Name: Un modelo de ratón de sarcoma de tejido blando insegurado incompletamente para terapias adyuvante de pruebas (Neo) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Aprende a crear un modelo de ratón de resección quirúrgica incompleta de sarcoma de tejido blando para probar terapias (neo)adyuvantes. Este método estandariza la herida y el tumor residual en estudios preclínicos.

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¡Este trabajo está respaldado por subvenciones del Calcetín al Sarcoma! Fundación, la Asociación de Sarcoma de Australia y Nueva Zelanda, la Fundación para la Investigación de la Leucemia y el Cáncer Infantil y la Filantropía Perpetua. W.J.L cuenta con el apoyo de una beca Simon Lee y una beca de investigación del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica, y el Consejo del Cáncer WA.

Los animales utilizados en estos experimentos se obtuvieron del Centro de Recursos Animales (Perth, Australia Occidental). Los animales fueron mantenidos bajo condiciones estándar libres de patógenos en el Harry Perkins Institute of Medical Research Bioresources North Facility (Perth, Western Australia). Todos los experimentos se llevaron a cabo siguiendo el protocolo aprobado por el Comité de ética animal del Instituto Harry Perkins de Investigación Médica. En estos experimentos se utilizaron ratones BALB/c de 8-12 semanas de edad. La línea celular de fibrosarcoma WEHI 164 se obtuvo de CellBank Australia (Westmead, NSW).
1. Inoculación de células
<ol><li>Preparación de células y animales<ol>
<li>Asegúrese de que la línea celular se mantiene en el medio recomendado. Por ejemplo, mantenga la línea celular WEHI 164 en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio complementado con 2 mM de L-glutamina, 10% suero bovino fetal, 20 mM HEPES, 0.05 mM 2-mercaptoetanol, 100 U/mL penicilina, y 100 g/mL estreptocincito. NOTA: Las células de paso al menos 3 y hasta 5 veces después de ser retiradas del almacenamiento criogénico. Para garantizar una viabilidad celular óptima, las células deben dividirse cuando están entre 70-80% confluentes. Las líneas celulares tumorales deben analizarse para detectar micoplasma, ya que la infección puede alterar el crecimiento celular e influir en la respuesta inmunitaria in vivo.</li>
		<li>Un día antes de la inoculación, afeite los ratones en el flanco inferior derecho usando pinzas. NOTA: En este experimento se utilizaron ratones BALB/c hembras, de entre 8-12 semanas de peso normal (16 -22 gramos).</li>
		<li>El día de la inoculación, cosecha WEHI 164 células cuando 70-80% confluen por tripsinización.<ol>
<li>Aspirar el medio de cultivo de los matraces de cultivo tisular y luego añadir solución tampón de fosfato estéril (1x PBS), para eliminar los restos de suero bovino fetal (FBS).</li>
			<li>Aspirar el PBS de los matraces de cultivo de tejido. Añadir 3 ml de 0,05% de trippsina (para un matraz T75) y luego girar el matraz de modo que toda la superficie del matraz con células esté cubierta por trippsina.</li>
			<li>Incubar el matraz a 37oC, 5% copiloto de CO2 durante 3 min. Compruebe periódicamente las células, tocando en los lados del matraz para ver si las células se han desalojado.</li>
			<li>Retire los matraces de la incubadora de cultivo celular y añada 5 ml de medios complementados con FBS para neutralizar la tripina. NOTA: No deje las células en tripina más tiempo del necesario, ya que esto puede dañar las células y conducir a una baja viabilidad celular.</li>
			<li>Suspensión de pipeta varias veces para obtener una suspensión de una sola célula. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga cónica.</li>
			<li>Células de pellets girando a 350 x g durante 3 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lave las células tres veces en 1x PBS.<ol>
<li>Resuspendir las células en 50 ml de estéril 1x PBS y lavar las células por la suspensión celular de pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Células de pellets girando a 350 x g durante 3 min.</li>
			<li>Aspirar las células sobrenadantes y resuspendidas en 15 ml de 1 PBS estéril. Lave las células pipeteando la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo. Células de pellets girando a 350 x g durante 3 min.</li>
			<li>Aspirar las células sobrenadantes y resuspendidas en exactamente 10 ml de 1 PBS estéril. Lave las células como en el paso 1.1.4.2 y transfiera una pequeña cantidad (aproximadamente 100 l) de suspensión celular a un tubo centrífugo para el recuento. Células de pellets girando a 350 x g durante 3 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Determine el número de celda mediante el método de exclusión azul de Trypan mediante un hemocitoómetro o un contador de celdas automatizado. Células resuspendidas en 1 PBS estéril a una concentración de 5 x 106 células/ml. Mantenga la suspensión celular sobre hielo. NOTA: La viabilidad de las células tumorales debe ser igual o superior al 80 % para garantizar un crecimiento tumoral reproducible.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculación subcutánea<ol>
<li>Mezcle bien la suspensión celular y llene una jeringa con una aguja de 26 G con 100 ml de suspensión celular (5 x 105 células) en PBS estéril 1x. Repita la mezcla de células antes de cargar la siguiente jeringa. NOTA: Mantenga las células sobre hielo durante todo el procedimiento para mantener la viabilidad.</li>
		<li>Sujete el ratón adecuadamente, asegurando el acceso al flanco inferior derecho. Inocular el ratón por vía subcutánea en el flanco inferior derecho afeitado. NOTA: Asegúrese de que la inoculación no esté en el peritoneo levantando ligeramente la aguja, que debe ser visible debajo de la piel. Se debe formar un bulto similar a una burbuja debajo de la piel después de la inoculación.</li>
		<li>Monitorear ratones según lo requiera la aprobación ética aplicable y realizar resección quirúrgica cuando los tumores hayan crecido a un tamaño de aproximadamente 50 mm2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Resección quirúrgica parcial del tumor
NOTA: Este protocolo requiere DOS investigadores; uno para procedimientos quirúrgicos (SURGEON) y otro para el monitoreo del ratón (ASSISTANT).
