargo, el protocolo se puede optimizar aún más para cumplir con requisitos específicos, como las limitaciones de tiempo en el sitio clínico o el tipo de análisis posteriores (consulte Archivo suplementario).
Con este objetivo, hemos demostrado cómo aislar tanto los PBMCs como el plasma de la sangre entera utilizando tubos mononucleares de preparación celular para producir pellets de PBMC congelados y plasma congelado adecuado para una variedad de análisis aguas abajo. Hemos llamado la atención sobre los pasos de protocolo particularmente críticos que implican la centrifugación y la identificación de la capa de PBMC en el paso 2.5, y los pellets de PBMC en los pasos 3.3 y 3.6. Históricamente, donde los sitios clínicos a menudo han salido mal es en el ajuste de la centrífuga a las unidades correctas (confundiendo un valor de RCF o x g con un valor de RPM), retrasando el procesamiento de muestras de sangre, la temperatura y la presencia de grandes volúmenes de PBS por encima del pellet de células congeladas. En la mayoría de los rotores de centrífuga, la introducción errónea de un valor de x g como ajuste de RPM dará lugar a una subcentrifugación significativa con una capa de PBMC mal definida o ausente resultante, y un posible descarte inadvertido de PBMC durante los pasos de lavado debido a la peletización ineficiente de la celda. Sin embargo, existe la posibilidad de que una capa de PBMC no sea visible a pesar de usar los ajustes de centrifugación correctos y el adaptador del rotor si el paciente ha desarrollado leucopenia. Esta afección puede afectar a los pacientes inscritos en ensayos oncológicos debido a la quimioterapia o la radioterapia y debe considerarse. Otro punto crítico que se ha dejado claro en el protocolo es que las muestras deben procesarse dentro de 1-2 h de la extracción de sangre para disminuir la posibilidad de hemólisis que afecta negativamente el protocolo. Además, el objetivo de procesar las muestras durante la primera hora de la extracción de sangre reduce la variabilidad ex vivo, lo que puede tener un gran impacto en las lecturas farmacocinéticas y en los biomarcadores afectados por la preservación de la sangre o las vías de señalización activa, como es el caso que se muestra en la Figura 4. Los retrasos en el procesamiento de la muestra también pueden tener un efecto perjudicial en la viabilidad celular si las células van a ser criopreservadas34. Otro factor que puede afectar tanto al rendimiento como a la contaminación de glóbulos rojos es la temperatura de almacenamiento y centrifugación, que debe mantenerse a temperatura ambiente (18-25 °C). Las temperaturas más bajas aumentan la densidad del medio de gradiente de densidad, lo que resulta en un mayor grado de contaminación de glóbulos rojos y granulocitos, ya que estas células no se agregan también. Por otro lado, las temperaturas más altas conducen a PBMCs atrapados entre eritrocitos agregados, reduciendo así el rendimiento de la preparación15,27,28. Y por último, es crucial que no más de 50-100 μL de líquido estén presentes con el pellet celular en el criovial, ya que esto afecta negativamente la concentración de cualquier proteína de lisatos obtenidos en el procesamiento aguas abajo de estas preparaciones de PBMC. Un exceso de líquido sobredilute muestras, dando lugar a lisatos con muy baja concentración de proteínas no es adecuado para el análisis de biomarcadores. Además, la preservación de cualquier modificación post-traduccional se verá afectada, y la eficiencia de la lisis también se reducirá en gran medida.
Los tubos mononucleares de la preparación de la célula fueron elegidos pues ofrecen la manera más directa de aislar PBMCs y plasma en un solo sorteo de la sangre para los ensayos clínicos con, en nuestra experiencia, reproducibilidad excelente. El procesamiento de la sangre no requiere operadores altamente capacitados, y el uso de un solo tubo elimina la necesidad de diluir la sangre y su transferencia a un tubo diferente, lo que reduce el riesgo de peligro; acorta el protocolo debido a la realización de los pasos de centrifugación con los frenos encendidos; y todos los reactivos están en el tubo, lo que reduce la variabilidad. En nuestra experiencia, estos beneficios superan el mayor costo de estos tubos en comparación con otros métodos clásicos que comprenden solo el uso de un medio de separación de gradiente de densidad27,28 (£ 410 por 60 unidades, mientras que el medio de linfoprep para 66 preparaciones de 50 mL es de £ 215). Están disponibles en dos tipos de anticoagulantes, heparina y citrato, los cuales son comparables en el mantenimiento de la funcionalidad de los PBMCs aislados35,por lo tanto, la elección de un anticoagulante sobre el otro se basará en la posible influencia de la heparina o citrato en los estudios de biomarcadores aguas abajo. Si bien se ha demostrado que los tubos EDTA proporcionan el mayor rendimiento de aislamiento de PBMC en comparación con la heparina o el citrato13,el beneficio de la facilidad de uso de la manipulación de un solo tubo contrapesa esta consideración. Si se van a analizar citoquinas los anticoagulantes pueden tener un efecto de los niveles detectados en plasma, por lo tanto ambos anticoagulantes deben ser probados antes de seleccionar uno para el ensayo clínico36. Si el plasma va a ser utilizado para estudios metabolómicos, se preferiría el uso de heparina como anticoagulante37. Por lo tanto, el único punto que le queda al usuario final o al científico traslacional del ensayo clínico es si el citrato o la heparina serán más apropiados para sus fines una vez que se hayan evaluado los costos.
