Name: Dar el siguiente paso: un modelo de trasplante de extremidades hindópicos ortotópicos de coaptación neuronal para maximizar la recuperación funcional en rata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Aprende a realizar un trasplante ortotópico de extremidad posterior en rata mediante microcirugía vascular y coaptación neural. Este modelo permite estudiar la recuperación funcional y las respuestas inmunológicas en trasplantes de tejidos compuestos vascularizados.

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Este trabajo fue financiado por la Fundación Frankel y el Northwestern Memorial Hospital McCormick Grant (Operación RESTORE). La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Generales De la Salud de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio T32GM008152. Este trabajo fue apoyado por el Núcleo de Microcirugía de la Universidad Northwestern y el Núcleo de Fenotipado Conductual.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern. Los procedimientos específicos se realizaron bajo el protocolo IS00001663.
NOTA: Se utilizaron dos cepas de ratas, ratas Lewis y ratas August Copenhagen x Irish (ACI). Los animales se dividieron en tres grupos de tratamiento: atransplante sin supresión inmune (ACI a Lewis), atransplano con supresión inmune convencional (ACI a Lewis), e isotransplano (Lewis a Lewis o ACI a ACI). Lewis es una cepa endogácida, mientras que las ratas ACI representan un tipo salvaje de razas paralelas, por lo tanto esta combinación fue elegida para modelar la respuesta de rechazo en peor caso. La inmunosupresión convencional se administró por vía subcutánea, ya sea como rapamicina 1 mg/kg desde el día postoperatorio (POD) menos 1 a POD 28 o como FK506 3 mg/kg de POD 0 a POD 14, y luego una vez por semana a partir de entonces. Tanto las ratas macho como las hembras eran receptoras elegibles de 8 a 16 semanas de edad, con un peso de entre 250 y 400 gramos en el momento de la cirugía.
1. Cosecha de las extremidades traseras derecha del donante
<ol><li>Inducir anestesia general con 5% de isoflurano en oxígeno puro a través de un vaporizador con un sistema de barrido adecuado.</li>
	<li>Confirme la profundidad adecuada de la anestesia con pellizcar el dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del de la mano, y luego use cortapelos para recortar el pelaje de la extremidad posterior derecha y el sitio quirúrgico de la ingle derecha</li>
	<li>Valorar hacia abajo el isoflurano a través de un cono nasal de roedor a 2-2,5%.</li>
	<li>Coloque la rata supina con las extremidades extendidas pegadas a los lados en una placa de operaciones con una almohadilla de calentamiento debajo. Desinfectar la piel sin pelo con 70% de alcohol de frotar y proteger el campo quirúrgico con gasa estéril.</li>
	<li>Usando un microscopio microquirúrgico apropiado, instrumentos microquirúrgicos, y con fácil acceso a la electrocauterización bipolar y monopolar, comienzan la disección.</li>
	<li>Usa tijeras para hacer una incisión de piel/tejido subcutáneo circunferencial alrededor de la extremidad posterior derecha. Comience en el pliegue inguinal medialmente aproximadamente al mismo nivel que el ligamento inguinal y extienda dorsal-lateralmente para completar la incisión circunferencial.</li>
	<li>Después de haber expuesto la capa muscular directamente debajo de la incisión, diseccionar y cauterizar los vasos epigástricos superficiales que conducen desde la capa muscular a la piel proximal / colgajo subcutáneo acaba de crear.</li>
	<li>Refleja el colgajo proximal casimedialmente al ligamento inguinal y la piel distal/colgajo subcutáneo inferolateralmente a la rodilla.</li>
	<li>Utilice un retractor de alambre o una gasa enrollada para ayudar a exponer el campo.</li>
	<li>Observe que la anatomía inguinal de la rata es similar a los humanos; de lateral a medial se encuentran el nervio, la arteria y la vena.</li>
	<li>Diseccionar el nervio femoral, dividirlo bruscamente en el ligamento inguinal, proximal a la bifurcación si es posible. Retirar el nervio dividido inferiormente, manteniéndolo a salvo fuera del camino, cubierto bajo gasa húmeda.</li>
	<li>Volviendo la atención a la arteria femoral y la vena, utilice lazos de seda de 4 cm 7-0 para retraer los vasos de forma atraumática en lugar de manipularlos directamente.</li>
	<li>Ligar todas las ramas de los vasos femorales a medida que surgen con 7-0 lazos de seda; dividir las ramas entre los lazos. Para ramas muy pequeñas, se puede utilizar cautey bipolar en lugar de corbatas. NOTA: Las ramas arteriales y venosas que requieren división incluyen el circunflejo superficial ilíaco y los vasos musculares. El circunflejo iliac superficial es generalmente más grande y parece sumergirse profundamente como lo haría la femoral profunda en los seres humanos, pero la profundidad está ausente en la rata15. Las ramas más distales de los vasos femorales como la rama genicular más alta y la rama safenosa no suelen requerir división.</li>
	<li>Inyectar sistémicamente 500 unidades internacionales de heparina a través de la vena del pene en un donante de ratas macho. Utilice la vena epigástrica superficial si la rata donante es hembra.</li>
	<li>Permita que la heparina circule sistémicamente durante 2 minutos antes de continuar con los siguientes pasos.</li>
	<li>Ligar la arteria femoral con lazos de seda 7-0 tan proximales al ligamento inguinal como sea posible y dividir entre los lazos.</li>
	<li>Similar a la arteria, ligar y dividir la vena femoral.</li>
	<li>Reflejar la arteria y la vena de manera inferior, segura fuera del camino, cubierto debajo de la gasa húmeda junto con el nervio femoral cubierto previamente. Diseccionar los grupos musculares ventrales, teniendo cuidado de cauterizar cualquier vaso visible que surja. La atención a la hemostasia aquí minimizará la pérdida de sangre del receptor después de la reperfusión.</li>
	<li>Profundo a los grupos musculares ventrales, identificar y dividir bruscamente el nervio ciático proximal a sus ramas. Tres ramas ciáticas son generalmente visibles: tibial, peroneal y sural. Los tres deben conservarse en la extremidad del donante. Una cuarta rama cutánea no se ve típicamente en esta disección15,16.</li>
	<li>Termina de dividir los grupos musculares ventrales y dorsales restantes a nivel del muslo medio con una meticulosa hemostasia. Puede ser necesario retraer la extremidad mediamente para completar la división de los músculos.</li>
	<li>Transect the fémur bone at midshaft using a hand-held cordless rotary saw.</li>
	<li>Después de haber retirado el injerto de la extremidad del donante, corte los extremos atados de seda de la arteria femoral lateral del injerto y los tocones de las venas, abriendo así los vasos.</li>
	<li>Inserte un angiocatéter de calibre 24 en el muñón de la arteria del injerto y enjuague el injerto con 250 unidades internacionales de heparina diluidas en 5 ml de solución salina normal helada, observándola fluir claramente a través de la vena abierta.</li>
	<li>Lentamente, enjuague suavemente el injerto durante unos 3 minutos. El lavado excesivo de la fuerza puede dañar el endotelio.</li>
	<li>Coloque el injerto en un plato salino frío anidado en un cubo de hielo hasta el trasplante.</li>
	<li>Eutanasia la rata donante con toracotomía bilateral.</li>
	<li>Limpie todos los instrumentos quirúrgicos adecuadamente.</li>
</ol>2. Amputación de la extremidad posterior nativa del receptor
<ol><li>Inducir la anestesia con isoflurano al 5%, confirmar la profundidad, recortar el pelaje, colocar el animal y desinfectar la piel con alcohol como se describe para la rata donante.</li>
	<li>Isoflurano de valor descendente al 2-2,5% e inyectar analgesia preoperatoria subcutánea con buprenorfina 1,2 mg/kg, y profilaxis preoperatoria con enrofloxacina 7,5 mg/kg.</li>
	<li>Igual que para el donante, hacer una incisión circunferencial en el pliegue inguinal, reflejar los colgajos de la piel asegurando hemostasia, y diseccionar el nervio femoral, arteria y vena, ligando los mismos vasos de rama que arriba.</li>
	<li>Divida el nervio femoral más distalmente que para el donante, pero proximally a la bifurcación si es posible.</li>