<ol><li>Configuración de la cirugía<ol>
<li>En el día 12 después de la inoculación, cuando los tumores han alcanzado un tamaño de aproximadamente 50 mm2, ratones de dosis con 100 l (0,1 mg/kg) de buprenorfina s.c. en el escrúpulo del cuello, 30 minutos antes de la cirugía.</li>
		<li>Configure el área quirúrgica con una almohadilla de calor cubierta con una capa de banco y configure un cono nasal para la anestesia. Esterilice las herramientas quirúrgicas antes de su uso, y entre cada animal usando un esterilizador de cuentas de calor, permitiendo que las herramientas se enfríen antes de su uso. Tener el siguiente equipo quirúrgico limpio y al alcance de la mano: clorhexidina, hisopo, gasa, gel para los ojos, dos fórceps curvos, tijeras, aplicador de clip, removedor de clip, recargas de clip(Figura 2A, 2B).</li>
		<li>Caliente la cámara de calentamiento a 37 oC y configure otra almohadilla de calor para la recuperación(Figura 2C). Coloque herramientas esterilizadas en una superficie estéril como almohadillas autoclaves.</li>
	</ol></li>
	<li>Anestesia<ol>
<li>Coloque el ratón en la cámara de inducción y anfise el ratón con 4% de isoflurano (4% en oxígeno al 100% a un caudal de 1 L/min) hasta que la frecuencia respiratoria se desacelere a aproximadamente 60 respiraciones por minuto (1 por segundo) (esto suele tardar <1 min). NOTA: No deje el ratón en la cámara durante demasiado tiempo, ya que eso puede conducir a asfixia y muerte. Sólo tiene un ratón bajo anestesia a la vez.</li>
		<li>Transfiera el ratón a la almohadilla de calor en la mesa de cirugía, coloque el ratón con su nariz en el cono nasal y mantenga el estado anestésico con 3-4% de isoflurano en oxígeno 100% a un caudal de 0,5 L/min. Monitoree la frecuencia respiratoria para asegurarse de que se mantiene la profundidad de la anestesia. NOTA: El ASISTENTE debe controlar la respiración del ratón durante toda la cirugía para asegurarse de que se mantiene el nivel correcto de anestesia. Reduzca la concentración anestésica si la respiración se vuelve demasiado lenta o aumente la concentración si la profundidad de la anestesia es demasiado superficial. Si el ratón comienza a jadear, retire el ratón del cono nasal, disminuya la concentración anestésica y espere hasta que la respiración se normalice antes de volver a colocar el cono nasal.</li>
		<li>Realice una "prueba de pellizco" y una "prueba de reflejo corneal"14 para asegurarse de que el ratón esté completamente anestesiado antes de comenzar la cirugía. NOTA: El movimiento de cualquier parte del ratón es una indicación de que el ratón no está completamente anestesiado. El animal debe recibir inmediatamente anestesia adicional aumentando la concentración anestésica.</li>
		<li>Cubra los ojos del ratón con una pequeña cantidad de gel oftálmico para evitar la sequedad ocular.</li>
	</ol></li>
	<li>Procedimiento quirúrgico (SURGEON)<ol>
<li>Frotar el área quirúrgica 3 veces con clorhexidina alcohólica. Usando fórceps y un par de tijeras, haga una incisión recta de 1 cm a lo largo del lado dorsal, a 3 mm del tumor(Figura 3A, 3B). NOTA: Estandarizar la incisión a 1 cm en cada ratón (usando una regla) permite una evaluación uniforme de la cicatrización de heridas entre ratones. La localización de la incisión a 3 mm del tumor permite la posterior terapia adyuvante intratumoral sin fugas de la herida.</li>
		<li>Con pinzas, retira la facia y el tejido graso subcutáneo entre el tumor y el peritoneo. El tumor subcutáneo normalmente se une al lado de la piel.</li>
		<li>Abra la herida sosteniendo suavemente la piel en el lado del rodamiento del tumor usando pinzas, e "invierta" el tumor de modo que sea visible en el exterior(Figura 3C, 3D). NOTA: La sección del tumor a desbultar debe estar más cerca de la abertura, para tener suficiente piel para cerrar la herida. Tenga cuidado de no cortar la piel al extirpar el tumor.</li>
		<li>Usando un par de tijeras, corta la cápsula tumoral de la mitad para extraerla, comenzando desde la base del tumor más cercana a la abertura.</li>
		<li>Para una cirugía de desbultado del 50%, corte a través de la mitad del tumor. Usando fórceps curvos, recoge la sección del tumor que se va a extirpar (50%); recoge los restos de la zona desbulada.</li>