Si bien los beneficios del uso de tubos de preparación celular son numerosos en comparación con las limitaciones que plantean (mayor costo y disponibilidad de una gama restringida de anticoagulantes), la principal limitación del uso de PBMCs o plasma para obtener biomarcadores de EP en ensayos clínicos, especialmente en oncología, puede no estar relacionada con el método de aislamiento. A excepción de los cánceres hematológicos, donde el tumor se muestrea directamente de la sangre periférica, para otras indicaciones de cáncer, el plasma y los PBMCs son tejidos sustitutos que no necesariamente imitan el tumor primario. El tejido periférico puede no compartir el genoma y el epigenoma con el tumor primario, por lo tanto, el análisis periférico de los biomarcadores dependientes de una mutación tumoral específica se limita principalmente al análisis de ctDNA (a partir del plasma) o ctCs (mediante la clasificación posterior de la capa de PBMC). Además, las cascadas de señalización que conducen o contribuyen a la proliferación del tumor pueden no ser tan activas en sangre periférica. Este desafío puede superarse aplicando enfoques de descubrimiento de biomarcadores dirigidos a la sangre8 para identificar biomarcadores alternativos o acoplando tratamientos ex vivo al aislamiento de preparados de plasma38 y PBMC26.
En el protocolo actual, los pellets congelados de PBMC se pueden procesar fácilmente fuera del sitio clínico para dar lisatos proteicos que pueden ser evaluados por técnicas de western blotting o ELISA. También se han presentado métodos alternativos para utilizar PBMCs para habilitar los métodos IHC (Supplementary File). Además, también hemos detallado la posibilidad de criopreservar PBMCs (ver Archivo Suplementario)para la monitorización de células inmunitarias, una aplicación relevante en oncología, con inhibidores de puntos de control inmunes y ADC cada vez más probados en ensayos clínicos. La evaluación de funciones inmunitarias como el ADCC16 y el inmunofenotipado son aplicaciones compatibles con PBMCs criopreservados aislados de tubos de preparación celular mononuclear15. Existe una advertencia sobre la criopreservación, ya que puede promover la regulación a la baja de ciertos marcadores superficiales e internos y podría perjudicar ciertas funciones celulares, sin embargo, la criopreservación de PBMC es la única forma factible de realizar estos ensayos debido a las limitaciones de tiempo al manipular muestras de múltiples sitios clínicos para el procesamiento en laboratorios externos14,15,y estos efectos perjudiciales pueden ser superados en gran medida por buenos métodos de descongelación y períodos de descanso39.
En conclusión, el protocolo proporcionado aquí permitirá la preparación confiable de PBMCs y muestras de plasma en cualquier institución clínica con equipos y materiales comunes para que los criterios de valoración traslacionales de la sangre periférica puedan habilitarse sólidamente en ensayos clínicos globales.
Finalmente, se demuestra cómo el análisis de los lisatos de PBMC puede informar mecánicamente la respuesta a los agentes perjudiciales para el ADN mostrando una modificación postraduccional dependiente de la dosis de factores clave de DDR, que se puede utilizar para ayudar a dar forma al desarrollo clínico. La implementación prospectiva de métodos que son más cuantitativos que la western blotting (por ejemplo, espectrometría de masas40)y requieren menos material de entrada (como la western blotting capilar y ELISA) ayudaría a mover estos resultados preclínicos hacia una evaluación más robusta y sistemática de las muestras de pacientes con PBMC.

El desarrollo de fármacos tiene como objetivo ofrecer nuevas terapias que aborden las necesidades médicas insatisfechas y una medicina más específica y personalizada. Múltiples mecanismos farmacológicos están bajo investigación activa incluyendo la inhibición enzimática como la quinasa1,la proteasa2,o los inhibidores de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP)3,los degradadores de proteínas4,los anticuerpos terapéuticos5y los fármacos conjugados con anticuerpos (ADC)6,entre muchos otros. Un ejemplo de los esfuerzos por obtener mejores tratamientos en oncología es el uso de inhibidores de la quinasa con el objetivo de detener las cascadas de señalización que mantienen la proliferación de células cancerosas1,7. Medir los niveles de fosforilación del sustrato específicos de esas quinasas es el mejor biomarcador farmacodinámico para cuantificar el mecanismo de acción de estos inhibidores8. Otros fármacos pueden modular la expresión de una proteína dada, y en ese caso ser capaz de cuantificar los cambios en la concentración de su proteína diana longitudinalmente a lo largo del curso del tratamiento es primordial. Por lo tanto, independientemente de las características de un fármaco o una patología, la evaluación de biomarcadores para establecer la relación farmacocinética (PK)/farmacodinámica (DP) entre la exposición al fármaco y la modulación diana es la mejor práctica en el desarrollo clínico temprano y permite la determinación de una dosis/programa farmacológicamente activo seguro y tolerado9.
Mientras que en el desarrollo clínico oncológico, el análisis de biomarcadores en biopsias podría ser el mejor ajuste para establecer la prueba del mecanismo de un fármaco, el número de biopsias disponibles en un ensayo suele ser bastante limitado10,11. Alternativamente, las muestras de sangre periférica son altamente valiosas para los ensayos clínicos porque implican un procedimiento mínimamente invasivo, son rápidas y fáciles de obtener facilitando el análisis longitudinal, son menos costosas que las biopsias y proporcionan información vasta para el monitoreo en tiempo real del resultado de un tratamiento. Un beneficio adicional de la evaluación de los biomarcadores de DP en sangre periférica es la capacidad de utilizar la biomuestra para cuantificar también la PK, lo que permite determinar la exactitud en la determinación de las relaciones cuantitativas PK/PD y el posterior modelado de PK/PD12,13. Las células mononucleares de la sangre periférica (PBMCs) de la sangre entera se pueden aislar para estudiar los marcadores de la proteína, que experimentan cambios en su nivel de la expresión o en sus modificaciones poste-traduccionales. Además, los PBMCs se pueden utilizar para los propósitos del immunophenotyping14,15,análisis de la funcionalidad inmune tales como evaluación de la citotoxicidad celular anticuerpo-dependiente (ADCC)16 y análisis epigenéticos con el aislamiento del ARN. Asimismo, el plasma de sangre entera puede ser utilizado para cuantificar citoquinas para caracterizar la respuesta inmunológica de un paciente, para realizar estudios metabólicos, y también para aislar y secuenciar el ADN tumoral circulante (ctDNA) para el seguimiento de la evolución clonal de la enfermedad bajo selección del agente terapéutico, proporcionando frecuentemente una base mecanicista para la resistencia al tratamiento17,18,19 permitiendo el desarrollo de generaciones posteriores de terapéutica20. Finalmente, el aislamiento de las células tumorales circulantes (CTCs) de la sangre periférica permite la evaluación de la progresión de la enfermedad mediante enumeración longitudinal, secuenciación ADN/ARN y análisis proteína-biomarcadores21. A pesar de que este aislamiento es compatible con el protocolo aquí descrito22,la baja abundancia de CTCs en muchos tipos de cáncer y en las primeras etapas de la enfermedad hace que el uso de tubos especializados sea más adecuado para minimizar la degradación del CTC23.
