Name: Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprende a realizar mapeo óptico de voltaje y calcio en rebanadas cardíacas humanas para evaluación electrofisiológica preclínica. Este método permite caracterizar simultáneamente potenciales de acción y transitorios de calcio intracelular.

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Se agradece con gratitud la financiación de NIH (becas R21 EB023106, R44 HL139248 y R01 HL126802), por la fundación Leducq (proyecto RHYTHM) y una beca postdoctoral de la Asociación Americana del Corazón (19POST34370122).

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<li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li>
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<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts+-+A+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices%3A+preparation%2C+handling%2C+and+successful+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li>
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<li>Kawara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+delay+after+premature+stimulation+in+chronically+diseased+human+myocardium+relates+to+the+architecture+of+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis.</a> Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).</li>
<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+recording+and+pro-arrhythmia+risk+analysis+in+human+ventricular+trabeculae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae.</a> Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109(2018).</li>
<li>Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cycle+length+dependence+of+human+action+potential+duration+in+vivo.+Effects+of+single+extrastimuli%2C+sudden+sustained+rate+acceleration+and+deceleration%2C+and+different+steady-state+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies.</a> Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).</li>
<li>Lou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmural+heterogeneity+and+remodeling+of+ventricular+excitation-+contraction+coupling+in+human+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure.</a> Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, presentamos métodos paso a paso para obtener rebanadas cardíacas viables de corazones humanos cardioplególo y para caracterizar funcionalmente las rebanadas utilizando el mapeo óptico dual del potencial transmembrano y el calcio intracelular. Con un ambiente extracelular preservado y acoplamiento de células celulares nativas, las rebanadas cardíacas humanas se pueden utilizar como un modelo preciso del corazón humano para el descubrimiento científico fundamental y para pruebas de eficacia y cardiotoxicidad de agent...

