Name: Agrobacterium-Transformación de embriones inmaduros mediados de líneas endogámicas de maíz recalcitrante utilizando genes morfogénicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprende el método QuickCorn para transformación genética de maíz recalcitrante mediante Agrobacterium y genes morfogénicos BABY BOOM y WUSCHEL. Este protocolo elimina la etapa de inducción de callo y mejora la eficiencia en líneas endogámicas difíciles.

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Agradecemos al equipo de invernadero de Corteva por proporcionar orejas inmaduras de maíz, el laboratorio de preparación de medios de Corteva para proporcionar asistencia en la fabricación de medios, Ning Wang de Corteva por ayuda con la construcción Debacterium, y Keunsub Lee de la Universidad Estatal de Iowa para obtener ayuda. Este proyecto fue apoyado parcialmente por el Programa de Investigación del Genoma Vegetal de la Fundación Nacional de Ciencias 1725122 y 1917138 a K.W., por el Programa de Prácticas de Investigación en Fenómica de Plantas Predictivas (National Science Foundation Grant DGE-1545453) a J.Z., por el proyecto NIFA Hatch del USDA #IOW04341, por fondos del Estado de Iowa, y por el Centro de Bioingeniería crop de la Universidad Estatal de Iowa.

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Alicia Masters, William Gordon-Kamm y Todd Jones son empleados de Corteva Agriscience que suministraban el protocolo y las orejas de maíz de B73, Mo17 y W22 utilizados en este artículo. Los autores Minjeong Kang, Morgan McCaw, Jacob Zobrist y Kan Wang no tienen nada que revelar.

Los protocolos tradicionales para la transformación del maíz siguen el paradigma de aislar embriones cigoticos inmaduros para producir tejido caldo transgénico, que se regenera en plantas fértiles4,6. Si bien esto es eficaz, los protocolos basados en callos pueden llevar mucho tiempo, y a menudo toma hasta 3 meses para que el proceso de cultivo de tejidos produzca plantas. Lo que hace que el método presentado aquí sea significativo es que es libre de calus, eficiente, rápido, y permite la regeneración de plantas T0 en aproximadamente la mitad del período de tiempo. También parece ser menos dependiente del genotipo y, por lo tanto, puede ser eficaz para la mayoría de los endogámicos disponibles al público8,11.
Si bien todos los pasos deben seguirse de manera efectiva, es imperativo una preparación correcta de los medios de crecimiento. Los componentes de los medios de crecimiento deben añadirse en las etapas correctas, tanto antes como después del autoclave, para garantizar que el material vegetal reciba la concentración adecuada de productos químicos. Esto asegurará que los compuestos sensibles como los antibióticos no se descompongan. También es importante que el material vegetal se coloque en el medio de crecimiento correcto en cada etapa, como se indica en el protocolo. No colocar material en el medio de crecimiento adecuado puede resultar en la muerte material. Además, se debe evitar la colocación de demasiados embriones o el desarrollo de tejidos en las placas. Mientras que la colocación del doble de piezas de tejido puede ahorrar el costo de los productos químicos y los platos de Petri (e incluso el espacio de la incubadora), el crecimiento de tejido en placas superpobladas puede ser seriamente inhibido. Durante la realización de la infección, debe asegurarse de que la densidad óptica de la suspensión Debacterium es adecuada. Si la densidad de la suspensión bacteriana es demasiado baja, es posible que no se produzca una infección adecuada.
La calidad de los materiales de partida es esencial para el éxito en los protocolos de transformación. Las orejas utilizadas para la disección embrionaria deben ser saludables, lo que significa que la planta que los produce es saludable. También deben poseer un conjunto adecuado de semillas y estar libres de plagas y enfermedades. Además, no se debe utilizar Agrobacterium antiguo. El plato de "madre" no debe tener más de 2 semanas de edad. Después de este punto, una nueva placa "madre" debe ser rayada para comenzar nuevos experimentos.
Si bien se ha demostrado que este método es menos dependiente del genotipo, no se puede suponer que todas las líneas tendrán el mismo éxito. Todavía puede haber variación entre las líneas, así como diferencias en el éxito basadas en la construcción que se utiliza. La variabilidad de oído a oído también es inevitable cuando se trabaja con embriones inmaduros, por lo que lo ideal es que los experimentos usen múltiples orejas para explicar esto. En este trabajo, endogámico W22 tuvo el mejor desempeño, con una frecuencia de transformación superior al 14 %, seguido de B73 y Mo17 (4% cada uno). 8 informaron utilizando el protocolo QuickCorn para la transformación B73 y Mo17. En este trabajo, las frecuencias de transformación oscilaron entre 9%-50% para B73 y 15%-35% para Mo17.
Una posibilidad para las frecuencias de transformación más bajas para B73 y Mo17 observadas en este trabajo puede atribuirse a la fluctuación estacional de la calidad del oído. Otra diferencia entre este trabajo y el de Lowe et al.8 es que aquí se utilizaron diferentes construcciones vectoriales. En el trabajo de Lowe, los genes morfogénicos no fueron eliminados de las plantas transformadas, sino más bien silenciados en el desarrollo en las etapas posteriores. En este trabajo, los genes morfogénicos se eliminaron 8 días después de la infección. Es posible que B73 y Mo17 necesiten una presencia más larga de Bbm/Wus2 para el desarrollo de embriones somáticos.
Utilizando este método, existe la posibilidad de obtener plantas de escape no transgénicas, inserciones multiméricas y transgenes sin extirter. Estas plantas no tendrán un fenotipo notablemente diferente, por lo que se requiere la detección por PCR para determinar si una planta es transgénica. Para lograrlo, se pueden emplear imprimaciones de ITP dentro de la región extirpada y imprimaciones que flanquean la región extirpada. Múltiples transformaciones independientes también pueden producir plantas a partir del mismo embrión inmaduro, lo que dificulta la determinación de la tasa de recuperación transformadora independiente total. Nuestro estándar ha sido calcular una tasa de transformación basada en el muestreo de una planta de cada embrión inmaduro que produjo plantas y dividiendo esto por el número de embriones infectados. Este método casi con seguridad subestima el número real de eventos independientes recuperados como plantlets. La discriminación entre eventos independientes del mismo embrión requiere la secuenciación de regiones fronterizas alrededor de transgenes, y esto será prohibitivamente costoso y llevará mucho tiempo para la mayoría de las aplicaciones; sin embargo, puede haber casos en los que estos datos son útiles.
Este método de transformación del cultivo de tejidos ha demostrado ser muy eficaz, pero todavía pueden ocurrir problemas. Si el material vegetal no responde, es posible que haya un problema con la línea endogámica particular, lo que sugiere que variables como la composición de los medios de crecimiento y el momento de la subcultura requieren ajustes. Otra variable es el diseño vectorial adecuado y la construcción vectorial precisa, si se altera el vector original. También puede haber problemas con la sensibilidad imazapyr, ya que algunas líneas son más sensibles que otras, y la concentración de imazapyr puede necesitar ser ajustada para lograr plantas transformadas con éxito.
En los últimos 30 años, el cultivo de tejidos de maíz y los protocolos de transformación han cambiado y progresado; y se cree que este protocolo acortado promoverá esta progresión. Este método es eficaz para los entornos académicos porque consume menos tiempo que los métodos tradicionales. Además, no demanda operadores altamente capacitados, por lo que es más susceptible a una distribución generalizada en comparación con los métodos tradicionales. En el futuro, este método se puede combinar con nuevas tecnologías como la ingeniería del genoma.