En los últimos años, el uso de biopsias líquidas ha mejorado la información obtenida en ensayos clínicos y las colecciones de PBMC se han incluido en muchos estudios para monitorizar el compromiso diana y la prueba del mecanismo ya sea directamente en las células tumorales para algunos tipos de neoplasias hematológicas, o en los propios PBMCs como sustitutos de la EP de las células tumorales24,25,26. La preparación de muestras de alta calidad impacta positivamente en la determinación del tratamiento más seguro y eficaz para una patología dada, pero en nuestra experiencia, la calidad de las preparaciones de PBMC obtenidas de diferentes sitios clínicos ha sido sometida a una amplia variabilidad en la calidad, lo que resulta en muestras que no son adecuadas para el propósito del análisis aguas abajo. Esto ha afectado la cantidad de datos de DP que podrían recopilarse de esos estudios.
Aquí describimos detalladamente un fácil de seguir el protocolo que muestra cómo aislar eficientemente PBMCs y muestras del plasma de un solo extracto de sangre en un ajuste clínico. El protocolo se basa en las instrucciones proporcionadas por el fabricante de los tubos de preparación de células mononucleares, que incorpora modificaciones donde la experiencia del mundo real ha puesto de relieve las dificultades en la ejecución del protocolo según lo informado por los sitios clínicos, tales como problemas de centrifugación, retrasos en el procesamiento y la transferencia de muestras a crioviales. Existen métodos alternativos disponibles comercialmente al uso de tubos de preparación celular mononuclear basados en la separación por gradiente de densidad utilizando soluciones de polisacárido con o sin barrera que separa la solución de la sangre27. Si el sitio clínico relevante es ya bien experimentado en estas metodologías alternativas, este protocolo se puede substituir aceptable por éstos. En tales casos, se pueden considerar dos factores: algunos métodos alternativos requieren una transferencia de sangre entera de un tubo de recolección a un tubo de preparación separado donde una transferencia adicional de material biológico primario humano puede presentar un riesgo de seguridad ligeramente mayor, y el éxito de los métodos sin barreras que separan la sangre de la solución de polisacárido se basa en pasos críticos como la colocación de la muestra de sangre en el medio de gradiente de densidad que requiere el desarrollo de un nivel refinado de experiencia técnica que no siempre se encuentra en un entorno de laboratorio hospitalario. No obstante lo anterior, la viabilidad global y la recuperación celular son comparables entre estas técnicas15,28. La elección de la metodología es, por lo tanto, algo dependiente de la experiencia técnica previa, pero en nuestras manos, los tubos mononucleares de la preparación de la célula se pueden utilizar con éxito en un contexto clínico amplio y son nuestra, de otra manera, recomendación.
Mientras que uno de los puntos finales de este protocolo es producir pellets de PBMC para su posterior procesamiento en lisatos, se podrían implementar otras aplicaciones finales de la recolección de PBMC, como el aislamiento de ácidos nucleicos, o la producción de frotis de PBMC o bloques de PBMC adecuados para métodos de inmunohistoquímica (IHC). Es importante destacar que, dado que cada biomuestra tomada de pacientes representa un procedimiento invasivo en al menos algún nivel, este protocolo maximiza el material útil de cada muestra aislando también el plasma que se puede utilizar para análisis de citoquinas, estudios metabolómicos o secuenciación de ctDNA.
El análisis de biomarcadores periféricos en ensayos oncológicos es una de las muchas aplicaciones de los lisatos PBMC. Un ejemplo es la evaluación de la respuesta al daño en el ADN (DDR) en tratamientos como la quimioterapia, la radioterapia o el uso de inhibidores de enzimas implicadas en la DDR como las quinasas relacionadas con la fosfatidilinositol-3 quinasa (PIKKs)7 y las PARPs3,13. El objetivo de estos tratamientos es aumentar el daño al ADN en las células proliferantes, lo que genera una alta toxicidad en células con mecanismos de DDR deteriorados y puntos de control del ciclo celular, como las células cancerosas. Aquí presentamos un ejemplo con un estudio de biomarcadores DDR en sangre periférica sometida a rayos X.