	<li>Diseccionar la arteria y la vena femorales con suficiente espacio para sujetar cada uno por separado a nivel del ligamento inguinal. Sujete la vena y la arteria con abrazaderas microquirúrgicas de bulldog. Una vez sujetado, divida cada recipiente bruscamente con tijeras.</li>
	<li>Divide los músculos ventrales y dorsales del muslo a nivel medio del muslo con meticulosa hemostasia, retrayendo la extremidad mediamente según sea necesario.</li>
	<li>Identifique y divida los nervios ciáticos proximales a sus puntos de rama como arriba.</li>
	<li>Transecóte unas miras al fémur en el eje medio usando la sierra.</li>
	<li>Retire la extremidad posterior derecha nativa del receptor y deseche adecuadamente.</li>
	<li>Valorar hacia abajo el isoflurano a 1-1.5% a través del cono de la nariz.</li>
</ol>3. Implantación de miembro de donante a receptor
<ol><li>Usando la sierra de potencia de mano, afeite cualquier irregularidad tanto de los extremos de corte de fémur del donante como del receptor.</li>
	<li>Usando la sierra, corte el extremo del cubo de una aguja de calibre 18, que se convertirá en la varilla intramedular del fémur.</li>
	<li>Antes de manipular el hueso, aplique una pequeña cantidad de cera ósea en el extremo cortado del hueso del fémur para reducir el sangrado de la médula durante el proceso de escariado.</li>
	<li>Coapt los huesos femorales del donante y del receptor utilizando la aguja del calibre 18 como varilla intramedular. Es necesaria cierta fuerza, pero no resuena ninguno de los huesos en la medida en que se fracture la corteza.</li>
	<li>Según sea necesario, retire la aguja y úsela a una longitud adecuada para que ambos huesos encajen suavemente sobre la aguja sin que se muestre una aguja entre el hueso.</li>
	<li>Coloque un pequeño soporte como una almohadilla de gasa o una pequeña roca o arcilla de modelado debajo de la extremidad del donante para mantenerla fuera de la tensión.</li>
	<li>Reapproxima los grupos musculares ventrales con ocho a diez simples suturas de poliglactitina interrumpidas de 5-0 para que el injerto no gire alrededor de la aguja del fémur. Esto le da a la extremidad estabilidad para las anastomosas.</li>
	<li>Irrigar periódicamente el injerto y el campo quirúrgico con solución salina helada para una mejor visualización y reducir la lesión por reperfusión isquémica caliente.</li>
	<li>Alinee las arterias femorales del donante y del receptor y anastomose de extremo a extremo usando una sutura de nylon interrumpida simple 10-0, evitando tanto la tensión como el bucle. La arteria requiere un promedio de seis suturas.</li>
	<li>Al igual que la arteria, anastomose el donante y las venas femorales receptoras de extremo a extremo. La vena requiere de seis a ocho suturas. NOTA: El generoso riego salino frío, la técnica de manejo atraumático de los recipientes y dejar colas largas para servir como suturas de perduramiento para la retracción del recipiente son herramientas importantes para las análisismosas microquirúrgicas efectivas.</li>
	<li>Coloque una pequeña cantidad de polvo de celulosa hemostática alrededor de ambas anstomosas, y luego retire las abrazaderas de bulldog microquirúrgicas proximales en la vena y la arteria.</li>
	<li>Inspeccione ambas anastomosas para obtener una buena patencia y flujo. Use palitos de algodón para prodifiquen suavemente la vena y asegurar una buena hemostasia de ambas anastomosas. Mantenga la presión sobre los sitios de sangrado y coloque más polvo de celulosa hemostática si es necesario. Otra sutura se puede colocar a través de un agujero de sangrado a riesgo de "pared trasera" de la aguja sólo como último recurso.</li>
	<li>Cuando ambas anastomosas se confirmen satisfactorias, recorte las colas de sutura de larga duración restantes cortas para que coincidan con las demás.</li>
	<li>Reposiciona la rata a la posición de decúbito lateral izquierdo, utilice electrocauterización liberal para lograr una hemostasia meticulosa de cualquier sangrado muscular de reperfusión.</li>
	<li>Preste atención a las anastomoses nerviosas una vez que la hemostasia muscular esté asegurada. Recorta los extremos de corte nervioso que parezcan desiguales.</li>
	<li>Reapproxima los grupos musculares dorsales bajo nervio ciático con simples suturas de poliglactitina interrumpidas de 5-0.</li>
	<li>Reapproxima el nervio ciático. Ocho a diez 10-0 nylon neural simples suturas interrumpidas por lo general será suficiente.</li>
	<li>Reapproxima los grupos musculares dorsales que recuerdan y luego cierra la piel dorsal con 4-0 poliglactitina sutura continua.</li>
	<li>Vuelva a colocar la rata en posición supina y reaproble el nervio femoral. Dos a tres 10-0 suturas de nylon neural simple interrumpidas generalmente serán suficientes.</li>
	<li>Cierre la piel ventral con 4-0 de sutura continua de poliglactitina. Evite el exceso de cola de sutura, que puede ser irritante para la rata una vez despierto.</li>
</ol>4. Atención postoperatoria
<ol><li>Recuperar animales en sus jaulas con una almohadilla de calefacción debajo de la jaula y el acceso listo a los alimentos y el agua, monitoreo de complicaciones tempranas diariamente durante la primera semana.</li>
	<li>Proporcionar analgesia postoperatoria con meloxicam subcutáneo 1 mg/kg de inyección diaria a través de POD 2. Proporcionar antibiótico postoperatorio profilaxis diluyda enrofloxacino spray. Proporcione desincentivo para la autotomía (automutilación) con niebla amarga segura rociada dos veces al día al injerto a través de POD 7.</li>
	<li>Mantener ratas trasplantadas en jaulas con otras ratas, para estimular el regreso a las actividades diarias y rehabilitar la extremidad trasplantada.</li>
</ol>5. Pruebas de sensaciones postoperatorias
<ol><li>Aplicar la prueba Hargreaves del protocolo de sensación térmica, también descrito en otros lugares17,18.</li>
	<li>Coloque la rata en el recipiente de prueba y permita que se aclimate durante 20 minutos. El vidrio del aparato se confirma limpio, y la fuente de calor confirmó que está trabajando con el dedo del investigador.</li>
	<li>Antes de realizar la prueba, confirme que la rata está despierta y que la pata probada se coloca sobre el detector de movimiento infrarrojo.</li>
	<li>Transmitir energía térmica a nivel de intensidad 90. Se registra el retardo de tiempo en el que el animal aleja su pata de la fuente de calor. Si no se produce ningún movimiento en 20 segundos, la prueba se aborta para evitar lesiones.</li>
	<li>Obtenga cinco ensayos por extremidad probada, excluyendo el valor más alto y más bajo antes de calcular el tiempo medio de latencia de retirada para cada animal.</li>
</ol>6. Pruebas motoras postoperatorias
<ol><li>Usando una cinta de correr de análisis de marcha y una plataforma de análisis de software integrada, seleccione candidatos para las pruebas de la cinta de correr a las cuatro a seis semanas después de la cirugía.</li>
	<li>Recortar todas las uñas de los pies de rata uno o dos días antes de la prueba.</li>
	<li>Acclimar a los animales a la sala de pruebas durante una hora antes de la prueba, y permitir un minuto de acariciar previamente para calmar la ansiedad.</li>
	<li>Colocando la rata dentro de la cinta de correr, ejecutar la cinta de correr en pruebas de aumento de velocidad, de 10 cm / s, a 14 cm / s, a la meta 18 cm / s. Si la rata es reticente y no puede ser persuadida para caminar, aborte la prueba ese día para evitar el acondicionamiento negativo. Permita que los artistas altos caminen hasta 24 cm/s.</li>
	<li>Enjuague el aparato de la cinta de correr con un 70% de etanol entre animales probados.</li>
	<li>Los parámetros Gait se emiten desde el software propietario de la plataforma de análisis.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El trasplante de extremidades, bajo la categoría más amplia de atransplantación de componentes vascularizados (VCA), tiene una promesa terapéutica ampliamente aplicable aún no cumplida. Los principales obstáculos se encuentran en problemas inmunológicos sin resolver exclusivos de VCA y técnicas de recuperación neuromotor utilizadas actualmente. El desarrollo de nuevas técnicas dependerá del modelado animal que sea flexible, robusto y reproducible.
Se han establecido muchos modelos animales en ...