La transformación es una herramienta básica para evaluar la expresión génica extraña en el maíz y producir líneas de maíz modificadas genéticamente tanto para fines de investigación como comerciales. El acceso a una transformación de alto rendimiento puede facilitar la creciente necesidad de estudios de biología molecular y celular de maíz1. La capacidad de transformar genéticamente las especies de cultivos es vital para los laboratorios públicos y privados. Esto permite tanto la comprensión fundamental de los mecanismos de regulación genética como la mejora de los cultivos a escala mundial para apoyar a una población en constante crecimiento.
El descubrimiento de que los embriones inmaduros del maíz podrían utilizarse para la producción de callos regenerables originado en 19752. Desde esta revelación, la mayoría de los protocolos de transformación de maíz escalables han requerido la formación y selección de callos antes de la regeneración3. Durante el proceso de transformación genética, agrobacterium-embriones inmaduros infectados o biolisticos-bombardeados se cultivan en medios para la inducción del callo embriogénico. Los calli inducidos se cultivan en medios selectivos (por ejemplo, que contienen un herbicida) de modo que sólo las piezas de callo transformadas puedan sobrevivir. Estos calli transgénicos putativos resistentes a los herbicidas se abultan y se regeneran en plantas. Si bien este método es eficaz, el proceso es largo y laborioso, y puede tomar más de 3 meses para completar4. Más importante aún, los protocolos convencionales de transformación del maíz poseen una limitación mucho mayor, es decir, sólo un número limitado de genotipos de maíz se pueden transformar5,6.
7,8 informaron anteriormente de un método de transformación "QuickCorn" que no sólo redujo en gran medida la duración del proceso de transformación, sino que también amplió la lista de genotipos transformables. El método QuickCorn utiliza ortologs de maíz (Zm-Bbm y Zm-Wus2) de los factores de transcripción de Arabidopsis BABY BOOM (BBM)9 y WUSCHEL (WUS)10. Cuando se incorporan en el sistema vectorial de transformación, estos genes trabajan sinérgicamente para estimular el crecimiento embrionario7.
El protocolo QuickCorn descrito en este trabajo se basó en el protocolo de Jones et al11, que fue una mejora adicional del método reportado por Lowe et al7,8. En el presente estudio, se utiliza para la transformación una cepa Debacterium LBA4404(Thy-) que alberga una construcción vectorial binaria PHP81430(Figura 1)y plásmido accesorio PHP7153912. El ADN-T de PHP81430 contiene los siguientes componentes moleculares. (1) El gen de marcador selectivo de transformación Hra expression cassette. El gen Hra de maíz (Zm-Hra) es un gen de acetolactasa sintasa (ALS) modificado que es tolerante a los herbicidas inhibidores de la ELA como las sulfonilareas y las imidazolinonas13,14. El gen Zm-Hra está regulado por el promotor de la ALS de sorgo8 y el inhibidor de la proteína de patata II(pinII) terminador15. El ADN-T también contiene (2) un casete de expresión que posee el gen marcador de transformación screenable ZsGreen. Este gen de proteína fluorescente verde ZsGreen de Zoanthus sp. coral de arrecife16 está regulado por un promotor/intron de la ubiquitina de sorgo y terminador de ubiquitina de arroz.
Además, el ADN-T contiene (3) el gen morfogénico del casete de expresión Bbm. Bbm es un factor de transcripción asociado con el desarrollo embrionario9,17. Bbm está regulado por el promotor de la proteína de la fosfolípido sin transferencia de maíz (Pltp)8 y el arroz T28 terminator18. Zm-Pltp es un gen con fuerte expresión en el epitelio escutellar embrionario, pelos de seda y células subsidiarias de las hojas (que flanquean las células de protección), baja expresión en órganos reproductivos, y ninguna expresión en las raíces8. También contiene (4) el gen morfogénico del casete de expresión Wus2. Wus2 es otro factor de transcripción asociado con el mantenimiento del meristem apical19. Zm-Wus2 está bajo el control de un promotor inducible de auxina de maíz (Zm-Axig1)20 y maíz In2-1 terminador21. Por último, el ADN-T contiene (5) el sistema de recombinación cre-loxP. El gen cre recombinase22 está bajo el control de la proteína de choque térmico de maíz 17.7 (Hsp17.7)23 promotor y terminador de pinII de patata. Dos sitios loxP (en la misma orientación)24 flanquean cuatro casetes de expresión génica incluyendo ZsGreen, cre, Bbm y Wus2.
Debido a que la presencia de los genes morfogénicos no se desea para la madurez de las plantas y la progenie posterior, el sistema de recombinación de cre-loxP inducido por calor se incorporó en el ADN-T para eliminar genes morfogénicos del genoma del maíz para permitir la regeneración normal del caldo y el desarrollo de las plantas. Tras el tratamiento térmico, la expresión de la proteína CRE elimina todos los transgenes excepto el gen de selección Hra. Los transformadores exitosos deben ser resistentes a los herbicidas, pero ZsGreen-negativo. Para mejorar aún más la frecuencia de transformación, la cepa Agrobacterium también alberga un plásmido accesorio adicional (PHP71539) que tiene copias adicionales de los genes de agrobacterium virulence (vir)12.
El método QuickCorn es diferente de los protocolos de transformación de maíz convencionales, ya que no implica un paso de inducción de callos durante la transformación. Durante la primera semana después de la infección con Agrobacterium,se desarrollan embriones somáticos en el epitelio escutelar de los embriones inmaduros infectados. Los embriones se transfieren a un medio con hormonas que fomentan la maduración de embriones y la formación de brotes. La rápida transferencia de embriones somáticos al medio de maduración/formación de brotes se salta la etapa tradicional de callo utilizada anteriormente para la transformación del maíz y permite la generación directa de plantas T08. En comparación con los métodos de transformación de maíz publicados anteriormente6, el método QuickCorn es más rápido, más eficiente y menos dependiente del genotipo. Usando este método, las plantas enraizadas están típicamente listas para transferir al suelo en sólo 5-7 semanas, en lugar de los tres o más meses requeridos por los protocolos tradicionales. El propósito de este artículo es proporcionar una descripción en profundidad y una demostración del método, lo que permite una replicación más fácil en un entorno de laboratorio que normalmente se encuentra en la mayoría de las instituciones académicas.

