Un modelo de ratón de sarcoma de tejido blando insegurado incompletamente para terapias adyuvante de pruebas (Neo)
July 28th, 2020
En este protocolo, describimos un modelo de ratón de resección quirúrgica incompleta de sarcoma de tejido blando para la prueba (neo)terapias adyuvantees.
Este protocolo tiene como objetivo imitar el entorno clínico de la enfermedad residual después de la cirugía de desbulado tumoral, y por lo tanto nos permite probar nuevas terapias oncológicas en el contexto de la cicatrización postoperatoria de heridas. La ventaja de esta técnica es que permite estandarizar la cantidad de herida infligida y la cantidad de tumor que queda. Esta técnica es particularmente importante para los estudios preclínicos en la identificación de nuevos tratamientos para el cáncer, que recidivte localmente un ejemplo de lo cual es el sarcoma de tejidos blandos.
Esta demostración visual es fundamental para demostrar la técnica de inversión, que nos permite exponer el tumor unido al lado de la piel. Comience este procedimiento con la inoculación subcutánea de células cancerosas preparadas en ratones, como se describe en el protocolo de texto. En el día 12, después de la inoculación, cuando los tumores han alcanzado un tamaño de aproximadamente 50 milímetros cuadrados, ratones con 100 microlitros de buprenorfina por vía subcutánea en el escrúpulo del cuello, 30 minutos antes de la cirugía.
Configure el área quirúrgica con la almohadilla de calor cubierta con una capa de banco y configure un cono nasal para la anestesia. Organice equipos quirúrgicos limpios para que estén al alcance de la mano, incluyendo clorhexadina, hisopo, gasa, gel para los ojos, dos fórceps curvos, tijeras, aplicador de clip, removedor de clip y recargas de clip. Caliente la cámara de calentamiento a 37 grados centígrados y configure otra almohadilla de calor para la recuperación.
Tenga en cuenta que este procedimiento requiere dos personas. Un asistente debe vigilar de cerca la respiración del ratón durante el procedimiento. Después de anestesiar el ratón como se describe en el protocolo de texto, realice una prueba de pellizcar y una prueba de reflejo corneal para asegurarse de que el ratón está completamente anestesiado antes de comenzar la cirugía.
Cubra los ojos del ratón con una pequeña cantidad de gel oftálmico para evitar la sequedad ocular. Comience esta cirugía frotando el área quirúrgica con clorhexadina. Usando fórceps y un par de tijeras hacen una incisión recta de un centímetro a lo largo del lado dorsal, a tres milímetros del tumor.
No corte la piel que cubre directamente el tumor, ya que no sanará bien. Evite usar un bisturí para cortar el tumor y use pinzas para recoger las piezas. Con pinzas, retira la fascia y el tejido graso subcutáneo entre el tumor y el peritoneo.
El tumor subcutáneo normalmente se une al lado de la piel. Abra la herida sosteniendo suavemente la piel en el lado del rodamiento del tumor usando pinzas e invierta el tumor para que sea visible en el exterior. Usando un par de tijeras, corta la cápsula tumoral de la mitad para extraerla, comenzando desde la base del tumor más cercana a la abertura.
Para la cirugía del 50%debulk, corte a través de la mitad del tumor. El uso de fórceps curvos recoge la sección del tumor que se va a extirpar. Recoja los restos del área de debulk.
Para el 75%debulk, comienza por realizar un 50% de debulk tumor y luego corta a la mitad el 50% restante del tumor. Recoge el 25% del tumor usando fórceps curvos. Para cerrar el sitio quirúrgico, coloque el tumor restante debajo de la piel y usando fórceps, tire de los colgajos de la piel y alinee la piel a lo largo de la herida.
Sujete la piel a cinco milímetros del borde de la herida y utilice clips quirúrgicos para cerrar la herida comenzando en el lado, más cerca de los fórceps. Aplique tantos clips como sea necesario para asegurarse de que no se exponga ningún tejido subyacente. Generalmente, se aplican de tres a cuatro clips con espacios de dos milímetros entre clips.
Permita que los ratones se recuperen poniéndolos en la cámara de calentamiento caliente. Coloque la jaula del ratón en la almohadilla de calor. Monitoree a los ratones en la cámara de calentamiento hasta que se hayan recuperado del anestésico.
Luego, vuelva a colocar los ratones en la jaula, deje la jaula en la almohadilla de calor durante otros 10 minutos hasta que los ratones se hayan vuelto más activos. Dale a los ratones alimentos húmedos y suaves. Monitoree a los ratones una hora después de la cirugía para la recuperación.
Supervise los ratones de nuevo al final del día y a la mañana siguiente y asegúrese de que los clips permanezcan en su lugar. Tratar los ratones perioperatorios con terapia de advenimiento o neoadyuvante en un momento dado, dependiendo del tratamiento de interés. Por ejemplo, tratar ratones con una dosis de 100 microgramos de anti-CTLA-4 intraperitonealmente el día 15 después de la inoculación.
Alternativamente, tratar a los ratones con tres dosis de 200 microgramos de anti-PD-1 intraperitonealmente en días, 15, 17 y 19 después de la inoculación. La resección quirúrgica incompleta de 50 tumores de milímetros cuadrados, indicada aquí por la línea punteada da como resultado un recrecimiento 100% reproducible de los tumores en ausencia de inmunoterapia adyuvante. Por lo tanto, el crecimiento del tumor a un tamaño de 50 milímetros cuadrados es un tamaño ideal para el debulk parcial.
