Panel LC-MS/MS validado para cuantificar 11 medicamentos resistentes a la tuberculosis en muestras de pelo pequeño

La adherencia del paciente es muy difícil y el metabolismo de los fármacos puede variar de persona a persona, por lo que la medición objetiva de los niveles de los medicamentos puede resultar importante para prevenir la aparición de resistencia durante el tratamiento de la tuberculosis. Si la adherencia pudiera cuantificarse con mayor precisión y facilidad, entonces los proveedores de atención médica podrían desarrollar un plan de tratamiento que limitara el desarrollo de resistencia a los medicamentos. Hemos desarrollado el primer panel de espectrometría de masas de analito múltiple para múltiples medicamentos para la tuberculosis dentro de muestras de cabello pequeño en un solo ensayo.

Nuestro panel multi-fármaco solo requiere una muestra de dos miligramos por paciente y no utiliza ni extracción de fase sólida ni paso de filtrado para evitar cualquier pérdida de volumen de muestra. Las medidas objetivas de exposición a medicamentos medidas al principio del curso de tratamiento podrían alertar potencialmente a los médicos sobre los problemas con los medicamentos individuales en el régimen de tratamiento. Las muestras de cabello deben pulverizarse el día del análisis para una medición precisa del nivel de concentración de fármacos.

Para adquirir muestras de cabello, después de obtener el consentimiento informado por escrito, prepare materiales que incluyan una etiqueta delgada, dos etiquetas de participante, un par de tijeras, una pieza desplegada de papel de aluminio, una toallita de alcohol y una bolsa de plástico. Limpie las cuchillas de las tijeras con una toallita con alcohol. Ve a la parte posterior de la cabeza y levanta la parte superior del cabello usando un clip para el cabello si lo deseas.

Reúne 30 hebras de pelo de la parte posterior de la cabeza y aísla la paja con la mano. Lleva las tijeras hasta el cuero cabelludo y corta la paja del cabello. Coloque cuidadosamente la paja del cabello en la lámina de aluminio.

Coloque la etiqueta delgada sobre el extremo distal de la paja del cabello, pegándola firmemente a la lámina de aluminio. El extremo distal es el lado más alejado del cuero cabelludo. Doblar sobre la pieza de papel de aluminio en la parte superior de la paja del cabello y poner una etiqueta de participante en la parte superior de la lámina de aluminio.

Coloque la pieza doblada sobre papel de aluminio en la bolsa de plástico y coloque otra etiqueta participante en la parte superior de la bolsa de plástico. Para la extracción de fármacos de las muestras de cabello, pesar dos miligramos de cada muestra de cabello en tubos de cuenta etiquetados individualmente y dos miligramos de la muestra de cabello en blanco en cada uno de 16 tubos de cuentas adicionales. Después del pesaje, coloque todos los tubos de perlas en un homogeneizador de molino de cuentas y homogeneice las muestras a una velocidad de 6,95 metros por segundo durante dos ciclos de 30 segundos con un período de reposo de 15 segundos entre cada ciclo.

Después de la segunda homogeneización, añadir 500 microlitros de la mezcla estándar interna apropiada a cada muestra y añadir 500 microlitros de metanol al tubo en blanco de la matriz. Espiba los tubos de curva de calibración con el volumen adecuado de mezcla estándar de referencia según la mesa y coloque todos los tubos en un baño de agua de 37 grados con agitación suave durante dos horas. Al final de la incubación, transfiera el sobrenadante de cada tubo de perla a nuevos tubos de microcentrífuga etiquetados y agregue 500 microlitros de metanol a los tubos de perlas.

Vórtice los tubos de cuenta y transfiera el lavado de metanol a los tubos de microcentrífuga correspondientes. Centrifugar las muestras y transferir cuidadosamente los sobrenadantes a nuevos tubos sin molestar los pellets capilares. Evaporar el líquido en los tubos a sequedad a 32 grados Celsius y reconstituir las muestras con 200 microlitros de cromatografía líquida de alta presión grado agua con 1%ácido fórmico.