<table><tbody><tr><td>2,4-D</td><td>Millipore Sigma</td><td>D7299</td><td></td></tr><tr><td>6-Benzilaminopurina (BAP)</td><td>Millipore Sigma</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>Acetosiringona</td><td>Millipore Sigma D134406</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7921</td><td></td></tr><tr><td>Papel</td><td></td><td></td> de aluminio <td>Para cubrir el matraz</td></tr><tr><td>Sulfato de amonio</td><td>Millipore Sigma</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Balanza</td><td></td><td></td> analítica <td>Para pesar pequeñas cantidades de productos químicos</td></tr><tr><td>Autocalve</td><td>Primus (Omaha, NE)</td><td>PSS5-K</td><td>Para medios y herramientas de autoclave</td></tr><tr><td>Bucle de cultivo bacteriano (10 &micro; l)</td><td>Fisher scientific</td><td>22-363-597</td><td>Recoge Agrobacterium de la placa para transferirlo a líquido</td></tr><tr><td>Bactoagar</td><td>BD bioscience</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Vasos de precipitados (1 L, 2 L, 4 L)</td><td></td><td></td><td>Para mezclar los productos químicos para medios</td></tr><tr><td>Benomyl</td><td>Millipore Sigma</td><td>#45339</td><td></td></tr><tr><td>Bleach (8.25% Hipoclorito de Sodio)</td><td>Clorox</td><td></td><td>Para la esterilización de semillas</td></tr><tr><td>Ácido Bórico</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de Calcio Dihidratado</td><td>Millipore Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina</td><td>Millipore Sigma</td><td>C3416</td><td></td></tr><tr><td>Hidrolizado de Caseína</td><td>Phytotech</td><td>C184</td><td></td></tr><tr><td>Cefotaxima</td><td>Phytotech</td><td>C380</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico (50 mL)</td><td>Fisher scientific</td><td>06-443-19</td><td>Contiene medio líquido y Agro suspensión</td></tr><tr><td>Cubeta (Semi-micro)</td><td>Fisher scientific</td><td>14955127</td><td>Para retener líquido para medir OD</td></tr><tr><td>Dicamba</td><td>Phytotech</td><td>D159</td><td></td></tr><tr><td>Higrómetro</td><td></td><td></td> digital <td>Comprobación de la temperatura y la humedad para el tratamiento térmico</td></tr><tr><td>EDTA, sal disódica, dihidrato</td><td>Millipore Sigma</td><td>324503</td><td></td></tr><tr><td>tubo Eppendorf (2.0 mL)</td><td>ThermoFischer Scientific AM12475</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eriksson's Vitamins</td><td>Phytotech</td><td>E330</td><td>1000x en etanol líquido</td></tr><tr><td>(70%)</td><td></td><td></td><td>Herramientas y superficies de esterilización</td></tr><tr><td>Sulfato ferroso Heptahidratado</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8263</td><td></td></tr><tr><td>Fertilizante, Osmocote Plus 15-9-12</td><td>ICL Fertilizantes especiales (Dublín, OH)</td><td>A903206</td><td>Matraz de fertilizante</td></tr><tr><td>(2 L)</td><td>Pyrex</td><td>10-090E</td><td>Para medios y herramientas de autoclave</td></tr><tr><td>Planos (Estándar 1020, abiertos con agujeros, 11" de ancho x 21.37" de largo x 2.44"D)</td><td>Hummert International (Earth City, Missouri)</td><td>11300000</td><td>Bandeja para sujetar tierra e inserto de maceta, se adapta a pinzas de humidomo</td></tr><tr><td>(de punta fina y grandes)</td><td></td><td></td><td>Fina para manipular embriones; más grande para materiales vegetales grandes y uso como soportes</td></tr> <tr><td>de orejasGentamicin</td><td>Gold Biotechnologies</td><td>G-400</td><td></td></tr><tr><td>Botella de vidrio (1 L)</td><td>Pyrex</td><td>06-414-1D</td><td>Para medio de autoclave</td></tr><tr><td>Cilindro</td><td></td><td></td> graduado <td>Para ajustar el volumen de los medios</td></tr><tr><td>Imazapyr</td><td>Millipore Sigma</td><td>37877</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora, 20 & deg; C</td><td>Percival Modelo Científico</td><td>I-36NL</td><td>Para cultivar placa madre e incubar embriones durante la Incubadora de infección agrícola</td></tr><tr><td>, 27 &deg; C</td><td>Percival Scientific Model</td><td>I-36NL</td><td>Para el cultivo en placa de cocultivo y cultivo de embriones de maíz</td></tr><tr><td>Incubadora, 45 &deg; C</td><td></td><td></td><td>Tratamiento de choque térmico</td></tr><tr><td>Inserto TO Standard, macetas</td><td>Hummert International (Earth City, Mo)</td><td>11030000</td><td>Para el trasplante de plantas desde el enraizamiento hasta el suelo, se adapta a la cubierta plana y Humidome</td></tr><tr><td>Laminar</td> flow Mantiene <td></td><td></td><td>las condiciones estériles</td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Phytotech</td><td>P698</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio Heptahydrate</td><td>Millipore Sigma</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>Semilla endogámica de maíz B73</td><td>Germoplasma Vegetal Nacional de EE. UU</td><td>. id=47638</td><td></td></tr><tr><td>Semilla endogámica de maíz Mo17</td><td>Germoplasma Vegetal Nacional de EE. UU</td><td>. id=15785</td><td></td></tr><tr><td>Semilla endogámica de maíz W22</td><td>Germoplasma Vegetal Nacional de EE. UU</td><td>. id = 61755</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de manganeso</td><td>Monhidrato Millipore Sigma</td><td>M7899</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Sistemas</td> <td>de purificación de