El trasplante de extremidades en la categoría más amplia de alotraplante de compuesto vascularizado (VCA) o alotrasplante de tejido compuesto (CTA) aún no ha cumplido su promesa terapéutica. Desde los primeros trasplantes de mano humanos exitosos en Lyon, Francia y Louisville, Kentucky en 1998 y 1999, se han realizado más de 100 trasplantes de extremidades superiores en todo el mundo en pacientes cuidadosamente seleccionados1. La aplicabilidad más amplia se ha visto obstaculizada por una inmunosupresión sustancial y una recuperación neuromotor funcional limitada. Las estrategias actuales de inmunosupresión dan como resultado una incidencia del 85% de rechazo agudo frente al 77% de incidencia de infección oportunista2. Por otro lado, se produce la recuperación funcional después del trasplante de manos; Las puntuaciones medias de Discapacidad del Hombro y mano del brazo (DASH) mejoran de 71 a 43, pero ese nivel de función todavía puede calificar como una discapacidad2. Dada la naturaleza que salva vidas al trasplante de extremidades, las técnicas actuales deben perfeccionarse en modelos animales para dar el siguiente paso en VCA.
Desde el primer modelo de rata de trasplante de extremidades en 19783, se han desarrollado muchos modelos animales innovadores para avanzar en el campo de VCA4,incorporando anastomosas con manguito vascular para minimizar el tiempo de funcionamiento5,,6,heterotópico trasplantes osteomiocutáneos para minimizar el insulto fisiológico al animal receptor7,8,9,10,11, y nuevos enfoques inmunológicos7,12,13,14. El modelo de rata del trasplante ortotópico de las extremidades traseras traseras derechas presentado aquí enfatiza técnicas microquirúrgicas meticulosas y probadas en el tiempo, como las anastomosas vasculares cosidas a mano y la coaptación neuronal como una inversión inicial en una plataforma modelo robusta y reproducible para investigar simultáneamente ambos aspectos de la limitación actual de VCA: estrategias de inmunosupresión y recuperación neuromotora funcional.