Los modelos animales han sido una herramienta valiosa utilizada para comprender los mecanismos subyacentes de la fisiología humana y la fisiopatología, así como una plataforma para las pruebas preliminares de terapias para tratar diversas enfermedades1. Se han realizado grandes avances en el campo de la investigación biomédica basada en estos estudios en animales2. Sin embargo, existen diferencias interespecíficos significativas entre las fisiologías humanas y animales, incluidos ratones, ratas, conejillos de indias, conejos, ovejas, cerdos y perros3,4. Como resultado, ha habido numerosas terapias farmacológicas, genéticas y celulares que mostraron promesa durante la etapa de pruebas con animales, pero no pudieron estar a la altura de los resultados en los ensayos clínicos5. Para colmar esta brecha, se desarrollaron miocitos cardíacos aislados y células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) como modelos para probar la respuesta de la fisiología humana a diversos fármacos y enfermedades6. Los cardiomiocitos derivados de células madre han sido ampliamente utilizados en sistemas de órgano en un chip como sustituto del corazón6,,7,,8. Sin embargo, la utilidad de los cardiomiocitos derivados del iPSC (iPSC-CM) se ve obstaculizada por su fenotipo relativamente inmaduro y la falta de representación de la subpoblación de cardiomiocitos; el miocardio maduro es una estructura compleja compuesta por varios tipos celulares coexistibles como fibroblastos, neuronas, macrófagos y células endoteliales. Por otro lado, los cardiomiocitos humanos aislados son eléctricamente maduros, y diferentes subpoblaciones de cardiomiocitos se pueden obtener mediante la alteración de los parámetros de cultivo9. Aún así, estos miocitos generalmente exhiben morfologías potenciales de acción alteradas debido a la falta de acoplamiento de células celulares, des-diferenciación rápida, y la ocurrencia de comportamiento proarrítmico in vitro10,11. Algunas de las limitaciones fueron abordadas por modelos de cultivo celular 3D de iPSC-CM y miocitos cardíacos. Estos modelos, que incluyen esferoides, scaffolds de hidrogel encapsulados cultivos 3D, tejidos cardíacos diseñados (EHT) y sistemas de corazón en una ardilla, utilizan múltiples poblaciones de células cardíacas como cardiomiocitos, fibroblastos y células endoteliales. Se automontan o ensamblan a lo largo de un andamio para formar estructuras 3D, y algunos incluso reproducen la compleja naturaleza anisotrópica del miocardio. Se ha notificado que estos modelos tienen células de fenotipos maduros, propiedades contráctiles y perfiles moleculares similares al tejido cardíaco. El sistema de corazón en un chip también permite el estudio de los efectos sistémicos en las pruebas de drogas y los modelos de enfermedades. Sin embargo, los modelos basados en células in vitro carecen de la matriz extracelular nativa y, por lo tanto, no pueden imitar con precisión la electrofisiología a nivel de órgano. Las rebanadas cardíacas humanas, en cambio, tienen una matriz extracelular intacta y contactos nativos de célula a célula, lo que los hace útiles para examinar con mayor precisión las propiedades arritmogénicas del miocardio humano.
Los investigadores han desarrollado rebanadas organotípicas cardíacas humanas como plataforma fisiológica preclínica para pruebas de fármacos agudos y crónicos y para estudiar la electrofisiología cardíaca y la progresión de enfermedades cardíacas12,,13,,14,,15,,16,,17,,18,,19. En comparación con los cardiomiocitos derivados de iPSC, las rebanadas cardíacas humanas replican más fielmente la electrofisiología cardíaca humana adulta con un fenotipo maduro de cardiomiocitos. En comparación con los cardiomiocitos humanos aislados, las rebanadas cardíacas exhiben duraciones potenciales de acción fisiológica debido al acoplamiento de células celulares bien conservado y la existencia intrínseca de sus ambientes intra y extracelulares nativos.
Este protocolo describe el proceso de generación de rebanadas cardíacas humanas a partir de corazones de donantes enteros, realizando estudios agudos (es decir, de horas de duración) y crónicos (es decir, de días de duración) para probar parámetros de electrofisiología cardíaca a través de mapeo óptico. Si bien este protocolo describe sólo el uso del tejido ventricular izquierdo (LV), se ha aplicado con éxito a otras regiones del corazón, así como a otras especies como ratones, ratas, conejillos de indias y cerdos14,,20,,21,,22. Nuestro laboratorio utiliza corazones de donantes humanos enteros que han sido rechazados para el trasplante durante los últimos 5 años, pero es factible que estos mismos procedimientos se lleven a cabo en cualquier tejido de muestra de corazón del donante obtenido por medios alternativos (por ejemplo, implantes de dispositivo de asistencia ventricular izquierda [LVAD], biopsias, mitomigenes) siempre y cuando los tejidos tengan la capacidad de ser seccionados en cubos. El mapeo óptico se emplea para el análisis en este estudio debido a su capacidad para mapear simultáneamente potenciales de acción óptica y transitorios de calcio con alta resolución espacial (100 x 100 píxeles) y temporal (>1.000 fotogramas/s). También se pueden utilizar métodos alternativos, como matrices multielectrodas (AMA) o microelectrodos, pero estas técnicas están limitadas por sus resoluciones espaciales relativamente bajas. Además, los MEA se diseñaron para su uso con cultivos celulares, y los microelectrodos afilados se gestionan más fácilmente para su uso con corazones enteros o cuñas de tejido grandes.
El objetivo del artículo es permitir que más investigadores utilicen tejidos cardíacos humanos para estudios de electrofisiología cardíaca. Cabe señalar que la tecnología descrita en este artículo es relativamente simple y beneficioso para estudios a corto plazo (en el orden de varias horas a días). Más cultivo biomimético fisiológico para estudios a largo plazo (sobre el orden de las semanas) ha sido discutido y descrito por un número de otros estudios12,18,23. La estimulación eléctrica, la carga mecánica y el estiramiento de tejidos son mecanismos de acondicionamiento ventajosos que pueden ayudar a limitar la aparición de la remodelación in vitro del tejido12,,18,,23.