aguaMillipore sigma</td><td>MILLIQ</td><td>Para agua de grado de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>MS Medio basal</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5519</td><td></td></tr><tr><td>MS Mezcla de sales basales</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>N6 Mezcla de sales basales</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1416</td><td></td></tr><tr><td>Clips, antideslizantes</td><td></td><td></td><td>Sujeción en bolsas de borlas</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BD bioscience</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (100x15 mm)</td><td>Fisher scientific</td><td>FB0875713</td><td>Para medio de cultivo de bacterias</td></tr><tr><td>Placa de Petri (100x25 mm)</td><td>Fisher scientific</td><td>FB0875711</td><td>Para el medio de cultivo de tejidos vegetales</td></tr><tr><td>Medidor de pH</td><td>Fisher scientific</td><td>AB150</td><td>Para ajustar el pH del medio</td></tr><tr><td>Pipeta (1 mL)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4641100N</td><td></td></tr><tr><td>Cajas de plástico</td><td>The Container Store</td><td>10048430</td><td>Para el almacenamiento y la incubación de cultivos de tejidos</td></tr><tr><td>Cúpula húmeda de plástico (Humi-Dome)</td><td>Hummert International (Earth City, Mo)</td><td>14385100</td><td>Cubierta de plástico para suelo plano</td></tr><tr><td>Millipore de yoduro de potasio</td><td>Sigma 793582</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrato de potasio</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8291</td><td></td></tr><tr><td>Millipore monobásico de fosfato de potasio</td><td> Báscula Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Para pesar productos químicos para medios</td>Hoja de bisturí (n.º 11, 4 cm)Thermo Scientific 3120030 Retire la parte superior de las coronas del grano para la disección del embrión Mango de bisturí Sujetar las hojas de bisturí Schenk &<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hildebrandt Vitamina (S& Vitamina H)</td><td>Phytotech</td><td>S826</td><td>100x polvo</td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Corte de brotes de orejas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolsa de brotes (Canvasback- semitransparente)</td><td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td><td>S26</td><td>Bolsa semitransparente para cubrir los brotes de las orejas</td></tr><tr><td>Nitrato de plata</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7276</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato de Sodio Dihidratado</td><td>Millipore Sigma</td><td>M1651</td><td></td></tr><tr><td>Sustrato Soiless LC1</td><td>SunGro Horticulture (Agawam, Ma)</td><td>#521</td><td>Para el cultivo de plantas</td></tr><tr><td>de maíz Espátula (microcónica de doble punta)</td><td>Fischer Scientific</td><td>2140110</td><td>Diseccionar embriones a partir de granos</td></tr><tr><td>Espátula (con cuchara)</td><td>Fisher scientific</td><td>14-375-10</td><td>Para medir productos químicos para medios</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Millipore Sigma</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro (Genesys 10S UV-Vis)</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-300000</td><td>Medición OD de la suspensión Agro</td></tr><tr><td>Barra agitadora</td><td>Fisher scientific</td><td>14-513-67</td><td>Para mezclar medios</td></tr><tr><td>Agitar placas calefactoras</td><td></td><td></td><td>Para mezclar medios</td></tr><tr><td>Jeringa (sin aguja, 60 mL)</td><td>Fisher scientific</td><td>14-823-43</td><td>Para esterilización de filtros</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa (0.22 y micro; m)</td><td>Fisher scientific</td><td>09-720-004</td><td>Para la esterilización del filtro</td></tr><tr><td>Bolsa de borlas (Canvasback- marrón)</td><td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td><td>T514</td><td>Bolsa para cubrir borlas de plantas no transgénicas</td></tr><tr><td>Bolsa de borlas (Canvasback-raya verde)</td><td>Seedburo (Des Plaines, IL)</td><td>T514G</td><td>Bolsa para cubrir borlas de plantas transgénicas</td></tr><tr><td>Tiamina HCl</td><td>Phytotech</td><td>T390</td><td></td></tr><tr><td>Thidiazuron</td><td>Phytotech</td><td>T888</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1895</td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>Phytotech</td><td>T869</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cas #9005-64-5</td><td>surfactante</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI0236</td><td>Homogeneiza líquidos (Agro suspensión)</td></tr><tr><td>Baño de agua (grande - Modelo de precisión 186)</td><td>Fisher scientific</td><td>cualquiera que pueda caber en 4+ matraces de 2L y alcanzar 55 &deg; C</td><td>Mantiene los medios esterilizados en autoclave a una temperatura óptima</td></tr><tr><td>Plato de pesaje</td><td>Fisher scientific</td><td>08-732-112</td><td>Para medir productos químicos para medios</td></tr><tr><td>Papel de pesaje</td><td>Fisher scientific</td><td>09-898-12A</td><td>Para medir productos químicos para medios</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP14222</td><td></td></tr><tr><td>Zeatin</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z0164</td><td></td></tr></tbody></table>