<table><tbody><tr><td>Máquina de anestesia</td><td>Vet Equip</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 0,5 cc</td><td>Exel</td><td>26018</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 18</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 1 cc</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>aguja de calibre 22</td><td>BD 305156</td><td></td><td></td></tr><tr><td>angiocatéter de calibre 24</td><td>Sur-Vet</td><td>SROX2419V</td><td></td></tr><tr><td>25- aguja de medición</td><td>Exel</td><td>26403</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 3 cc</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>jeringa de 5 cc</td><td>Exel</td><td>26230</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-600-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de inducción de anestesia</td><td>Vet Equip</td><td>941443</td><td></td></tr><tr><td>sistema de eliminación de gases anestésicos</td><td>Vet Equip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar electrocauterio</td><td>Aura</td><td>26-500</td><td></td></tr><tr><td>Bitter Spray Mist</td><td>Henry Schein</td><td>5553</td><td></td></tr><tr><td>Cera de hueso</td><td>CP Medical</td><td>CPB31A</td><td></td></tr><tr><td>Circuito respiratorio</td><td>Vet Equip</td><td>921413</td><td></td></tr><tr><td>Buprenophine</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>12496075705</td><td></td></tr><tr><td>Castro-Viejos destornilladores de agujas</td><td>Roboz</td><td>RS-6416</td><td></td></tr><tr><td>Sierra rotativa inalámbrica</td><td>Dremel</td><td>8050-N/18</td><td></td></tr><tr><td>Bastoncillo de algodón</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td>Para hemostasia</td></tr><tr><td>DigiGait Appparatus y software</td><td>Especificaciones del ratón</td><td>MSI-DIG, DIG-SOFT</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont (#4)</td><td>Roboz</td><td>RS-4972</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont (#5)</td><td>Roboz</td><td>RS-5035</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacina</td><td>Norbrook</td><td>ANADA 200-495</td><td></td></tr><tr><td>FK-506</td><td>Astellas</td><td>301601</td><td></td></tr><tr><td>Gasa</td><td>Kendall</td><td>1903</td><td></td></tr><tr><td>Gasa</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td></td></tr><tr><td>Guantes</td><td>Microflex</td><td>DGP-350-M</td><td></td></tr><tr><td>Cortapelos</td><td>Oster</td><td>078005-010-003</td><td></td></tr><tr><td>Electrocauterización monopolar de mano</td><td>Bovie</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>Aparato Hargreaves</td><td>Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italia</td><td>37370</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Walgreens</td><td>126987</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Fresenius Kabi</td><td>42592K</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>Corning</td><td>PC-351</td><td>Para calentar líquido de reanimación</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Timbres lactatados</td><td>Baxter</td><td>2B2074</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri grande</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>Para injerto de donante en solución salina refrigerada</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Henry Schein</td><td>49755</td><td></td></tr><tr><td>micro Retractor</td><td></td><td></td><td></td>Collin Hartmann</tr> Micro <tr><td>tijeras de disección</td><td>Roboz</td><td>RS-5841</td><td></td></tr><tr><td>Polvo de colágeno microfibrilar</td><td>BD</td><td>1010590</td><td>Para hemostasia</td></tr><tr><td>Pinzas microvasculares</td><td>Roboz</td><td>RS-5420</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina normal</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td></td></tr><tr><td>Lubricante oftálmico</td><td>Dechra</td><td>IS4398</td><td></td></tr><tr><td>Rapmicina</td><td>MedChem Express</td><td>HY-10219</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri pequeña</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td>Para líquido</td></tr> <tr><td>de reanimación calentadoPaños estériles</td><td>ProAdvantage</td><td>N207100</td><td></td></tr><tr><td>Bata quirúrgica</td><td>Cardinal Health</td><td>9511</td><td></td></tr><tr><td>Mascarilla quirúrgica</td><td>3M</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio quirúrgico, modelo óptico OPMIMD</td><td>Zeiss</td><td>169756</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio quirúrgico, universal S3</td><td>Zeiss</td><td>Sutura 243188</td><td></td></tr><tr><td>10-0 nylon</td><td>Covidien</td><td>N2512</td><td></td></tr><tr><td>Sutura 5-0 vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J213H</td><td></td></tr><tr><td>Sutura 7-0 lazo de seda</td><td>Teleflex</td><td>103-S</td><td></td></tr><tr><td>Cinta</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de instrumentos ultrasónico</td><td>Roboz</td><td>RS-9911</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de dilatación de vasos</td><td>Roboz</td><td>RS-5047</td><td></td></tr></tbody></table>