<table><tbody><tr><td>Nacorial de 1,5 mL</td><td>Nalgene, ThermoFisher</td><td>5000-1020</td><td>Para almacenar pellets de PBMC y PBMC resuspendidos</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>525-0990</td><td>Este es un ejemplo, utilice su proveedor preferido</td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de propileno estéril cónico de 15 mL</td><td>Nunc, ThermoFisher</td><td>339651</td><td>Se pueden utilizar otras marcas</td></tr><tr><td>Tubo con tapón de rosca de 2 mL estéril, con tapón adjunto</td><td>ThermoFisher</td><td>3463</td><td>Para alícuota de plasma</td></tr><tr><td>20X TBS Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28358</td><td>Final es de 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. Este es un ejemplo, puede preparar su propio stock o utilizar un proveedor diferente</td></tr><tr><td>20X TBS Tween 20 Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28360</td><td>O complementar TBS con 0.05% para preparar TBST</td></tr><tr><td>buffer Contador de células automatizado o hemocitómetro</td><td>ThermoScientific AMQAX1000</td><td></td><td>Usamos el dispositivo Countess y diapositivas, pero podrían ser otros métodos.</td></tr><tr><td>Micropipeta ajustable que permite 50 &; Mediciones</td><td></td><td></td><td>de L Para manejar volúmenes pequeños (es decir, Western blot, transfiera los gránulos de PBMC a tubos de 1,5 mL)</td></tr><tr><td>Tubo de preparación de células mononucleares BD Vacutainer CPT (Na-citrato o Na-heparina) 8 mL</td><td></td><td>BD 362761, 362753</td><td>Hay tubos de 4 mL, pero si es posible, se recomiendan tubos de 8 mL para obtener más PBMC de una sola extracción de sangre</td></tr><tr><td>Caja de congelación de células</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Este es un ejemplo, use su proveedor preferido.</td></tr><tr><td>Convertidor de unidad de centrifugación</td><td>LabTools</td><td></td><td>http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/</td></tr> <tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, MERK</td><td>D2438</td><td>Utilice su proveedor preferido. Ued para la criopreservación de PBMC</td></tr><tr><td>ECL sustrato de peroxidasa de rábano picante</td><td>ThermoFisher</td><td>34075</td><td>Utilice su reactivo preferido de acuerdo con la sensibilidad requerida para detectar su biomarcador por Western blot. Se pueden utilizar otros sistemas, como los anticuerpos secundarios IRDye con sistemas de imagen.</td></tr><tr><td>Cabina de rayos X Faxitron MultiFocus</td><td>Faxitron Bioptics</td><td></td><td>Para irradiar sangre. Hay otros modelos/fabricantes disponibles</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS), ThermoScientific inactivado por calor</td><td>102706</td><td></td><td>Utilice su proveedor preferido. Ued para la criopreservación de PBMC</td></tr><tr><td>Punta fina, estéril 1,5 mL Pipetas Pasteur</td><td>VWR</td><td>414004-018</td><td>Opcional</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td> de rotor de ángulo fijo <td>Opcional para la preparación de plasma para ctDNA/metabolómica</td></tr><tr><td>Sistema de imagen Gel doc</td><td>SYNGENE</td><td></td><td>Para la adquisición de imágenes Membranas desarrolladas por HRP</td></tr><tr><td>Bloque</td><td></td><td></td> <td>de calorPara desnaturalizar los lisados antes de ejecutarlos en Western blot, cualquier fabricante equipado con adaptadores de tubo adecuados</td></tr><tr><td>Centrífuga de rotor horizontal (cabezal basculante)</td><td>Termocientífico</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>Este es un ejemplo</td></tr><tr><td>Nitrógeno líquido/hielo</td><td></td><td></td> seco <td>Para congelar muestras</td></tr> rápidamente <tr><td>Leche desnatada en polvo Marvel</td><td>Premier Foods</td><td></td><td>Este es un ejemplo, utilice su proveedor preferido</td></tr><tr><td>Puntas de micropipeta para la gama 1-200 y micro; L</td><td></td><td></td><td>Para manejar volúmenes pequeños (es decir, Western blot, transfiera los gránulos de PBMC a tubos de 1,5 mL)</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Gel de proteína Bis-Tris, 1 mm, 10 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td>Este es un ejemplo, lance el suyo propio o use su proveedor preferido</td></tr><tr><td>Tampón de muestra NuPAGE LDS (4X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0007</td><td>Para la adquisición de imágenes Membranas desarrolladas por HRP</td></tr><tr><td>Agente reductor de muestras NuPAGE (10X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0009</td><td>Este es un ejemplo.</td></tr><tr><td>PBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Gibco, ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td>Por lo general, se proporciona en el kit clínico.</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la fosfatasa 2</td><td>Sigma-Aldrich, MERK</td><td>P5726-1ML</td><td>Opcional para el paso 3.7</td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la fosfatasa 3</td><td>Sigma-Aldrich, MERK</td><td>P0044-1ML</td><td>Opcional para el paso 3.7</td></tr><tr><td>Conejo anti GAPDH</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>CST 2128</td><td>Dilución 1:1000 en leche al 5% TBST</td></tr><tr><td>Conejo anti y gamma; H2AX</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>CST 2577, lote 11</td> dilución <td>1:2000 en leche al 5 % TBST</td></tr><tr><td>Conejo anti pS1981 ATM</td><td>Abcam</td><td>ab81292</td><td>dilución 1:2000 en leche al 5 % TBST</td></tr><tr><td>Conejo anti pS635 RAD50</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>CST 14223</td><td>1:1000 dilución en leche al 5 % TBST</td></tr><tr><td>Conejo anti total ATM</td><td>Abcam</td><td>ab32420</td><td>1:1000 dilución en leche al 5 % TBST</td></tr><tr><td>Conejo anti total RAD50</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>CST 3427, lote 2</td><td>dilución 1:1000 en leche al 5 % TBST</td></tr><tr><td>Tampón RIPA</td><td>Sigma-Aldrich, MERK</td><td>R0278-50ML</td><td>Para lisis celular. Este es un ejemplo, use su proveedor preferido</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Diagenode</td><td>B01060010</td><td>Se usa durante 3 ciclos a 30 s encendido/30 s apagado, 4 oC. Si utiliza un instrumento diferente, ajuste el número de ciclos y la intensidad según su sonicador.</td></tr><tr><td>Pipetas estériles Pasteur de 1,7 ml</td><td>VWR</td><td>414004-030</td><td>Este es un ejemplo, utilice su proveedor preferido</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estériles (volumen de 5 y 10 ml)</td><td>Costar</td><td>4101, 4051</td><td>Este es un ejemplo, utilice su proveedor preferido</td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>ThermoScientific</td><td>T10282</td><td>Esto es para el contador de células automatizado mencionado anteriormente.</td></tr><tr><td>Hielo</td><td></td><td></td> húmedo <td>Para mantener frías las muestras de plasma y los lisados</td></tr></tbody></table>