agrobacterium-transformación de embriones inmaduros mediados de líneas endogámicas de maíz recalcitrante utilizando genes morfogénicos

Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes

Aquí se muestra un protocolo detallado para la transformación genética mediada por Agrobacteriumde las líneas endogámicas de maíz utilizando genes morfogénicos Baby boom (Bbm) y Wuschel2 (Wus2). Bbm está regulado por el promotor del gen de la fosfolípido sin transferencia de maíz (Pltp), y Wus2 está bajo el control de un promotor inducible de auxina de maíz (Axig1). Una cepa de Agrobacterium que transporta estos genes morfogénicos en el ADN de transferencia (ADN-T) y copias adicionales de los genes de virulencia de Agrobacterium (vir) se utilizan para infectar explantes de embriones inmaduros de maíz. Los embriones somáticos se forman en la escutella de embriones infectados y pueden ser seleccionados por resistencia a herbicidas y germinados en plantas. Un sistema de recombinación de cre/loxP activado por calor integrado en la construcción del ADN permite la eliminación de genes morfogénicos del genoma del maíz durante una etapa temprana del proceso de transformación. Las frecuencias de transformación de aproximadamente 14%, 4% y 4% (números de eventos transgénicos independientes por cada 100 embriones infectados) se pueden lograr para W22, B73 y Mo17, respectivamente, utilizando este protocolo.