dar el siguiente paso: un modelo de trasplante de extremidades hindópicos ortotópicos de coaptación neuronal para maximizar la recuperación funcional en rata

Taking the Next Step: a Neural Coaptation Orthotopic Hind Limb Transplant Model to Maximize Functional Recovery in Rat

El trasplante de extremidades en particular y el alotrasplante compuesto vascularizado (VCA) en general tienen amplias promesas terapéuticas que han sido obstaculizadas por las limitaciones actuales en inmunosupresión y recuperación neuromotor funcional. Muchos modelos animales han sido desarrollados para estudiar características únicas de VCA, pero aquí presentamos un modelo reproducible robusto de trasplante ortotópico de extremidades traseras en ratas diseñadas para investigar simultáneamente ambos aspectos de la limitación actual de VCA: estrategias de inmunosupresión y recuperación neuromotora funcional. En el núcleo del modelo descansa un compromiso con técnicas microquirúrgicas meticulosas y probadas en el tiempo, como las análisismosas vasculares cosidas a mano y la coaptación neuronal cosida a mano del nervio femoral y el nervio ciático. Este enfoque produce reconstrucciones duraderas de extremidades que permiten animales de mayor vida capaces de rehabilitación, reanudación de las actividades diarias y pruebas funcionales. Con el tratamiento a corto plazo de los agentes inmunosupresores convencionales, los animales alotraplanados sobrevivieron hasta 70 días después del trasplante, y los animales isotraplantados proporcionan controles de larga duración más allá de los 200 días posteriores a la operación. La evidencia de recuperación funcional neurológica está presente por 30 días después de la operación. Este modelo no sólo proporciona una plataforma útil para interrogar preguntas inmunológicas exclusivas de VCA y regeneración nerviosa, sino que también permite realizar pruebas in vivo de nuevas estrategias terapéuticas específicamente adaptadas para VCA.

La supervivencia y la recuperación dependen de una técnica quirúrgica meticulosa. La atención a las anastomosas vasculares y las anastomosas neurales, así como a la coaptación ósea como se ha descrito anteriormente es crucial para maximizar el éxito de este modelo. El diseño operativo y los resultados antóstomicos representativos se muestran en la Figura 1.
La mortalidad global dependía de la estrategia de inmunosupresión, ya que la mayoría de los animales isotrap...

Este protocolo presenta un modelo robusto y reproducible de alotrasplante compuesto vascularizado (VCA) orientado al estudio simultáneo de la inmunología y la recuperación funcional. El tiempo invertido en la técnica meticulosa en un trasplante ortotópico de las extremidades traseras de la parte media derecha con anastomosas vasculares cosidas a mano y coaptación neuronal produce la capacidad de estudiar la recuperación funcional.

Dar el siguiente paso: un modelo de trasplante de extremidades hindópicos ortotópicos de coaptación neuronal para maximizar la recuperación funcional en rata

Limb transplant in particular and vascularized composite allotransplant (VCA) in general have wide therapeutic promise that have been stymied by current ...