Después del vórtice, transfiera las muestras líquidas a viales de ámbar con 250 inserciones de microlitros. Para la espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida, instale primero una columna de dos a 100 milímetros con un tamaño de partícula de 2,5 micrómetros y un tamaño de poro de angstrom de 100 con perlas de fenol etherlinked polar-endcaped completamente hechas de sílice porosa en el compartimiento de la columna. Confirme que la columna también tiene instalado un cartucho de protección recomendado por el fabricante.

Copie y pegue la información compuesta incluida en las transiciones del método MDR-TB LCMS. csv en el cuadro de la ventana de especificación de masa. En una hoja de cálculo, cree una secuencia por lotes de la curva de calibración, controles de calidad, muestras de pacientes, curva de calibración, controles de calidad, muestras de pacientes, curva de calibración y controles de calidad.

Añada inyecciones en blanco solventes al inicio y al final de la carrera, así como antes y después de la curva de calibración, los controles de calidad y las muestras del paciente. A continuación, coloque al menos ocho inyecciones en blanco de disolvente en las inyecciones en la curva de calibración y el vial de control de alta calidad para reducir el arrastre del analito. Cuando se completen los lotes, abra el software de cuantificación.

Desplácese por las transiciones para asegurarse de que el tiempo de retención seleccionado automáticamente es preciso y compruebe que el suavizado gaussiano está establecido en 1.5. A continuación, haga clic en muestra la curva de calibración y la regresión y establezca el tipo de espera en uno sobre x. Haga clic en Aceptar y valide la curva de calibración y las muestras de control de calidad para asegurarse de que el lote se ejecutó correctamente.

Para cada analito de referencia del cuantificador, al menos dos tercios de los puntos de calibración deben tener una precisión dentro del 80-120%Compruebe que el valor R mostrado por encima de la curva de calibración es mayor que 0,975. Si se cumplen todas las condiciones anteriores, el lote ha pasado y las muestras se pueden cuantificar. Haga clic en Editar en la barra de herramientas y haga clic en Copiar toda la tabla.

A continuación, pegue la tabla en una hoja de cálculo y utilice el promedio de la concentración calculada de las dos inyecciones de muestra para determinar la concentración notificada de cada muestra. Aquí se muestra una ilustración de un cromatograma con niveles confirmados de todos los 11 medicamentos farmacorresistentes probados. En estas cifras, se pueden observar los cromatogramas iónicos extraídos para un medicamento en particular en uno de los calibradores.

Las transiciones del cuantificador y del calificador se utilizan para confirmar cualitativamente la presencia del medicamento, ya que la relación entre el área del cuantificador y el área del calificador sigue siendo la constante entre las muestras. El estándar interno también se supervisa para garantizar que cada inyección de muestra se normaliza. En este análisis, se evaluó una muestra conveniente de 15 muestras de cabello entre una población total de 96 pacientes que toman medicamentos resistentes a los medicamentos en condiciones de tratamiento con tuberculosis en el Cabo Occidental de Sudáfrica para determinar los niveles representativos de medicamentos resistentes a la tuberculosis en los niveles más bajos y más altos de cada analito.

En ausencia de una fase sólida de extracción o paso de filtrado, tenga cuidado al transferir el sobrenadante a los tubos de evaporación. Cualquier cosa transferida a los tubos puede terminar inyectada en la columna. Como el rotor del raptor de cuentas puede volar si no está bien atornillado o bloqueado, asegúrese de comprobar dos veces el rotor antes de operar.

A diferencia de los antirretrovirales en el campo del VIH, la relación entre la farmacocinética de medicamentos para la tuberculosis, la adherencia y los resultados clínicos sigue siendo en gran medida no estudiada. Hemos hipotetizado que algunos medicamentos para la tuberculosis no se acumulan bien en el cabello. Dirigirse a los metabolitos de estos medicamentos puede proporcionar una mejor comprensión de la adherencia del paciente.