<table><tbody><tr><td>Jeringa BD de 1 ml</td><td>Thomas Scientific</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Monóxido de 2,3-butanediona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>6 placas de cultivo de pocillos</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Cabina de bioseguridad</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1377</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Cayman</td><td>13186</td><td></td></tr><tr><td>Trampa de burbujas</td><td>Radnoti</td><td></td><td></td>130149</tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células de Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-432</td><td></td></tr><tr><td>Di-4-ANEPPS</td> Solución madre de <td>biotio</td><td></td><td>a 1,25 mg/mL en DMSO</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de #3c Dumont</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Espejo dicroico de emisión</td><td>Chroma</td><td>T630LPXR-UF1</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión (RH237)</td><td>Chroma</td><td>ET690/50m</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión (Rhod2AM)</td><td>Chroma</td><td>ET590/33m</td><td></td></tr><tr><td>Espejo dicroico de excitación</td><td>Chroma</td><td>T550LPXR-UF1</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de excitación</td><td>Chroma</td><td>ET500/40x</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Tubos de centrífuga cónicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Intercambiador de calor</td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50145502</td><td></td></tr><tr><td>Insulina Transferrina Selenio (ITS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz de excitación LED</td><td>Prizmatix</td><td>UHP-Mic-LED-520</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnessio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Medio 199</td><td>Cámara CMOS tipo ThermoFisher Scientific</td><td>11150059</td><td></td></tr><tr><td>Micam Ultima L</td><td>Scimedia</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pines Minutien</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica Cole</td><td>Parmer</td><td>EW-07522-20</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de estimulación de platino</td><td>Alfa Aesar</td><td>43275</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P6867</td><td>poliol no iónico, tensioactivo</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Datos de Powerlab adquisición y estimulador</td><td>AD Instruments</td><td>Powerlab 4/26</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td></td></tr><tr><td>Rhod2AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1245MP</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2AM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador, perla seca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z378550</td><td></td></tr><tr><td>Stone Difusor de oxígeno</td><td>Waterwood</td><td>B00O0NUVM0</td><td></td></tr><tr><td>TissueSeal - Histoacryl Adhesivo cutáneo tópico</td><td>gobiomed</td><td>AESCULAP</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonido sonicador</td><td></td><td>Branson 1800</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Instruments</td><td>7000 smz</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Recientemente se han desarrollado preparaciones de rebanadas cardíacas humanas como una plataforma para estudios de fisiología humana y pruebas terapéuticas para cerrar la brecha entre los ensayos en animales y clínicos. Numerosos modelos animales y celulares se han utilizado para examinar los efectos de los fármacos, sin embargo, estas respuestas a menudo difieren en los seres humanos. Las rebanadas cardíacas humanas ofrecen una ventaja para las pruebas de drogas, ya que se derivan directamente de corazones humanos viables. Además de haber preservado estructuras multicelulares, acoplamiento de células celulares y entornos de matriz extracelular, las rebanadas de tejido cardíaco humano se pueden utilizar para probar directamente el efecto de innumerables fármacos en la fisiología cardíaca humana adulta. Lo que distingue a este modelo de otras preparaciones del corazón, como corazones enteros o cuñas, es que las rebanadas pueden ser sometidas a cultura a largo plazo. Como tal, las rebanadas cardíacas permiten estudiar los efectos agudos y crónicos de los medicamentos. Además, la capacidad de recoger varios cientos a mil rebanadas de un solo corazón hace de este un modelo de alto rendimiento para probar varios fármacos en diferentes concentraciones y combinaciones con otros medicamentos al mismo tiempo. Las rebanadas se pueden preparar desde cualquier región del corazón. En este protocolo, describimos la preparación de las rodajas ventriculares izquierdas aislando cubos de tejido de la pared libre ventricular izquierda y segándolas en rodajas usando un microtoma vibratorio de alta precisión. Estas rebanadas pueden ser sometidas a experimentos agudos para medir la función electrofisiológica cardíaca basal o cultivadas para estudios de drogas crónicas. Este protocolo también describe el mapeo óptico dual de las rebanadas cardíacas para grabaciones simultáneas de potenciales transmembranas y dinámicas de calcio intracelulares para determinar los efectos de los fármacos que se están investigando.

Las rebanadas organotípicas humanas se recogieron del ventrículo izquierdo de un corazón humano donante de acuerdo con el protocolo detallado anteriormente e ilustrado enFigura 1. Un sistema de mapeo óptico de cámara dual como ese enFigura 2se utilizó en la configuración de imágenes verticales para realizar el mapeo óptico simultáneo de voltaje y calcio aproximadamente 1 h después de la finalización del protocolo de corte. Los datos se analizaron utilizando RHYT...

Este protocolo describe el procedimiento para secimiento y cultivo de rebanadas cardíacas humanas para pruebas de fármacos preclínicos y detalla el uso de mapeo óptico para registrar el voltaje transmembrano y las señales de calcio intracelular simultáneamente a partir de estas rebanadas.

Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Este protocolo es significativo porque proporciona a los investigadores las habilidades para emplear corazones humanos donantes para pruebas de drogas fisiológicas preclínicas. Este tejido utiliza tanto el voltaje como los tintes de calcio para la caracterización simultánea de potenciales de acción cardíaca y transitorios de calcio intracelular en las rodajas de tejido humano. Para configurar el sistema de mapeo óptico, conecte un baño de tejido con una capa de gel polidimetilsiloxano inferior a un sistema de perfusión y circule un litro de solución de recuperación a 37 grados Celsius oxigenado con 100% de oxígeno a través del sistema de perfusión a un caudal lo suficientemente rápido como para mantener la temperatura y evitar la acumulación de baño perfundido.A continuación, utilice un objetivo para ajustar el enfoque y la alineación de las dos cámaras CMOS y utilice una fuente de luz LED verde con una longitud de onda de 520 más o menos cinco nanómetros para excitar los tintes sensibles al voltaje y del indicador de calcio simultáneamente. Antes de obtener secciones de tejido, mezcle la solución de cardioplegia congelada y líquida y coloque el tejido cardíaco en el baño de cardio

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Bioingeniería

En este artículo se describe una técnica de alta resolución temporal y espacial de la imagen ópticamente movimiento de acción potencial en la superficie de los corazones de rata Langendorff perfundidos con un tinte potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos

En este artículo se describen los procedimientos básicos para la realización de experimentos ópticos de asignación en el corazón de conejo Langendorff perfundidos con el sistema de imágenes panorámicas, y el doble (voltaje y calcio) modalidad de imagen.

Multiparamétrico óptico Cartografía del corazón de conejo Langendorff perfundidos

Este documento detalla el procedimiento de disección, la configuración instrumental y las condiciones experimentales durante el mapeo óptico del potencial de membrana (Vm) y el calcio intracelular transitoria (CAT) en Langendorff perfundidos aislados intactos los corazones de ratón.

Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

Este artículo describe la técnica utilizada para realizar el mapeo óptico de doble canal en monocapas de células auriculares HL-1 cultivadas. Este protocolo único permite la visualización simultánea de la actividad del calcio (Ca) y el voltaje (Vm) en la misma área para la detección y el análisis detallados de las propiedades electrofisiológicas de las monocapas de cultivo.

Tensión y calcio Dual Channel Mapping óptico de Cultivadas HL-1 auricular miocitos monocapa

En este artículo se describe el protocolo detallado y equipos necesarios para el mapeo óptico dual de potencial transmembrana (V m) y libre retículo intra-sarcoplásmico (SR) Ca 2+ en el corazón de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite la observación directa y la cuantificación de V m y SR Ca 2+ dinámica en el corazón intacto.

Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos Langendorff

Este protocolo describe la evaluación electrofisiológica de atria murino utilizando un sistema de mapeo óptico con una alta resolución espacial y temporal, incluyendo grabaciones duales de la tensión de la membrana y Ca2 + transitoria bajo programado estimulación a través de un catéter electrodo especializados.

Evaluación electrofisiológica de Atria murino con mapeo óptico alta resolución

Aquí, presentamos un protocolo para la modulación del sistema de nervioso autónomo intracardiaca y la evaluación de su influencia en la electrofisiología básica, arritmogénesis y campo dinámica utilizando una configuración de Langendorff ex vivo .

Impacto de las neuronas intracardiacas sobre la electrofisiología cardíaca y arritmogénesis en un sistema de Langendorff Ex Vivo

El objetivo de este estudio fue establecer un método para investigar la dinámica cardíaca utilizando un modelo animal traslacional. El enfoque experimental descrito incorpora optocardiografía de doble emisión junto con un estudio electrofisiológico para evaluar la actividad eléctrica en un modelo de corazón porcino aislado e intacto.

Estudios de Optocardiografía y Electrofisiología de Corazones Perfundidos Ex Vivo Langendorff

Presentamos un protocolo para evaluar los efectos electromecánicos de la activación de GtACR1 en cardiomiocitos de conejo. Proporcionamos información detallada sobre el aislamiento celular, el cultivo y la transducción adenoviral, y sobre experimentos funcionales con las técnicas de abrazadera de parche y fibra de carbono.

Evaluación electromecánica de la actividad de cardiomiocitos moduladas optogenéticamente

Este protocolo introduce el mapeo óptico de doble colorante de corazones de ratón obtenidos de animales de tipo salvaje y knock-in afectados por taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, incluyendo mediciones electrofisiológicas de voltaje transmembrana y transitorios intracelulares de Ca2+ con alta resolución temporal y espacial.

Mapeo óptico de doble colorante de corazones a partir de ratones knock-in RyR2R2474S de taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica

Aprende a realizar mapeo óptico de voltaje y calcio en rebanadas cardíacas humanas para evaluación electrofisiológica preclínica. Este método permite caracterizar simultáneamente potenciales de acción y transitorios de calcio intracelular.

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Evaluación de electrofisiología cardíaca preclínica por doble voltaje y mapeo óptico de calcio de cortes cardíacos organotípicos humanos

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