Este video proporcionará una descripción detallada, cómo realizar una extremidad posterior ortotópica, rata trasplantada de muslo medio. La extremidad posterior derecha de la rata donante se amputa a nivel del muslo medio y luego se almacena en hielo. La extremidad posterior derecha de la rata receptora también se amputa a nivel medio del muslo.A continuación, la extremidad de la rata donante se une a la rata receptora. Describiremos cómo volver a conectar los sistemas óseo, arterial, vena, nervio, muscular y piel. El trasplante de extremidades, más específicamente, el atransplante compuesto vascularizado, VCA, tiene una amplia promesa terapéutica.Pero actualmente está limitado por técnicas, inmunosupresión y recuperación neuromotor funcional deficiente. Nuestro modelo hace hincapié en técnicas microquirúrgicas meticulosas probadas en el tiempo, como la anastomosis vascular cosida a mano y la coaptación neuronal. Hemos realizado más de 200 de estas cirugías en más de un año.Aunque hay una curva de aprendizaje inicial para el microcirujano inicial, al usar este video para aprender nuestro método y su compromiso con la práctica dedicada, cualquier microcirujano será capaz de dominar este modelo. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, NIH, y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Northwestern. Los procedimientos específicos se realizaron en un protocolo IS 00001663.Seleccione una rata de ocho a 16 semanas de edad que pese entre 250 y 400 gramos en el momento de la cirugía. Inducir anestesia general con 5%isoflurano a través de un vaporizador antes de recortar el pelaje de las extremidades traseras de la rata. Usando un cono nasal para mantener la anestesia entre dos y 2.5%posicione a la rata en la placa de operaciones con un calentador debajo.Desinfectar la piel sin pelo con 70% de alcohol y proteger el campo quirúrgico con gasa estéril. Usando un microscopio microquirúrgico apropiado y los instrumentos microquirúrgicos que se muestran aquí, junto con la electrocauterización bipolar y monopolar fácil de acceder, estará listo para comenzar la disección. Usa unas tijeras para hacer una incisión circunferencial y cutánea alrededor de la extremidad posterior derecha.Comience en el pliegue inguinal inmediatamente a aproximadamente el mismo nivel que el ligamento inguinal y extienda dorsal lateralmente para completar la incisión circunferencial. Y luego exponer la capa muscular directamente debajo de la incisión, diseccionar y cauterizar los vasos epigástricos superficiales, que conducen desde la capa muscular hasta el colgajo de la piel proximal que acaba de crear. Refleja el colgajo proximal casimedialmente al ligamento inguinal y el colgajo distal de la piel de forma inferolateral a la rodilla.Utilice un retractor de alambre o una gasa enrollada para ayudar a exponer el campo. Observó que la anatomía inguinal de la rata es similar a los seres humanos;de lateral a medial mentira el nervio, la arteria y la vena. Diseccionar el nervio femoral, dividirlo bruscamente en el ligamento inguinal proximal a la bifurcación, si es posible.Retirar el nervio dividido inferiormente, manteniéndolo a salvo fuera del camino, cubierto bajo gasa húmeda. La atención a la arteria femoral y la vena utilizan lazos de seda de cuatro centímetros de largo 7-0 para retraer los vasos de forma atraumática en lugar de manipularlos directamente. Ahora prestar mucha atención mejorará el resultado análisistomótico final.Ligar todas las ramas de los vasos femorales con lazos de seda 7-0. Divida las ramas entre los lazos. Las ramas arteriales y venosas que requieren división incluyen el circunflejo superficial ilíaco y los vasos musculares.El circunflejo iliac superficial es generalmente más grande y parece sumergirse profundamente como lo haría el femoral profundo en los seres humanos, pero la profundidad está ausente en la rata. Las ramas más distales de los vasos femorales, como la rama genicular más alta y la rama safenosa, generalmente no requieren división. Ahora ligar la arteria femoral con lazos de seda 7-0 tan proximales al ligamento inguinal como sea posible y dividir entre los lazos.Similar a la arteria, ligar y dividir la vena femoral. Reflejar la arteria y la vena de manera inferior, segura fuera del camino, cubierto debajo de la gasa húmeda junto con el nervio femoral cubierto previamente. Diseccionar los grupos musculares ventrales, teniendo cuidado de cauterizar cualquier vaso visible que surja.La atención a la hemostasia ahora minimizará la pérdida de sangre del receptor durante la reprofusión más tarde. Profundo a los grupos musculares ventrales, identificar y dividir bruscamente el nervio ciático proximal a sus ramas. Las tres ramas ciáticas son generalmente visibles, tibiales, peroneales y sural.Los tres deben conservarse en la extremidad del donante. Una cuarta rama cutánea no se ve típicamente en esta disección. Termina de dividir los grupos musculares ventrales y dorsales restantes a nivel del muslo medio con una meticulosa hemostasia.Puede ser necesario retraer la extremidad mediamente para completar la división de los músculos. Transect the fémur bone at mid-shaft using a handheld cordless rotary saw. La extremidad está ahora libre del donante.Después de haber retirado el injerto de la extremidad del donante, corte los extremos atados de seda de la arteria femoral lateral del injerto y los tocones de las venas, abriendo así los vasos. Inserte un angiocatéter de calibre 24 en el muñón de la arteria del injerto y enjuague el injerto con 250 unidades internacionales de heparina diluidas en 5 mililitros de solución salina normal helada, teniendo cuidado de ver que fluye fuera de la vena abierta. Lentamente, enjuague suavemente el injerto durante unos tres minutos.El lavado excesivo de la fuerza puede dañar el endotelio. Coloque el injerto en un plato salino frío anidado en un cubo de hielo hasta el trasplante. Eutanasia la rata donante con toracotomía bilateral.La cirugía receptora comienza de manera similar a la cirugía del donante, anestesiando a la rata, recortando el pelaje, haciendo una incisión circunferencial en el pliegue inguinal, reflejando los colgajos de la piel, diseccionando el nervio femoral, la arteria y la vena. Y ligando los mismos buques de rama como se describió anteriormente. Sin embargo, durante esta operación, divida el nervio femoral más distalmente que para el donante, pero proximally a la bifurcación si es posible.Divida y libere la arteria femoral y la vena y sujete aproximadamente respectivamente al nivel del ligamento inguinal con abrazaderas de bulldog microquirúrgicas. Continuar la cirugía como se describió anteriormente, dividiendo los músculos ventrales que avalan el muslo a nivel del muslo medio con la forma meticulosa de hemostasis, mientras retrae la extremidad medialmente según sea