preparación de pellets de células mononucleares de sangre periférica y plasma de una sola extracción de sangre en los sitios de ensayos clínicos para el análisis de biomarcadores

Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

El análisis de biomarcadores en sangre periférica se está volviendo cada vez más importante en los ensayos clínicos para establecer pruebas del mecanismo para evaluar los efectos del tratamiento y ayudar a guiar la configuración de la dosis y el calendario de la terapéutica. De un solo extracto de sangre, las células mononucleares de la sangre periférica se pueden aislar y para procesar para analizar y para cuantificar marcadores de la proteína, y las muestras del plasma se pueden utilizar para el análisis de la DNA de circulación del tumor, de los cytokines, y del plasma metabolomics. Las muestras longitudinales de un tratamiento proporcionan información sobre la evolución de un marcador de proteína dado, el estado mutacional y el paisaje inmunológico del paciente. Esto solo se puede lograr si el procesamiento de la sangre periférica se lleva a cabo de manera efectiva en los sitios clínicos y las muestras se conservan adecuadamente desde la cabecera hasta el banco. Aquí, presentamos un protocolo optimizado de propósito general que se puede implementar en los sitios clínicos para la obtención de pellets de PBMC y muestras de plasma en ensayos clínicos multicéntricos, que permitirá a los profesionales clínicos en los laboratorios hospitalarios proporcionar con éxito muestras de alta calidad, independientemente de su nivel de experiencia técnica. También se presentan variaciones de protocolo alternativas que están optimizadas para métodos analíticos posteriores más específicos. Aplicamos este protocolo para estudiar los biomarcadores de la proteína contra la respuesta del daño de la DNA (DDR) en sangre irradiada radiografía para demostrar la conveniencia del acercamiento en ajustes de la oncología donde las drogas de DDR y/o la radioterapia se han practicado así como en las etapas preclínicas donde se requiere la prueba mecanicista de la hipótesis.

Para mejorar la calidad de las preparaciones de PBMC en nuestros ensayos clínicos, hemos generado un protocolo con pasos concisos y claros que pueden ser seguidos por los profesionales de laboratorio del hospital, independientemente de sus antecedentes en biología molecular y habilidades de laboratorio. Hemos adaptado el protocolo del fabricante incorporando modificaciones en aquellos pasos donde se han identificado o reportado problemas de ejecución desde sitios clínicos involucrados en varios ensayos clínicos multicéntricos. Sin embargo, el protocolo se puede optimizar aún más para cumplir con requisitos específicos, como las limitaciones de tiempo en el sitio clínico o el tipo de análisis posteriores (consulte Archivo suplementario). Demostramos que el DDR se puede analizar en PBMCs mirando los biomarkers específicos sobre el daño de la DNA generado por la radiación.
Las consultas más comunes que hemos recibido de los sitios clínicos se refieren a los pasos de centrifugación, que impactan directamente en poder aislar con éxito los PBMCs y obtener el pellet final de PBMC. El uso del tipo apropiado de centrífuga de rotor de cabeza giratoria (Figura 1B,C) es la clave para el éxito del protocolo. Sin embargo, cuando sólo una centrífuga de rotor de ángulo fijo está disponible en el sitio clínico, sugerimos llevar a cabo el paso 2.4 en un rotor de ángulo fijo en el mismo RCF que para un rotor de cabeza giratoria pero por sólo 10 minutos. Esto asegura que una capa de PBMC esté separada del plasma, (ver Figura 2B,C). Mientras que la colocación de sangre en capas en un medio de separación de gradiente de densidad requiere una centrifugación de frenado, la sangre en tubos de preparación celular mononuclear puede ser centrifugado con los frenos encendidos debido a la presencia de una barrera de gel en el tubo que asegura la preservación de la capa de PBMC separada de los componentes sanguíneos más densos27,28.
Se obtuvieron al menos 4 mL de plasma no diluido de alta calidad a partir de la centrifugación de la sangre en el formato de tubo de 8 mL, que podría aclararse para su uso en análisis especializados como la secuenciación de ctDNA o estudios metabolómicos29,30 (pasos opcionales 4.1.1-4.1.4). La cantidad de PBMCs aislados, el tamaño de los pellets y la hemólisis o la contaminación de glóbulos rojos han sido otras preocupaciones provenientes de los sitios clínicos y la experiencia analizando muestras. El número de células obtenidas a partir de 8 mL de sangre fue variable en función del paciente y del entorno de la enfermedad, pero en general el pellet obtenido es de pequeño tamaño, y de una coloración transparente/blanca(Figura 3A,B). Debido a estas características, es importante visualizar el pellet sobre un fondo oscuro para evitar su aspiración accidental durante los pasos de lavado (2.5 y 3.3). A veces los pellets pueden tener cierta coloración roja debido a la contaminación de glóbulos rojos(Figura 3C),y esto tiene un efecto negativo en la calidad de la preparación. Para evitar la pérdida de pellets pequeños como los que se muestran en la Figura 3,la transferencia del pellet de PBMC a un criovial se facilita mediante el paso 3.7 donde el pellet de PBMC se resuspende en 50 μL de PBS.