Aquí se muestra un protocolo paso a paso para la transformación genética mediada por Agrobacteriumde tres líneas de endogámica de maíz público (B73, Mo17 y W22) que han sido significativas en el campo de la genética del maíz. La transformación de las tres líneas endogámicas no pudo lograrse utilizando los protocolos convencionales de transformación del maíz5. La Figura 1 y la Figura 2 muestran los materiales de construcción y de partida, respectivamente, utilizados aquí. Las orejas generalmente se cosechan 9-12 días después de la polinización. Los Izes con longitudes que oscilan entre 1,5-2,0 mm son los mejores explantes para la transformación de este protocolo(Figura 2).
Ocho días después de la infección, ZsGreen-expresando embriones somáticos fueron visualizados bajo el canal GFP de un microscopio fluorescente (Figura 3). Los IME infectados fueron sometidos a tratamiento térmico 8 días después de la infección (pasos 5.1 y 5.2). Este tratamiento indujo la expresión de recombinación de CRE que extirpó los casetes de expresión Bbm, Wus2, crey ZsGreen flanqueados entre los dos sitios loxP (Figura 1). Los tejidos tratados térmicamente se cultivaron en el medio de formación de brotes que contenía el herbicida imazapyr para la selección de tejido transformado después de la eliminación del gen morfogénico.
Se observaron tejidos proliferantes con embriones maduradores o brotes de brotes resistentes a imazapyr alrededor de 3-4 semanas después de la infección(Figura 4). Algunos tejidos resistentes a imazapyr fueron negativos para ZsGreen, lo que sugiere que la escisión mediada por creprobablemente ocurrió en estos tejidos(Figura 4). Después de que los tejidos se movieron a medio de enraizamiento y incubación de luz, los brotes comenzaron a desarrollarse(Figura 5). Se cosecharon brotes de crecimiento saludable y vigoroso con raíces bien desarrolladas (Figura 5). Algunos tejidos parecían tener múltiples brotes(Figura 5E,F,G). Este tipo de regenerador "hierba" puede deberse a plantas clonales que tienen patrones idénticos de integración de transgenes. Se requiere un análisis biológico molecular para genotipo de estas plantas.
Las tres líneas endogámicas públicas respondieron bien utilizando este protocolo, así como la construcción utilizada en este trabajo. W22 produjo la mayor frecuencia de brotes resistentes a imazapyr, con una frecuencia de aproximadamente 14% (alrededor de 14 brotes transgénicos por cada 100 embriones inmaduros infectados). Tanto B73 como Mo17 produjeron alrededor del 4% de brotes transgénicos. Estas frecuencias indican todos los brotes transgénicos, incluyendo tanto plantas portadoras de genes morfogénicos como plantas con el gen morfogénico eliminado por la escisión mediada por CRE.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig1.jpg"> Figura 1: Representación esquemática de la región T-DNA del plásmido binario PHP81430. RB - borde derecho de T-DNA; loxP - sitio de destino de recombinación de CRE; Axig1pro:Wus2 - promotor inducible de auxina de maíz (Zm-Axig1) + Zm-Wus2 + terminador de maíz In2-1; Pltppro:Zm-Bbm - proteína fosfolípido sólido transferasa de maíz (Zm-Pltp) promotor + Zm-Bbm + arroz T28 terminador (Os-T28); Hsppro:cre - proteína de choque térmico de maíz 17.7 promotor (Zm-Hsp17.7) + cre recombinase gene + inhibidor de la proteína de patata II (pinII) terminador; Ubipro:ZsGreen - sorgo ubiquitina promotor/intrón (Sb-Ubi) + proteína fluorescente verde ZsGreen gene + terminador de ubiquitina de arroz (Os-Ubi); Cassette hra - sorghum acetolactase sintasa (Sb-Als) promotor + maíz Hra (Zm-Hra) gene + terminador pinII; LB - borde de ADN-T izquierdo; colE1, origen de replicación del plásmido ColE125; EspecificaciónR - gen resistente a la espectromicina aadA1 de Tn21 para la selección de bacterias26; Rep A,B,C - origen de replicación de pRiA4 de Agrobacterium rhizogenes27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig2c.jpg"> Figura 2: Materiales de arranque. B73 orejas cosechadas 12 días después de la polinización (A). Embriones inmaduros de B73 (B), Mo17 (C) y W22 (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig3c.jpg"> Figura 3: Desarrollo de tejidos en el medio de reposo 1 semana después de la infección. Embriones (8 días después de la infección) bajo un microscopio de florescencia (filtro GFP) que muestra GFP expresando embriones somáticos de Mo17 (A) y W22 (B). Tejido en desarrollo (B73) bajo campo brillante (C) y filtro GFP (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig4c.jpg"> Figura 4: Desarrollo de tejidos en medio de maduración con selección. Una placa de maduración W22 (A). Tejido en desarrollo (Mo17, 15 días después de la infección) bajo campo brillante (B) y filtro GFP (C). Tejido en desarrollo (Mo17, 28 días después de la infección) bajo campo brillante (D) y filtro GFP (E). Las flechas apuntan a la regeneración de tejidos que carecen de expresión GFP, lo que sugiere la escisión del gen ZsGreen entre los sitios loxP después de la actividad de proteína CRE inducida por el calor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60782/60782fig5c.jpg"> Figura 5: Desarrollo de tejidos en medios de enraizamiento. Disparos de W22 (A), B73 (B) y Mo17 (C,D). Evento con múltiples brotes (regenerantes herbáceos) de B73 (E) y W22 (F,G). Dispara con raíces de B73 (H) y W22 (I). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/60782fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Composiciones de medios para la transformación del maíz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60782/table1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para ver esta tabla (haga clic con el botón derecho para descargar).</a>

Los genes morfogénicos de las plantas se pueden utilizar para mejorar la transformación genética de los genotipos recalcitrantes. Aquí se describe un protocolo de transformación genética mediada por Agrobacterium(QuickCorn) para tres importantes líneas de maíz público endogámico.

Agrobacterium-Transformación de embriones inmaduros mediados de líneas endogámicas de maíz recalcitrante utilizando genes morfogénicos

Demonstrated here is a detailed protocol for Agrobacterium-mediated genetic transformation of maize inbred lines using morphogenic genes Baby boom (Bbm) ...