El modelo se utilizó entonces para probar inmunoterapias adyuvante utilizando anticuerpos contra módulos de punto de control, proteína asociada al linfocitos T citotóxicos cuatro y receptor de muerte programado uno. El tratamiento de ratones con anti-CTLA-4, dio lugar a una tasa de curación del 80%Mientras que el tratamiento de ratones con anti-PD-1 dio lugar a una tasa de curación del 25%La respuesta con anti-PD-1 ofrece la oportunidad de probar nuevas combinaciones, para mejorar aún más la tasa de respuesta. Es importante que el tumor restante permanezca unido a la piel, de lo contrario se cortará el suministro de sangre y el tumor se convertirá en el necrótico.
Después de este procedimiento, los tumores pueden ser analizados por una variedad de métodos, como la citometría de flujo con el fin de evaluar cómo la cirugía afecta a las células infiltrantes tumorales. Este modelo de ratón nos ha permitido explorar cómo la cicatrización de heridas afecta a las inmunoterapias contra el cáncer.
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Visión general
Este protocolo describe un modelo en ratones de resección quirúrgica incompleta de sarcoma de tejidos blandos, permitiendo la prueba de terapias (neo)adyuvantes. Simula el entorno clínico de enfermedad residual después de la cirugía de desbridamiento tumoral.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Oncología
- Investigación preclínica
- Técnicas quirúrgicas
Antecedentes
- El sarcoma de tejidos blandos a menudo recae localmente después de la cirugía.
- El modelo estandariza la cantidad de herida y tumor residual.
- Es crucial para identificar nuevos tratamientos contra el cáncer.
- Demostrar la técnica de inversión para la exposición del tumor.
Propósito del estudio
- Para probar nuevas terapias contra el cáncer en un entorno postoperatorio controlado.
- Para evaluar los efectos de las terapias en la enfermedad residual.
- Para mejorar la comprensión de la curación de heridas en el contexto del cáncer.
Métodos utilizados
- Inoculación subcutánea de células cancerosas en ratones.
- Monitoreo del crecimiento del tumor hasta alcanzar un tamaño específico.
- Administración de buprenorfina antes de la cirugía.
- Aplicación de técnicas quirúrgicas para modelar la resección incompleta.
Principales resultados
- El modelo estandarizado permite resultados reproducibles.
- Facilita la prueba de terapias (neo)adyuvantes.
- Demuestra el impacto de las técnicas quirúrgicas en el comportamiento del tumor.
- Proporciona información sobre los procesos de curación postoperatoria.
Conclusiones
- El modelo es efectivo para estudios preclínicos de sarcoma de tejidos blandos.
- Mejora la comprensión de la recurrencia tumoral local.
- Apoya el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This model addresses a critical gap in preclinical oncology by simulating residual disease after incomplete tumor resection, enabling evaluation of (neo)adjuvant therapies in the context of postoperative wound healing. It supports target validation and mechanistic de-risking by capturing the biological complexity of surgery-induced microenvironmental changes that influence therapeutic response. The reproducible tumor regrowth in untreated controls provides a robust benchmark for assessing therapeutic efficacy, directly informing go/no-go decisions in early discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a disease-relevant system that includes residual tumor and surgical wound response.
- Operational Value: Standardizes tumor burden and wound variables to reduce experimental noise and improve reproducibility across studies.
- Predictive Value: Supports preclinical model selection by demonstrating differential response to immunomodulators like anti-CTLA-4 and anti-PD-1, aiding in lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative tumor regrowth metrics that serve as a dependent variable for assessing (neo)adjuvant therapy impact.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through defined resection percentages (50% or 75%) and measurable endpoints like tumor size at 50 mm².
- Scalability: Enables consistent compound evaluation across laboratories by modeling gross residual disease in a controlled surgical context.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models the clinical scenario of gross residual disease, allowing assessment of how wound healing modulates antitumor immunity and therapy efficacy.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by incorporating a key clinical variable—surgical resection—into therapeutic testing.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Provides data to prioritize therapies that overcome surgery-induced immunosuppression or promote immune reactivation in residual disease settings.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for immunomodulatory agents where postoperative microenvironment affects outcomes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how surgical stress alters tumor-immune interactions and therapeutic susceptibility.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tumor growth readouts essential for comparing compound effects in residual disease models.
- Analytics: Enables statistical analysis of tumor regrowth inhibition, providing measurable outputs for dose-response and combination therapy evaluation.
- Translational Research: Connects to biomarker studies by allowing flow cytometric analysis of tumor-infiltrating lymphocytes in the context of wound healing.
- Enterprise Reuse: Represents a adaptable platform for solid tumor types beyond soft tissue sarcoma, supporting cross-indication preclinical validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by modeling a clinically relevant resistance mechanism—surgical wound healing—that contributes to local relapse.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized surgical technique and defined residual tumor thresholds.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying ineffective (neo)adjuvant candidates early, reducing late-stage failure risk due to unmodeled surgical biology.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of therapies demonstrating efficacy in residual disease, aligning with clinical trial design for adjuvant settings.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical techniques, anesthesia monitoring, and aseptic procedure to ensure model consistency and animal welfare.
- Dependent on instrumentation including heating chambers, surgical clips, and precision tools for controlled tumor debulking and wound closure.
- Necessitates cross-team standardization between biology and surgical teams to maintain resection fidelity across experimental groups.
- Adaptation considerations include tumor model selection, inoculation site, and postoperative monitoring timelines to align with therapeutic mechanisms of interest.
- Practical limitations include the need for postoperative care and monitoring to ensure wound integrity and exclude confounding variables like infection or necrosis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Set-up for Partial Surgical Resection of the Tumor
2:23
Partial Surgical Resection of the Tumor
4:20
Recovery of Mice and Adjuvant or Neoadjuvant Treatment
5:35
Results: Tumor Regrowth Following Incomplete Tumor Resection and Immunotherapy
6:35
Conclusion