El rendimiento típico al utilizar estos tubos y sangre de individuos sanos oscila entre 7 a 21 x 106 células durante 8 mL, y una recuperación celular entre el 70 y el 80% como es nuestra experiencia y como se ha demostradoanteriormente 27,28. Esto depende tanto del recuento de células individuales como del operador y es comparable a los números de celda y los valores de recuperación celular obtenidos por otros métodos que utilizan gradiente de densidad (incluidos los sistemas que utilizan tubos con una barrera de separación)15,27,28. Un ejemplo ilustrativo de la variación en el número de PBMCs aislados con este método dependiendo del ajuste de la enfermedad es el análisis de los marcadores de PBMC en pacientes crónicos de la leucemia linfocítica (CLL). El número de células recuperadas de un tubo de preparación celular mononuclear de 8 mL al aplicar este protocolo varió de 1,62 x10 4 a 1,99 x 109 en 45 muestras obtenidas de 7 pacientes en estudio NCT0332827331 (Tabla 1). Un parámetro relacionado es la concentración de proteínas de los lisatos de PBMC obtenida por este método, y esto depende del número de células aisladas y de la eficiencia de la extracción de proteínas. Los pellets celulares liseados en la sección 6 se generaron con tampón RIPA y sonicación (paso 6.6). La resuspensión de los pellets celulares en su mismo volumen de tampón de lisis generalmente resulta en un rango de concentraciones de 3 a 10 mg/mL, y en este ejemplo particular las concentraciones de lisiado fueron de 6,8, 8,3 y 8,6 mg/mL para 0, 0,2 y 7 Gy, respectivamente. Sin embargo, esto se somete a una alta variabilidad al recibir muestras de sitios clínicos que no han sido preparados de manera óptima, la enfermedad del paciente y la presencia de hemoglobina por contaminación de glóbulos rojos. Por ejemplo, los pellets muy pequeños necesitan ser resuspended en un volumen de tampón de lisis mayor que el volumen de pellets celulares para permitir tanto la medición de la concentración de proteínas como el análisis de biomarcadores aguas abajo, lo que resulta en muestras más diluidas. En tal caso, si una concentración de la muestra está debajo de 1 mg/mL esto puede plantear un desafío para realizar análisis como western blot debido a este alto factor de dilución. En contraste, en las muestras de CLL mencionadas anteriormente, el volumen de tampón de lisis añadido para resuspend los pellets celulares varió de 50 a 500 μL, y la concentración de proteínas abarcó de 1,62 a 19,77 mg/mL(Tabla 1).
Cuando las muestras presentan contaminación de glóbulos rojos o hemólisis(Figura 3C),la concentración de proteínas del lisiado de PBMC se sobreestima debido a la inclusión de hemoglobina de los eritrocitos. Esta es la razón por la que se debe hacer una inspección visual y anotación de tales muestras, como se describe en el paso 6.7 del protocolo. La muestra de carga en exceso puede compensar la presencia de hemoglobina al realizar el análisis de biomarcadores en la medida en que se incluya un control de carga en el ensayo. Se podrían implementar otros métodos más cuantitativos para medir la hemólisis, como la medición de la absorbancia a 414 nm32.
El DDR era analizado en PBMCs obtenido siguiendo este protocolo clínico. Para ilustrar una situación que imita tratamientos clínicos perjudiciales para el ADN, como la radioterapia o la quimioterapia, la sangre entera de voluntarios sanos fue sometida ex vivo a la radiación de rayos X (Figura 4A). La radiación ionizante (IR) como los rayos X induce diferentes tipos de daño en el ADN, incluidas las roturas de doble cadena (DSB) del ADN. La detección del daño de la DNA de estas lesiones activa PIKKs tales como ataxia-telangiectasia mutada (atmósfera), atmósfera y Rad3-related (ATR) y cinasa de proteína DNA-dependiente (DNA-PK), que enganchan mecanismos de la reparación de la DNA como la recombinación homóloga (hora) o el extremo no-homólogo que se une (NHEJ). La activación de ATM por la presencia de DSBs se produce por su reclutamiento a sitios de daño por el complejo MRN (MRE11-RAD50-NBS1), causando autofosforilación ATM en varios residuos incluyendo Ser1981. A su vez, el ATM activado fosforila los componentes del complejo MRN y otras proteínas como la variante de histonas H2AX en Ser139 (donde pSer139-H2AX también se conoce como γH2AX) para promover un cambio estructural en la cromatina que abarca desde el DSB que facilita el reclutamiento de otros factores DDR33. Los PBMCs son sensibles a la radiación ionizante a pesar de su baja tasa de proliferación y los métodos de espectrometría de masas han permitido la cuantificación de la regulación al alza de Ser635 fosforilado en RAD50 por ATM. Esta fosforilación se reduce en presencia de inhibidores de ATM y RAD50 pS635 ha sido validado además como biomarcador farmacodinámico para tratamientos clínicos inhibidores de ATM en tumores por inmunohistoquímica8. Para evaluar la respuesta de los PBMCs a la radiación, la sangre de voluntarios sanos fue sometida a diferentes dosis de IR y se recogieron muestras después de una incubación de 1 h a 37 °C (Figura 4A). Para ello, se transfirieron sangres a tubos de plástico para evitar la reducción del rendimiento del aislamiento de PBMC debido a la alta temperatura (paso 6.2). Se analizó cómo se activó atm no sólo mediante la mirada en el RAD50 pS635 previamente reportado, sino también ATM pS1981 y γH2AX. En los tres casos examinados se observó un aumento de estas modificaciones postraduccionales a dosis de IR más altas(Figura 4B). Curiosamente, la fosforilación de ATM y RAD50 fue sustancial en la dosis baja de 0,2 GY, lo que sugiere que estas modificaciones postraduccionales pueden ser interrogadas factiblemente como biomarcadores de DP para tratamientos que implican la generación de ADN DSBs con un buen rango dinámico, no sólo en muestras de tumores sino en sangre periférica. Esto permite el seguimiento de la respuesta de la DP al tratamiento mediante la adquisición de muestras longitudinales a lo largo del tratamiento. El momento desde la extracción de sangre hasta el procesamiento de las muestras es fundamental para garantizar que estas cascadas de señalización aún estén activas, ya que los retrasos en el procesamiento afectarán a la cinética de dichas cascadas y uno podría pasar por alto los eventos de fosforilación utilizados como fosfomarkers.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig04.jpg"> Figura 4: Los PBMCs aislados de sangre irradiada ex vivo siguiendo el presente protocolo clínico muestran biomarcadores para informar sobre el alcance del daño en el ADN causado por el tratamiento. (A) Descripción esquemática del protocolo para la preparación de PBMCs y análisis del DDR sobre la irradiación de la entero-sangre. *2 pasos adicionales de centrifugación requeridos para el análisis/metabolómica de ctDNA. (B) Western blot que muestra la regulación al alza dependiente de la dosis de los fosfomarcadores DDR en los PBMCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Muestra</td>