necesario. Identifique y divida el nervio ciático proximal al punto de rama y transecte el fémur en el eje medio utilizando la sierra giratoria.Retire la extremidad posterior derecha nativa del destinatario y deseche apropiadamente de acuerdo con las directrices locales del Comité de Cuidado y Uso de Animales. Es muy importante en esta etapa bajar el isoflurano al uno a 1,5% a través del cono nasal. Demasiada anestesia durante esta parte menos dolorosa del procedimiento conducirá a la muerte de la rata.Es hora de juntar los huesos. Usando la sierra giratoria de mano, afeite cualquier irregularidad tanto de los extremos de corte del fémur del donante como del receptor. Corte el extremo del cubo de una aguja de calibre 18, que se convertirá en la varilla intramedular del fémur.Antes de manipular el hueso, aplique una pequeña cantidad de cera ósea en el extremo cortado del hueso del fémur para reducir el sangrado de la médula durante el proceso de escariado. Coapt los huesos femorales del donante y del receptor utilizando la aguja del calibre 18 como varilla intramedular. Es necesaria cierta fuerza, pero no resuena ninguno de los huesos en la medida en que se fracture la corteza.Según sea necesario, retire la aguja y úsela a una longitud inadecuada para que ambos huesos encajen suavemente sobre la aguja sin que se muestre una aguja entre el hueso. Coloque un pequeño soporte como una almohadilla de gasa o una pequeña roca o arcilla de modelado debajo de la extremidad del donante para mantenerla fuera de la tensión. Reapproxima los grupos musculares ventrales con ocho a 10 suturas simples interrumpidas de 5-0 poliglactitina para que el injerto no gire alrededor de la aguja del fémur.Esto le da a la extremidad estabilidad para las anastomosas. Ahora comienza las anastomosas. Irrigar periódicamente el injerto y el campo quirúrgico con solución salina helada para una mejor visualización y reducir la lesión por reperfusión isquémica.Alinee las arterias femorales y la anastomose del donante y receptor de extremo a extremo usando una sutura de nylon simple interrumpida 10-0, evitando tanto la tensión como el bucle. La arteria requiere un promedio de seis suturas. Al igual que la arteria, anastomose el donante y las venas femorales receptoras de extremo a extremo.La vena requiere de seis a ocho suturas. El generoso riego salino frío, la técnica de manejo atraumático de los recipientes y dejar colas largas para servir como suturas de perduramiento para la retracción de los recipientes son herramientas importantes para las anastomosas microquirúrgicas efectivas. Coloque una cantidad moderada de polvo de celulosa hemostática en ambas análisismosas, y posteriormente retire las abrazaderas de bulldog microquirúrgicas proximales en la vena y la arteria.Inspeccione ambas anastomosas para obtener una buena patencia y flujo. Use palitos de algodón para prodifiquen suavemente la vena e inspeccione la buena hemostasia en ambas anastomosas. Cuando ambas anastomosas se confirmen satisfactorias, recorte cualquier cola de sutura de larga duración restante para que coincida con las demás.Reposicionar la rata a la posición de decúbito lateral izquierdo, utilizar electrocauterización liberal para lograr la hemostasia meticulosa de cualquier sangrado muscular de reperfusión. La atención se vuelve a las anastomosas nerviosas una vez que la hemostasia muscular está asegurada. Reapproxima los grupos musculares dorsales que se encuentran directamente debajo del nervio ciático con simples suturas de poliglactin interrumpidas de 5-0.Recorta los extremos de corte nervioso que parezcan desiguales. Reapproxima el nervio ciático con 10-0 suturas de nylon que luchan por mordeduras epinales. Ocho a 10 suturas interrumpidas simples generalmente serán suficientes.Reapproxima los grupos musculares dorsales restantes con suturas de 5-0 poliglactin. A continuación, cierre la piel dorsal con 4-0 de sutura de funcionamiento continuo de poliglactitina. Reposicionando la rata a la posición supina, reaproxima el nervio femoral con sutura de nylon 10-0, de nuevo, luchando por mordeduras epiniales.Dos o tres suturas interrumpidas simples generalmente serán suficientes. Cierre la piel ventral restante de la misma manera que la piel dorsal. Evite el exceso de cola de sutura, que puede ser irritante para la rata una vez despierto.Una vez que los animales están fuera de la ventana postoperatoria inmediata, se pueden probar para la recuperación del neuromotor. La prueba de Hargreaves se utiliza para probar la sensación térmica. Coloque la rata en el recipiente de prueba y permita que se aclimate durante 20 minutos.El vidrio del aparato se confirma limpio, y se confirma que la fuente de calor está trabajando con el dedo del investigador. Antes de realizar la prueba, confirme que la rata está despierta y que la pata probada se coloca sobre el detector de movimiento infrarrojo. Transmitir energía térmica a nivel de intensidad 90.Se registra el retardo de tiempo en el que el animal aleja su pata de la fuente de calor. Si no se produce ningún movimiento en 20 segundos, la prueba se aborta para evitar lesiones. Obtenga cinco ensayos por extremidad probada, excluyendo el valor más alto y más bajo antes de calcular el tiempo medio de latencia de retirada para cada animal.Aquí se muestra el diseño operativo en formato de dibujos animados. La extremidad posterior derecha de las ratas donantes y receptoras se amputan a nivel medio del muslo como sección transversal ciática. La arteria femoral, la vena y el nervio, así como el nervio ciático y el hueso del fémur deben reconectarse en la cirugía del receptor.El modelo se puede utilizar para mostrar efectos diferenciales de supervivencia de la supresión inmune y la estrategia de trasplante. Con esta técnica, la supervivencia a largo plazo es alcanzable. El modelo se puede utilizar para investigar la recuperación del nervio sensorial, que puede ser evidente por cuatro semanas después de la postoperatoria.La función del motor también se puede interrogar utilizando una plataforma de análisis de marcha. Aquí, hemos presentado una plataforma modelo de rata con características de supervivencia favorables, que utilizamos para sondear la recuperación sensorial y motora como se ve en las cifras de procedimiento. El trasplante de extremidades en la categoría más amplia de VCA, el alostrasplante de componentes vascularizados tiene una promesa terapéutica ampliamente aplicable que aún no se ha cumplido.Los principales obstáculos alinean las técnicas actuales de inmunosupresión y recuperación neuromotora. El desarrollo de nuevas técnicas dependerá del modelado animal flexible, robusto y reproducible. Usando esta plataforma, esperamos que los investigadores puedan avanzar múltiples facetas del trasplante de extremidades.Gracias por mirar y buena suerte en sus próximos pasos.

