Preparación de células sintéticas productoras de proteínas mediante extractos bacterianos libres de células, liposomas y transferencia de emulsión

Las células sintéticas productoras de proteínas ofrecen una plataforma versátil para estudiar los orígenes de la vida, así como terapias sintéticas basadas en células para la administración avanzada de fármacos. Este método es simple y asequible para la expresión de ARN y proteínas y se puede aplicar para la producción de proteínas terapéuticas in situ directamente dentro del cuerpo. Los sistemas se pueden utilizar para el tratamiento de una amplia gama de enfermedades, desde enfermedades metabólicas y reemplazos de proteínas hasta cáncer y posiblemente diabetes.

Este protocolo de varios pasos tiene un punto de detención definido. Al realizarlo por primera vez, se recomienda dividir el trabajo durante varios días. El protocolo para la producción de células sintéticas comienza con la preparación del lysate S30-T7 libre de células.

A continuación, los lípidos de membrana y la solución de nutrientes celulares están preparados para simular el entorno interno y para apoyar la producción de proteínas. El último paso es la preparación de las propias células sintéticas. Preparar cultivos de arranque duplicados en matraces Erlenmeyer de 100 mililitros.

A cada matraz, añadir cinco mililitros de medios LB complementados con 50 microgramos por mililitro de ampicilina e inocular con una sola colonia de E.coli. Cultivar el cultivo durante la noche en una coctelera de incubadora de suelo a 250 rpm y 37 grados centígrados. A continuación, prepare dos frascos Erlenmeyer desconcertados de litro que contengan 500 mililitros de medios de tuberculosis complementados con 50 microgramos por mililitro de ampicilina.

Inocular cada matraz de dos litros con un cultivo de arranque de cinco mililitros. Coloque los matraces en una coctelera a 250 rpm y 37 grados centígrados. Supervise los cultivos periódicamente utilizando un espectrofotómetro y haga crecer los cultivos hasta OD600 entre 0,8 y uno.

Para inducir la expresión de ARN polimerasa T7, añadir a cada matraz tres mililitros de 100 IPTG mililolar para alcanzar 0,6 milímetros. Continúe creciendo las culturas hasta que OD600 sea aproximadamente cuatro. Después de que los cultivos alcancen la densidad óptica deseada, transfiera la suspensión de cada matraz Erlenmeyer a dos tubos de centrífuga esterilizados de 250 mililitros.

Centrifugar los tubos a 7.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante. Resuspender cada pellet en 250 mililitros de tampón de colorante frío S30 usando un agitador si lo desea.

Centrifugar a 7.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resusppend todos los pellets juntos en 15 mililitros de tampón frío de izado S30. Filtrar la suspensión con almohadillas de gasa.

Antes de continuar con el siguiente paso, preenfrátelas las puntas en viales de 1,5 mililitros que serán necesarios para almacenar el izado. Homogeneizar la suspensión dos veces. Utilice una presión de trabajo de 15.000 PSI con una presión de aire de cuatro bar para la rotura celular.

Recoger el homogeneizar. Añadir 100 microlitros de 0,1 molar TDT por cada 10 mililitros de la suspensión homogeneizada. Centrifugar la suspensión a 24.700 veces g a 30 minutos a cuatro grados centígrados.

La TDT y el cloroformo se clasifican como irritantes y dañinos y, por lo tanto, deben tratarse con cuidado. El cloroformo utilizado más adelante en el protocolo debe utilizarse en un área con extracción de humos. Para conservar la actividad de eseato, realice el paso rápidamente.

Coloque 200 microlitros alícuotas de sobrenadante en viales preenfriados y enciérelos inmediatamente con nitrógeno líquido. Almacene los viales en 80 grados Celsius negativos para su uso futuro. Disolver por separado POPC y colesterol en cloroformo cada uno a una concentración final de 100 miligramos por mililitro.

Vórtice cada vial por separado. Combine los componentes en un vial de vidrio de dos mililitros. Añadir 50 microlitros de la solución colesterol-cloroformo, 50 microlitros de la solución POPC-cloroformo y 500 microlitros de aceite mineral.

Vórtice el vial, luego para evaporar el cloroformo, calentarlo durante aproximadamente una hora a 80 grados Celsius en una capucha química. Antes de comenzar la etapa de producción de células sintéticas, prepare las soluciones externas, pre-internas y de alimentación como se describe en el manuscrito. A continuación, coloque 1,2 mililitros de la solución exterior en un tubo de 15 mililitros y agregue lentamente una capa de 500 microlitros de solución de lípidos en aceite desde el primer vial de vidrio.

Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Para finalizar la preparación de la solución interna, mezcle sobre hielo a un volumen final de 100 microlitros añadiendo el lesado S30-T7 y el plásmido de ADN. Añadir 100 microlitros de la solución interna con izado y plásmido al segundo vial de vidrio de dos mililitros con 500 microlitros de solución de lípidos en aceite.

Pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente durante un minuto y luego vórtice durante otro minuto en el nivel cinco. Después de incubar la emulsión resultante durante 10 minutos sobre hielo triturado, agregue lentamente la emulsión en la parte superior de la fase de aceite en el tubo de 15 mililitros. Centrifugar el tubo durante 10 minutos a 100 veces g y cuatro grados centígrados.

Luego centrifugar durante 10 minutos a 400 veces g y cuatro grados Celsius. Al final de la centrifugación, un pellet debe ser observable en la parte inferior del tubo. Para extraer el pellet, primero retire el exceso de capa de aceite.

A continuación, cargue una punta de pipeta recortada con aproximadamente 400 microlitros de solución exterior y utilice la punta de la pipeta para recoger el pellet, liberando la solución externa a medida que la punta de la pipeta pasa a través de la fase de aceite. Limpie la punta de la pipeta y transfiera el pellet a un tubo limpio de 1,5 mililitros. Centrifugar el pellet durante 10 minutos a 1.000 g y cuatro grados centígrados.

Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en 100 microlitros de solución de alimentación. Para la expresión de proteínas, incubar la suspensión durante dos horas a 37 grados centígrados sin agitar. Los plásmidos que expresaban el modelo de proteína sfGFP y Renilla luciferase se introdujeron en la síntesis de proteínas libres de células, reacciones a granel CFPS y células sintéticas.

La producción de proteínas se evaluó utilizando varios métodos. El análisis de manchas occidentales detectó la producción de sfGFP His6 tanto en reacciones a granel CFPS como dentro de células sintéticas. SGFP His6 purificado fue utilizado como un control positivo.

Un microscopio fluorescente con un Brightfield y un filtro GFP muestran células sintéticas que están produciendo sfGFP. La citometría de flujo se utilizó para analizar la producción de células sintéticas de sfGFP. El cálculo de la población de células sintéticas activas se basó en el umbral de intensidad de fluorescencia sfGFP definido por la muestra de ADN negativa representada por el histograma rojo.

La intensidad media de fluorescencia de sfGFP que produce células sintéticas se calculó a partir de la población activa de células sintéticas y se normalizó a la muestra de ADN negativa. Las distribuciones de diámetro de las células sintéticas activas se calcularon sobre la base de la señal sfGFP. La actividad de la renilla luciferasa se cuantificó con mediciones de luminiscencia.

Este método es altamente versátil y se puede optimizar para diferentes proteínas diana mediante la alteración del origen del izado, la composición de lípidos y las concentraciones de solución interna. El análisis FACS de células sintéticas que producen una proteína marcadora fluorescente podría realizarse para proporcionar un valor cuantitativo de la fracción de células sintéticas activas. El análisis de manchas occidentales mediría la producción de proteínas.