			<td>Número de PBMCs/ 8 mL de sangre</td>
			<td>Volumen de búfer RIPA complementado (μL)</td>
			<td>Concentración final (mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.1</td>
			<td>39100000</td>
			<td>70</td>
			<td>12.16</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.2</td>
			<td>97400000</td>
			<td>100</td>
			<td>4.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.3</td>
			<td>233000000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.4</td>
			<td>316000000</td>
			<td>150</td>
			<td>16.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.5</td>
			<td>387000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.60</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.6</td>
			<td>459000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.71</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.7</td>
			<td>414000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.67</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.8</td>
			<td>253000000</td>
			<td>150</td>
			<td>14.56</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.9</td>
			<td>509000000</td>
			<td>300</td>
			<td>10.67</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.1</td>
			<td>15200000</td>
			<td>70</td>
			<td>2.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.2</td>
			<td>10500000</td>
			<td>50</td>
			<td>4.59</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.3</td>
			<td>13200000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.99</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.4</td>
			<td>34800000</td>
			<td>100</td>
			<td>10.41</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.5</td>
			<td>1620000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.6</td>
			<td>70200000</td>
			<td>100</td>
			<td>9.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.7</td>
			<td>65400000</td>
			<td>100</td>
			<td>12.10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.8</td>
			<td>91100000</td>
			<td>150</td>
			<td>11.82</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.1</td>
			<td>6330000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.2</td>
			<td>4400000</td>
			<td>150</td>
			<td>19.77</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.3</td>
			<td>68000000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.4</td>
			<td>35100000</td>
			<td>50</td>
			<td>9.30</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.5</td>
			<td>35400000</td>
			<td>70</td>
			<td>10.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.6</td>
			<td>99200000</td>
			<td>100</td>
			<td>16.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.1</td>
			<td>402000000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.23</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.2</td>
			<td>826000000</td>
			<td>300</td>
			<td>16.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.3</td>
			<td>1990000000</td>
			<td>300</td>
			<td>14.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.4</td>
			<td>1000000000</td>
			<td>300</td>
			<td>18.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.5</td>
			<td>1160000000</td>
			<td>400</td>
			<td>16.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.6</td>
			<td>806000000</td>
			<td>400</td>
			<td>19.40</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.1</td>
			<td>302000000</td>
			<td>300</td>
			<td>13.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>S.2</td>
			<td>990000000</td>
			<td>500</td>
			<td>19.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>S.3</td>
			<td>1200000000</td>
			<td>400</td>
			<td>17.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.1</td>
			<td>4010000</td>
			<td>50</td>
			<td>1.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.2</td>
			<td>5170000</td>
			<td>50</td>
			<td>2.84</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.3</td>
			<td>2810000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.69</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.4</td>
			<td>3700000</td>
			<td>75</td>
			<td>3.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.5</td>
			<td>3460000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.6</td>
			<td>7060000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.32</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.1</td>
			<td>60700000</td>
			<td>70</td>
			<td>6.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.2</td>
			<td>82100000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.3</td>
			<td>30500000</td>
			<td>70</td>
			<td>8.28</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.4</td>
			<td>134000000</td>
			<td>100</td>
			<td>15.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.5</td>
			<td>91900000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.61</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.6</td>
			<td>372000000</td>
			<td>150</td>
			<td>15.88</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.7</td>
			<td>574000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.01</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Muestras longitudinales de PBMC correspondientes a 7 pacientes</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Número celular y concentración de proteínas de pellets de PBMC de pacientes con leucemia linfocítica crónica (LLC). Los datos presentados en esta tabla corresponden a 45 muestras de PBMC de 7 pacientes con LLC que participaron en el estudio NCT03328273 recolectadas en tubos de preparación celular mononuclear. Se trata de datos originales generados a partir de muestras del estudio citado31.
Archivo suplementario: Opciones de protocolo alternativas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60776/SupplementaryFile_July2020.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo detalla la preparación clínicamente implementable de biomuestras de PBMC y plasma de alta calidad en el sitio del ensayo clínico que se pueden utilizar para el análisis de biomarcadores traslacionales.

Preparación De Pellets De Células Mononucleares De Sangre Periférica Y Plasma De Una Sola Extracción De Sangre En Los Sitios De Ensayos Clínicos Para El Análisis De Biomarcadores

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of ...