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A continuación se describe la rata ortotópico patas traseras procedimiento de trasplante, lo que parece ser el estándar de...

Ortotópico patas traseras trasplante en ratas

Este modelo novedoso para posterior trasplante ortotópico extremidad en el ratón, la aplicación de una técnica de manguito no de sutura para la anastomosis super-microvascular, proporciona una herramienta poderosa para la investigación inmunológica in vivo mecanicista relacionada con alotrasplante compuesto vascularizado (VCA).

Ortotópico de la extremidad posterior de trasplante en el ratón

El aloinjerto compuesto vascularizado ofrece beneficios que alteran la vida a los receptores de trasplante, pero las causas biológicas del rechazo del injerto y la vascutropatía permanecen poco comprendidas. El modelo quirúrgico de roedores presentado aquí ofrece un modelo reproducible, clínicamente relevante de trasplante, permitiendo a los investigadores evaluar eventos de rechazo y posibles estrategias terapéuticas para prevenir su ocurrencia.

Modelo de colgajo Osteomiocucutáneo de extremidades posteriores modificados en la rata para investigación de compuestos alotransplante de compuesto translacional vascularizado

La evaluación de la recuperación del motor sigue siendo la medida del resultado de la referencia en estudios periféricos experimentales del nervio. La medida isométrica de la fuerza tetánica del músculo anterior de tibialis en la rata es una herramienta inestimable para evaluar resultados funcionales después de la reconstrucción de los defectos del nervio ciático. Los métodos y matices se detallan en este artículo.

Medición De La Fuerza Teánica Isométrica Máxima Del Músculo Tibial Anterior En La Rata

Este trabajo presenta un protocolo de trasplante de colgajo osteomiocutáneo heterotópico parcial en ratas y sus posibles resultados en el seguimiento a medio plazo.

Modelo de trasplante parcial de extremidades posteriores heterotópicas en ratas

Simulamos la cirugía clínica para establecer un protocolo de anastomosis directa de los nervios bilaterales del plexo braquial por vía preespinal en ratones, contribuyendo al estudio de los mecanismos neurales que subyacen a la rehabilitación tras la transferencia de nervios cruzados tras lesiones del sistema nervioso central y periférico.

Un modelo murino de anastomosis directa a través de la vía preespinal para la cirugía de transferencia de nervios cruzados

Este protocolo demuestra cómo realizar una amputación por debajo de la rodilla en ratas y realizar inmediatamente la inervación muscular dirigida (iTMR) para investigar estrategias que traten y previenen el dolor relacionado con la amputación y para comprender mejor los mecanismos del dolor asociados a la amputación.

Modelo de amputación de la extremidad posterior de rata por debajo de la rodilla y reinervación muscular dirigida inmediata

Este procedimiento demuestra el transporte transverso de la corteza tibial en ratas, permitiendo la visualización y el análisis de la revascularización durante la isquemia de la extremidad.

Un modelo de rata de transporte transversal de la corteza tibial para el tratamiento de la isquemia de la extremidad inferior

Presentamos un modelo reproducible de ratón de alotrasplante compuesto vascularizado de extremidades posteriores a cuello heterotópico. Este protocolo supermicroquirúrgico, que implica anastomosis de vasos de 0,3-0,5 mm, integra guía con filamento de nailon y esposas venosas. Proporciona una plataforma fiable para estudios traslacionales sobre tolerancia, lesiones por isquemia-reperfusión y mecanismos inmunológicos en alotrasplantes compuestos vascularizados.

Trasplante heterotópico de extremidad posterior a cuello en ratón: un modelo supermicroquirúrgico de alotrasplante compuesto vascularizado

Este video muestra el modelo de trasplante ortotópico de la aorta como un modelo simple para estudiar el desarrollo de vasculopatía del trasplante (TVP) en ratas.

Trasplante ortotópico aórtica: un modelo de rata para estudiar el desarrollo de la enfermedad vascular crónica

Aprende a realizar un trasplante ortotópico de extremidad posterior en rata mediante microcirugía vascular y coaptación neural. Este modelo permite estudiar la recuperación funcional y las respuestas inmunológicas en trasplantes de tejidos compuestos vascularizados.

Dar el siguiente paso: un modelo de trasplante de extremidades hindópicos ortotópicos de coaptación neuronal para maximizar la recuperación funcional en rata (Video) | JoVE Journal

Dar el siguiente paso: un modelo de trasplante de extremidades hindópicos ortotópicos de coaptación neuronal para maximizar la recuperación funcional en rata

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