La mayoría de las líneas endogázcas de maíz no pueden transformarse genéticamente utilizando protocolos de transformación convencionales. Aquí, describimos un método de transformación QuickCorn que es rápido y menos dependiente del genotipo. El método QuickCorn utiliza factores de transcripción de maíz BABY BOOM y WUSCHEL.Cuando se incorporan en el sistema vectorial de transformación, estos genes trabajan sinérgicamente para estimular el crecimiento embrionario. A diferencia de los protocolos convencionales de transformación del maíz, el método QuickCorn no implica un paso de inducción del callo durante la transformación. La región de ADN-T del vector binario utilizado en nuestro trabajo contiene tres componentes clave, genes morfogénicos, genes marcadores y el sistema de recombinación cre/loxP.El sistema de recombinación cre/loxP inducido por el calor se incluyó en el ADN-T para eliminar los genes morfogénicos del genoma del maíz para permitir la regeneración normal del callo en el desarrollo de las plantas. Aproximadamente dos o tres días después de que las sedas hayan surgido y si el polen estará disponible al día siguiente, cortar las sedas y la cáscara con 70%tijeras esterilizadas con etanol, aproximadamente 2 1/2 centímetros por debajo del extremo de las hojas de cáscara, donde emergen las sedas, y cubrir la seda con una bolsa de tiro. Una vez que las anteras emergen de una borla, cubra la borla con una bolsa de borlas y coloque un clip de papel antideslizante en la base de la bolsa alrededor del tallo.La mañana después de colocar la bolsa de borlas, doble suavemente la planta y toque la bolsa para fomentar la liberación del polen. A continuación, retire la bolsa de borlas y doble la parte superior de la bolsa para evitar que el polen escape. Para polinizar una planta receptora, exponga las sedas y vierta rápidamente el polen de la bolsa de borlas sobre las sedas.Cubra inmediatamente la oreja polinizada con la bolsa de borlas y fije la base de la bolsa alrededor del tallo con grapas. Para comprobar el tamaño del embrión inmaduro, de nueve a 12 días después de la polinización, tire suavemente hacia abajo de la cáscara para exponer los granos a aproximadamente 1/3 a 1/4 de la circunferencia del oído y aproximadamente 1/3 de la distancia por la oreja. Utilice un bisturí para cortar la tapa de un solo núcleo que parezca similar a la mayoría de otros núcleos en tamaño y color, y utilice una espátula con una regla para extraer el embrión.A continuación, utilice la regla o una pinza para medir la longitud del embrión. Dentro de uno a cuatro días de cosecha, retire las cáscaras y sedas de las orejas cosechadas, e inserte un mango apropiado en la parte superior o en la base de cada oreja. Sumerja las orejas en un recipiente grande de solución de lejía de desinfección en una capucha de flujo laminar estéril con el mango hacia arriba.Después de 20 minutos, enjuague las orejas tres veces con un volumen generoso de agua destilada estéril fresca durante cinco minutos por lavado antes de dejar que las orejas se sequen durante varios minutos. A continuación, llene un tubo de microcentrífuga de dos mililitros por oído con un medio líquido 700A, y utilice un bisturí estéril para quitar la parte superior de uno a dos milímetros de cada corona del núcleo para exponer el endospermo de la oreja. Localice el embrión inmaduro dentro del núcleo en el lado frente a la punta de la oreja, cerca de la unión a la mazorca.Para los operadores de manipulador superior y diestro, descanse la oreja sobre un plato de Petri estéril grande e inserte una micro espátula en el endospermo en el pericarpo más alejado del embrión. Gire suavemente hacia arriba para desalojar el endospermo y exponer el embrión, y utilice la espátula para colocar cuidadosamente el embrión en un tubo de 700A medio líquido. Para los operadores de manipuladores de base que sostienen la oreja con la mano izquierda, inserte una micro espátula en el endospermo en el pericarpo más alejado del embrión, y gire suavemente hacia arriba para desalojar el endospermo.Para cultivar los embriones en un cultivo de suspensión de Agrobacterium, recoger bacterias de una placa de trabajo recién preparada en 10 mililitros de medio líquido 700A, y vórtice para suspender el cultivo de bacterias por completo. Mida la densidad óptica a una longitud de onda de 550 nanómetros y lave los embriones con un mililitro de medio fresco de 700A. Sumerja los embriones en un mililitro de suspensión de Agrobacterium, y el vórtice en un ajuste bajo durante 30 segundos.Asentar los embriones en el banco con los tubos en orientación horizontal durante cinco minutos antes de transferir todo el contenido de cada tubo a placas individuales de medio de cultivo de 562V. Arremolina suavemente las placas para distribuir los embriones uniformemente, y aspirar el exceso de suspensión de Agrobacterium. Orienta cuidadosamente los embriones con el lado en forma de cúpula hacia arriba, teniendo cuidado de evitar dañar los embriones.A continuación, coloque las placas en cajas de plástico para una incubación durante la noche a 21 grados centígrados en la oscuridad. A la mañana siguiente, transfiera cuidadosamente los embriones infectados al medio en reposo 605T, coloque unos 30 embriones por placa, del lado del escutellum hacia arriba, para una incubación de cuatro a 10 días a 26 grados centígrados en la oscuridad. Alrededor de siete días, se puede observar el desarrollo de embriones somáticos en la superficie del escutellum cigolítico.Al final del período de descanso, coloque la caja de embriones en una incubadora de 45 grados Celsius con 70% de humedad relativa durante dos horas, seguida de una incubación de una a dos horas a 26 grados centígrados en la oscuridad. Al final de la incubación, coloque de 10 a 15 embriones inmaduros con choque térmico en placas individuales de medio de formación de brotes complementados con 05 miligramos por litro del imazapyr herbicida como agente selectivo. Retire cuidadosamente los coleóptiles según sea necesario y devuelva los embriones a la incubadora oscura Celsius de 26 grados durante dos semanas.Al final de la incubación, transfiera alrededor de ocho trozos de tejido por placa a placas medianas de enraizamiento para una incubación de una a dos semanas con 16 horas de luz y ocho horas de oscuridad a 27 grados centígrados. A medida que las plantaciones se desarrollan, coloque una planta más fuerte que contenga tanto brotes como raíces vigorosas en placas individuales de medio de enraizamiento bajo la luz durante otros siete a 14 días. Permita que los brotes que no están completamente desarrollados se incuban en el mismo medio durante otra a dos semanas hasta que estén listos para ser trasladados al suelo.A medida que la planta se vuelve más vigorosa, enjuague las raíces con agua del grifo para eliminar el agar. A continuación, trasplantar las plantas individuales en macetas de tres pulgadas que contengan un sustrato sin suelo prehumedezca en una bandeja con orificios de drenaje, y coloque la bandeja en una cámara de crecimiento con o sin una cúpula de humedad de plástico. Nueve a 14 días después de la transferencia de la olla, trasplantar cada planta con tierra en una olla de 1,5 galones.Añadir un fertilizante de liberación controlada a la olla, y mantener las plantas en el invernadero. Cuando los brotes de oído comiencen a emerger de la planta, utilice una bolsa de tiro semitransparente para cubrir los brotes de modo que las sedas emergentes se puedan observar sin quitar la bolsa. A continuación, polinizar las plantas en la etapa apropiada de desarrollo como se demostró.Las orejas de maíz generalmente se cosechan de nueve a 12 días después de la polinización. Los embriones inmaduros con longitudes que oscilan entre 1,5 y dos milímetros son los mejores explantes para la transformación de este protocolo. Ocho días después de la infección, los embriones somáticos que expresan ZsGreen pueden visualizarse mediante microscopía de fluorescencia.El tratamiento térmico ocho días después de la infección induce la expresión de la cre recombinasa, lo que resulta en la escisión del gen morfogénico, cre, y los casetes de expresión ZsGreen flanqueados entre los dos sitios loxP. Después de tres a cuatro semanas de cultivo en medio de formación de brotes que contiene herbicidas, se pueden observar tejidos proliferantes con embriones madurantes o cogollos de brote resistentes al herbicida. Algunos de los tejidos resistentes a los herbicidas pueden ser negativos para ZsGreen, lo que sugiere que la escisión mediada por cre probablemente ocurrió en estos tejidos.Después de mover los tejidos a medio de enraizamiento y la incubación ligera, se pueden cosechar brotes sanos, vigorosos y en crecimiento con raíces bien desarrolladas. Tenga en cuenta que algunos tejidos pueden parecer tener múltiples brotes posiblemente debido a plantas clonales que tienen patrones idénticos de integración transgénero. El método QuickCorn puede mejorar en gran medida la eficiencia de la transformación del maíz y ampliar la lista de genotipos transformables.El protocolo puede ser reproducido con éxito por investigadores con una formación mínima en transformación del maíz. Usando el método QuickCorn, las plantas enraadas deben estar listas para transferirse al suelo en sólo cinco a siete semanas después del día de la infección. Preste atención a la composición media, el momento de las subculturas y las condiciones de temperatura e iluminación.La calidad de los materiales de partida también es esencial para una transformación exitosa. Los productos químicos, la solución de lejía y el herbicida utilizados en este protocolo son biopeligrosos. Por favor, asegúrese de usar el equipo de protección personal apropiado durante su uso.