Pbmc y muestras de plasma son fáciles de adquirir y altamente informativo en el desarrollo clínico temprano. Este protocolo robusto minimiza la variabilidad preanalítica introducida en los sitios clínicos. Este protocolo es rápido y fácil, y requiere equipo de laboratorio básico y una experiencia mínima del operador para procesar la sangre en PBMCs y plasma.Es compatible con los ajetreados días de laboratorio en los hospitales. El análisis aguas abajo de los componentes sanguíneos resultantes de este protocolo puede informar las relaciones farmacocinéticas y farmacodinámicas, la programación de la dosis de fármacos y la prueba del compromiso objetivo y proporcionar información sobre los mecanismos de acción de los fármacos, apoyando tanto el análisis en tiempo real como el introspectivo. Utilizamos este protocolo para estudios oncológicos, específicamente para analizar los mecanismos de respuesta al daño del ADN.Sin embargo, los materiales recogidos por este protocolo pueden ser relevantes a través de muchas áreas de la enfermedad y de modalidades terapéuticas múltiples. Después de recibir ocho mililitros de sangre de donante por muestra, registre el momento en que se extrajo la sangre e invierta suavemente cada tubo de ocho a 10 veces antes de transferir las muestras de sangre tratadas con anticoagulantes a cada uno de los tubos etiquetados para la radiación. Para muestras clínicas, centrífuga los tubos justo después de invertirlos.Coloque los 0,2 tubos grises en un gabinete de rayos X precalentado, cierre la puerta y aplique una dosis de 0,2 grises a los tubos. Substituya los tubos irradiados en dosis bajas por los siete tubos grises y ajuste la dosis para aplicar una dosis de radiación de siete grises a las muestras de irradiación de dosis altas. Después de que ambas muestras hayan sido irradiadas, incube los tres tubos a 37 grados Centígrados durante una hora.Transfiera las muestras a tubos de preparación celular antes de separar las células con centrifugación de alta velocidad, asegurándose de establecer las unidades como x g o RCF equivalente. Después de la centrifugación, vea los tubos contra un fondo oscuro para identificar el plasma, los glóbulos rojos y las capas de la capa buffy. Usando una pipeta serológica, transfiera aproximadamente la mitad del plasma a una centrifugadora cónica etiquetada de 15 mililitros sin alterar la capa de la capa buffy y almacene el tubo de plasma en hielo húmedo.Luego, use una pipeta de pasto para transferir toda la capa de recubrimiento buffy que contiene PBMC a un nuevo tubo de 15 mililitros y agregue PBS a temperatura ambiente al PBMC a un volumen final de 15 mililitros por muestra. Mezcle suavemente las células por inversión cinco veces y recoja las células por centrifugación a una velocidad más baja, asegurándose de verificar las unidades de centrifugación. Aspirar todos menos los últimos 500 microlitros de sobrenadante sin molestar a los pellets.Agregue PBS fresco a un volumen final de 10 mililitros a cada tubo y resuspend invirtiendo suavemente los tubos. Utilice 40 alícuotas microlitro de las células para contar. Después de contar, recoger las células con otra centrifugación y eliminar tanto sobrenadante como sea posible sin molestar a los pellets.Para almacenar el PBMC para su posterior procesamiento, resuspend los pellets en 50 microlitros de PBS fresco por muestra con pipeteo suave y transferir cada suspensión de célula entera en un criovial etiquetado de 1,5 mililitros sobre hielo húmedo. Luego congele las celdas por el método preferido y colótelas en una caja de congelación a menos 80 grados. Registre la hora a la que se congelaron las celdas.Alternativamente, resuspend los pellets en un mililitro o mezcla de congelación por muestra y transferir las suspensiones celulares a crioviales etiquetados individuales. Luego coloque los tubos y las cajas de congelación preenfriadas para un almacenamiento de menos 80 grados Celsius. Para congelar el plasma, agregue hasta un mililitro alícuotas lotes del plasma hasta cada uno de cinco microtubos de dos mililitros sin alterar el pellet residual y registre el volumen total de plasma en cada tubo.Luego, congele inmediatamente las alícuotas de plasma en una orientación vertical en un congelador de menos 80 grados Celsius. Para el análisis de Western blot de las muestras, resuspend el pellet en cada tubo con un volumen apropiado de tampón de lisis complementado con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa igual al del volumen de pellets celulares con pipeteo suave e incubar las muestras de células durante 10 minutos en hielo. Al final de la incubación, transfiera las muestras a 1.5 tubos de mililitro y sonicéelos con tres ciclos de 30 segundos en 30 segundos a cuatro grados Celsius.Recoger las muestras por centrifugación y transferir los sobrenadantes a nuevos tubos de 1,5 mililitros. Luego, mezcle 40 microgramos por muestra con el tampón de carga y hierva las muestras durante cinco minutos. Cargue 20 microgramos de cada muestra por carril por duplicado en un gel de proteína 4-12% Bis-Tris y ejecute un SDS-PAGE.El número de células obtenidas de ocho mililitros de sangre varía según el paciente y el ajuste de la enfermedad. En general, el pellet celular es pequeño en tamaño y blanco transparente en color. A veces, los pellets pueden tener cierta contaminación de glóbulos rojos, lo que tiene un efecto negativo en la calidad de la preparación.Una producción típica de un paciente crónico de la leucemia linfocítica usando este protocolo varía a partir de la 1,62 por 10 al cuarto a 1,99 por 10 a las novenas células por la preparación mononuclear de la célula de ocho mililitros con una concentración final de la proteína que se extiende entre 1,62 a 19,77 miligramos por mililitro. En este análisis representativo de tres muestras de pacientes, se observó un aumento en las modificaciones postraduccionales a dosis más altas de radiación ionizante. Curiosamente, la fosforilación de la ataxia-telangiectasia mutada y RAD50 fue sustancial en la dosis baja de 0,2 grises, lo que sugiere que estas modificaciones postraduccionales pueden ser interrogadas factiblemente como biomarcadores farmacodinámicos para los tratamientos que implican la generación de roturas de doble cadena de ADN con un buen rango dinámico en el tumor, así como muestras de sangre periférica.Para una preparación óptima de la muestra, procese la sangre dentro de una hora de la recolección a temperatura ambiente, centrifugse las muestras correctamente y vea el tubo contra el fondo oscuro para poder distinguir la capa buffy.

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En este informe, demuestran los pasos de tinción y análisis de un ensayo de fenotipo realiza en la sangre entera fresca para enumerar las principales poblaciones de leucocitos innatos y adaptativos. Hacemos hincapié en las consideraciones para llevar a cabo estos procedimientos en el contexto de un ensayo clínico multicéntrico.

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Aprende a preparar pellets de células mononucleares de sangre periférica y plasma de una sola extracción sanguínea para análisis de biomarcadores en ensayos clínicos oncológicos.

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Preparación De Pellets De Células Mononucleares De Sangre Periférica Y Plasma De Una Sola Extracción De Sangre En Los Sitios De Ensayos Clínicos Para El Análisis De Biomarcadores

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