Efecto De Las Formulaciones Artificiales De Lágrima En La Actividad Metabólica De Las Células Epiteliales Corneales Humanas Después De La Exposición A La Desecación
2 de mayo de 2020
El propósito de este protocolo es evaluar si diversas formulaciones artificiales del rasgón pueden proteger las células epiteliales córneas humanas contra la desecación usando un modelo in vitro. Después de la exposición a formulaciones artificiales del rasgón y a la desecación, las células epiteliales córneas humanas se evalúan para la actividad metabólica.
El propósito de este protocolo es evaluar en un modelo in vitro si las formulaciones de lágrimas artificiales pueden proteger las células epiteliales de la córnea humana de la desecación. Este método se puede utilizar para ayudar a identificar formulaciones de ojo seco que pueden ayudar en la protección ocular de las personas con síntomas de ojo seco. Este ensayo utiliza una medida muy sensible para detectar la actividad metabólica de las células epiteliales de la córnea.
Como resultado, se pueden detectar pequeños cambios en la salud de las células corneales debido a la desecación. Las que demostrarán el procedimiento hoy serán Parisa Mirzapour, Nijani Nagaarudkumaran y Adeline Suko. Comience cultivando células epiteliales de la córnea humana inmortalizadas en frascos recubiertos de colágeno con 20 mililitros de DMEM/F12 que contengan un 10% de suero fetal bovino y un 1% de penicilina/estreptomicina a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, cambiando los medios cada dos o tres días.
Una vez que las células estén casi confluentes, retire el medio de cultivo celular y agregue de cuatro a seis mililitros de medio de disociación celular a cada matraz. Incubar las células a 37 grados centígrados hasta que se desprendan, revisándolas periódicamente bajo el microscopio. Agregue de dos a seis mililitros de DMEM/F12 con 10% de FBS a cada matraz y transfiera el contenido a un tubo de centrífuga de 50 mililitros.
Centrifugar las células a 450 a 500 veces g durante cinco minutos. A continuación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en medios precalentados. Determine la concentración de células con un hemocitómetro y calcule el volumen que contiene 100.000 células.
Agregue medios a cada pocillo de una placa de cultivo recubierta de colágeno I de 48 pocillos, junto con el volumen calculado de células, asegurándose de que el volumen final en cada pocillo sea de 0,5 mililitros. A continuación, incubar las células durante 24 horas. Para el procedimiento de control, retire los medios de cultivo de los pocillos y trate inmediatamente las células con 150 microlitros de una formulación de prueba o solución de control de medios.
A continuación, incubar las células durante 30 minutos. Retire la solución de prueba de las células y agregue 0,5 mililitros de solución de colorante metabólico al 10%. Incuba las células durante otras cuatro horas.
Después de la incubación, retire 100 microlitros de solución de tinte de cada pocillo y transfiérala a una placa de 96 pocillos. Utilice un lector de placas para medir la fluorescencia de cada pocillo, ajustando la excitación a 540 nanómetros y la emisión a 590 nanómetros. Para llevar a cabo el procedimiento de recuperación, incube las células con las soluciones de prueba o controles como se ha descrito anteriormente.
A continuación, añada 0,5 mililitros de medio DMEM/F12 a cada pocillo. Incubar las células durante 18 horas. A continuación, retire el medio y pruebe la actividad metabólica.
Para realizar el procedimiento de control, retire los medios de cultivo de las células en la placa de 48 pocillos y trátelos inmediatamente con la formulación de prueba o la solución de control de medios. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. Después de la incubación, retire las soluciones de prueba de las celdas y colóquelas en una cámara de 37 grados centígrados y 45% de humedad durante cinco minutos para que se sequen.
A continuación, agregue 0,5 mililitros de solución de colorante metabólico al 10% e incube las células durante cuatro horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de la incubación, transfiera 100 microlitros de la solución de colorante metabólico de cada pocillo a una placa de 96 pocillos y mida la fluorescencia. Para realizar el procedimiento de recuperación, repita el protocolo descrito anteriormente e incluya una incubación de 18 horas con medio DMEM/F12 después de la etapa de desecación.
A continuación, realice un análisis estadístico de los datos tal y como se describe en el manuscrito del texto. Se compararon tres formulaciones de ojo seco por su efecto sobre la viabilidad de las células epiteliales de la córnea humana. Las soluciones uno y dos tuvieron un efecto significativo sobre la actividad metabólica de las células antes de la desecación.
Las células expuestas a la solución uno mostraron una caída adicional en la actividad metabólica celular después de una recuperación de 18 horas, lo que significa que inicialmente se lesionaron y la lesión no se reparó. En comparación, la solución tres solo tuvo un efecto leve sobre la actividad metabólica de las células epiteliales. Al comparar la capacidad de estas formulaciones de ojo seco que contienen lípidos para proteger las células, se encontró que las soluciones uno y dos no protegían a las células del estrés por desecación.
La solución tres, sin embargo, ofrecía cierta protección. Al sembrar las células en placas recubiertas de colágeno, asegúrese de que la suspensión celular contenga células que se mezclen uniformemente para que cada pocillo se siembre con el mismo número de células. La solución tres demostró una mejora estadísticamente significativa en la viabilidad celular y la protección contra el estrés de desecación en comparación con los otros dos productos que contienen lípidos.
Es posible que el aceite mineral con fosfolípidos, junto con HP-guar y propilenglicol, permitan que la solución tres brinde protección de hidratación a las células de la córnea y reduzca la evaporación bajo desecación.