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Investigación

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Biology

Biología

Fuente: Beernink, B. M. et al. Agroinoculación directa de plántulas de maíz mediante inyección con clones infecciosos del virus recombinante del mosaico de la cola de zorro y del virus del mosaico de la caña de azúcar. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demuestra la administración mediada por Agrobacterium de clones virales recombinantes en plántulas de maíz para el silenciamiento génico. Describe el proceso de infección por Agrobacterium , la propagación sistémica del virus y los cambios...

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En este video, demostramos la transformación genética del genoma del arroz utilizando un vector binario de Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria facilita la transferencia de un plásmido de ADN extraño utilizando proteínas de virulencia de Agrobacterium.

Transformación genética mediada por agrobacterias: un método para transformar genéticamente el genoma del arroz a través de Agrobacterium tumefaciens modificado genéticamente

El objetivo es ilustrar que el modelo de leguminosa Medicago truncatula puede utilizarse fácilmente para investigar la regulación de la embriogénesis temprana de plantas para complementar el modelo de Arabidopsis no leguminosa. La morfología de las vainas está relacionada con las etapas de embriogénesis cigótica y también se proporciona un protocolo para recolectar embriones mediante cultivo de tejidos.

Protocolos para la obtención de embriones somáticos y cigóticos para el estudio de la regulación del desarrollo embrionario temprano en el Modelo de Leguminosas<em&gt; Medicago truncatula</em

Aquí presentamos un protocolo para analizar el crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxinas en granos de maíz expresando una proteína antifúngica.  Utilizando una cepa de expresión de GFP de a. flavus supervisamos la infección y la propagación del hongo en granos maduros en tiempo real. El ensayo es rápido, fiable y reproducible.

Inhibición del crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxina en transgénicos maíz expresando el inhibidor de la α-amilasa de Lablab purpureus L.

Este trabajo describe el uso de la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9 para eliminar el gen endógeno OsABCG15 seguido de un protocolo de transformación mediado por Agrobacteriummodificado para producir una línea estable de color masculino-estéril en el arroz.

Agrobacterium-Transformación Genética Mediada, Producción Transgénica, y su Aplicación para el Estudio del Desarrollo Reproductivo Masculino en el Arroz

Se presenta un protocolo de inyección (agroinyección) a base de Agrobacterium para la inoculación del virus del mosaico de la cola de zorro y los clones del virus del mosaico de la caña de azúcar en las plántulas de maíz. La inoculación de esta manera conduce a la infección viral, el silenciamiento génico inducido por virus de los genes marcadores y la sobreexpresión viral de GFP.

Agroinoculación directa de plántulas de maíz por inyección con clones infecciosos recombinantes del virus del mosaico de la cola de zorro y virus del mosaico de la caña de azúcar

Aquí, presentamos un protocolo de alto rendimiento para transfectar transitoriamente millones de protoplastos de maíz para probar grandes bibliotecas de plásmidos en células de mesófilo de maíz.

Transfección escalable de protoplastos de mesófilo de maíz

En este estudio, se desarrolló en bambú un novedoso método de expresión génica y edición génica en planta mediado por Agrobacterium . Este método mejoró en gran medida la eficiencia de la validación de la función génica en el bambú, lo que tiene implicaciones significativas para acelerar el proceso de mejoramiento del bambú.

En Planta Expresión génica y edición génica en hojas de bambú Moso

En este trabajo presentamos el primer protocolo de infiltración localizada al vacío para estudios in vivo de la transformación genética de plantas de gran tamaño. Utilizando esta metodología, logramos por primera vez la transformación transitoria del cacao mediada por Agrobacterium in planta .

Agroinfiltración forzada al vacío para la transformación in planta de plantas recalcitrantes: el cacao como caso de estudio

Transformación de ADN plásmido en E. coli utilizando el método de choque térmico

Aprende el método QuickCorn para transformación genética de maíz recalcitrante mediante Agrobacterium y genes morfogénicos BABY BOOM y WUSCHEL. Este protocolo elimina la etapa de inducción de callo y mejora la eficiencia en líneas endogámicas difíciles.

Agrobacterium-Transformación de embriones inmaduros mediados de líneas endogámicas de maíz recalcitrante utilizando genes morfogénicos (Video) | JoVE Journal

Agrobacterium-Transformación de embriones inmaduros mediados de líneas endogámicas de maíz recalcitrante utilizando genes morfogénicos

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