Descripción general
Este estudio evalúa los efectos protectores de diferentes formulaciones de lágrimas artificiales sobre células epiteliales corneales humanas sometidas a desecación en un modelo in vitro. Se evalúa la actividad metabólica de las células para determinar la eficacia de estas formulaciones en la prevención del daño celular.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Oftalmología
- Biología celular
Antecedentes
- El síndrome de ojo seco es una afección ocular común que puede provocar molestias y deterioro visual.
- Las lágrimas artificiales se utilizan para aliviar los síntomas y proteger las células corneales.
- Comprender los mecanismos de protección de estas formulaciones es fundamental para desarrollar tratamientos eficaces.
- Este estudio se centra en la actividad metabólica de las células epiteliales corneales como indicador de la salud celular.
Objetivo del estudio
- Evaluar la eficacia de diversas formulaciones de lágrimas artificiales en la protección de las células epiteliales corneales contra la desecación.
- Identificar las formulaciones que mejoren la viabilidad celular y la actividad metabólica tras la desecación.
- Proporcionar información sobre la formulación de tratamientos para el ojo seco.
Métodos Utilizados
- Las células epiteliales corneales humanas inmortalizadas se cultivaron en medio DMEM/F12.
- Las células fueron tratadas con diferentes formulaciones de lágrimas artificiales y sometidas a desecación.
- La actividad metabólica se evaluó utilizando un colorante metabólico y la medición de fluorescencia.
- Se realizó un análisis estadístico para comparar los efectos de las formulaciones sobre la viabilidad celular.
Resultados Principales
- Las formulaciones uno y dos redujeron significativamente la actividad metabólica antes de la desecación.
- La solución tres demostró una mejora estadísticamente significativa en la viabilidad celular tras la desecación.
- Solo la solución tres proporcionó protección contra el estrés por desecación.
- El aceite mineral con fosfolípidos en la solución tres podría mejorar la hidratación y reducir la evaporación.
Conclusiones
- No todas las formulaciones de lágrimas artificiales protegen eficazmente a las células epiteliales corneales contra la desecación.
- La solución tres es un candidato prometedor para mejorar la protección ocular en condiciones de ojo seco.
- Se necesita más investigación para explorar los mecanismos detrás de los efectos protectores de estas formulaciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este ensayo in vitro proporciona un método cuantitativo y reproducible para evaluar formulaciones de lágrimas artificiales según su capacidad de mantener la actividad metabólica de las células epiteliales corneales bajo estrés por desecación. Permite la reducción de riesgos en fases iniciales de candidatos para ojo seco al vincular la composición de la formulación con la protección celular funcional, apoyando decisiones de avance o descarte en el desarrollo preclínico. El enfoque se alinea con los flujos de trabajo de validación de dianas y desarrollo de ensayos en el descubrimiento de terapéuticos oculares.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas mediante la medición de efectos específicos de la formulación sobre la viabilidad celular y la protección contra la desecación.
- Valor operativo: Utiliza una lectura sensible basada en un colorante metabólico (alamarBlue) para detectar pequeños cambios en la salud de las células epiteliales corneales.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara modelos validados de células epiteliales corneales humanas para la selección de formulaciones posteriores.
- Valor operativo: Estandariza las condiciones de exposición y desecación (incubación de 30 min, 5 min a 37°C, 45% HR) para obtener resultados cuantitativos reproducibles.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Apoya la modelización de sistemas relevantes para enfermedades mediante el uso de células epiteliales corneales humanas expuestas a estrés evaporativo.
- Valor operativo: Permite decisiones de avance ajustadas al riesgo al identificar formulaciones que preservan la actividad metabólica tras la desecación.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la fase temprana del descubrimiento, contribuyendo a la identificación de compuestos activos al priorizar formulaciones que demuestran tanto el mantenimiento de la viabilidad celular como la protección frente a la desecación, antes de pasar a modelos in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis sobre formulaciones que contienen lípidos en la actividad metabólica de células epiteliales corneales bajo estrés por desecación.
- Tamizaje: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante siembra estandarizada de células, tratamiento y medición de la actividad metabólica basada en fluorescencia.
- Análisis: Genera lecturas cuantitativas de fluorescencia (excitación 540 nm, emisión 590 nm) que permiten comparaciones entre formulaciones y controles.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante el uso de un modelo celular humano relevante para la fisiopatología del ojo seco evaporativo.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el tamizaje de múltiples formulaciones de lágrimas artificiales bajo condiciones definidas de desecación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona una confianza predictiva en la eficacia de la formulación al vincular la actividad metabólica con la protección celular frente al daño inducido por desecación.
- Valor operativo: Garantiza la estandarización y reproducibilidad mediante densidades celulares definidas, tiempos de incubación y controles ambientales.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al identificar formulaciones que no protegen las células (por ejemplo, las soluciones uno y dos) frente a aquellas con protección significativa (solución tres).
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos para ojo seco basada en mejoras estadísticamente significativas en la viabilidad celular tras la desecación.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el cultivo celular de células epiteliales corneales humanas inmortalizadas y en técnicas asépticas.
- Depende de placas de cultivo recubiertas con colágeno I, hemocitómetro para el recuento celular y lector de placas con capacidad de detección de fluorescencia.
- Necesita una estandarización entre equipos de las condiciones de la cámara de desecación (37°C, 45% HR) y del tiempo de incubación con el colorante metabólico.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a otros tipos celulares de la superficie ocular o a modelos alternativos de estrés.
- Las limitaciones prácticas incluyen la preincubación de 30 minutos y la ventana de desecación de 5 minutos, que podrían no replicar completamente las condiciones crónicas de ojo seco.