		<li>Para el 75% de debulk, realizar un 50% de debulk tumor como en la parte 2.3.5 anterior. Luego corta la mitad del 50% restante del tumor y recoge el 25% del tumor, usando fórceps curvos como se describió anteriormente.</li>
	</ol></li>
	<li>Cierre del sitio quirúrgico<ol>
<li>Coloque el tumor restante debajo de la piel, y usando fórceps, tire de los colgajos de la piel juntos y alinee la piel a lo largo de la herida.</li>
		<li>Sujete la piel unida a 5 mm del borde de la herida y utilice clips quirúrgicos para cerrar la herida, comenzando en el lado más cercano a los fórceps. Aplique tantos clips como sea necesario para asegurarse de que no se exponga ningún tejido subyacente. Generalmente, se aplican de tres a cuatro clips con separaciones de 2 mm entre clips. NOTA: Si algún clip no está bien aplicado, elimínelo con un removedor de clip y sustitúyalo por clips nuevos.</li>
	</ol></li>
	<li>Recuperación de ratones (ASSISTANT)<ol>
<li>Permita que los ratones se recuperen poniéndolos en la cámara de calentamiento caliente (37 oC).</li>
		<li>Coloque la jaula del ratón en la almohadilla de calor. Monitoree a los ratones en la cámara de calentamiento hasta que se hayan recuperado del anestésico (despierto y caminando) y luego vuelva a colocar a los ratones en la jaula. Deje la jaula en la almohadilla de calor durante otros 10 minutos, hasta que los ratones se hayan vuelto más activos.</li>
		<li>Dale a los ratones alimentos húmedos y suaves. Supervise a los ratones 1 hora después de la cirugía para la recuperación y asegúrese de que los clips permanezcan en su lugar. Asegúrese de que la jaula esté a la mitad de la almohadilla de calor para permitir que los animales autorregular la temperatura sin supervisión.</li>
		<li>Dosis en ratones con 0,1 mg/kg de buprenorfina (100 ml por vía subcutánea en el escrúpulo del cuello), 6-8 horas después de la cirugía (al final del día). Monitoree los ratones a primera hora de la mañana siguiente y dosis de ratones de nuevo con 0,1 mg/kg de buprenorfina (100 l por vía subcutánea en el cuello). Dar más alimentos húmedos según sea necesario.</li>
		<li>Monitoree ratones diariamente durante los próximos siete días. Los clips se pueden quitar después de siete días con el removedor de clip.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamiento adyuvante o neoadyuvante<ol>
<li>Tratar los ratones perioperatorios con (neo)adyuvante en un momento dado, dependiendo del tratamiento de interés.</li>
		<li>Por ejemplo, tratar ratones con una dosis de 100 g de anti-CTLA-4 intraperitonealmente (i.p.) el día 15 después de la inoculación, o con tres dosis de 200 g anti-PD-1 i.p. el día 15, 17 y 19 después de la inoculación.</li>
	</ol></li>
	<li>Controles experimentales<ol>
<li>Cuando utilice este modelo para evaluar los efectos de la inflamación/ cicatrización de heridas, considere el uso de los siguientes grupos de control: 1) Control sin cirugía (los tratamientos todavía se pueden administrar por vía intratumoal); 2) Control de la cirugía Sham: Se hace una incisión quirúrgica en la piel; el tumor es manipulado y expuesto, pero no se extirpa ningún tejido tumoral; la herida está cerrada con clips.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Sin revelaciones.

Proporcionamos un protocolo para un modelo de ratón de resección quirúrgica incompleta de sarcoma de tejidos blandos para probar terapias perioperatorias. También estandarizamos la incisión quirúrgica para permitir la evaluación de la cicatrización de heridas entre ratones después del tratamiento.
La colocación de tumores es una parte importante de este protocolo. Hemos optado por un modelo tumoral subcutáneo para permitir un fácil acceso quirúrgico al sitio del tumor y la administración de te...

La cirugía sigue siendo la principal opción de tratamiento para muchos tumores sólidos1,incluyendo el sarcoma de tejidos blandos2,3. A pesar de las mejoras en las técnicas de cirugía oncológica, y las combinaciones con (neo)terapias adyuvantes, todavía existe un alto riesgo de recaída del cáncer y metástasis después de la resección primaria del tumor4,,5. En el sarcoma de tejidos blandos, las recaídas ocurren particularmente locoregionalmente, en el lugar de la cirugía, lo que resulta en un aumento de la morbilidad y mortalidad. En el entorno clínico, puede ser difícil obtener márgenes lo suficientemente amplios (por ejemplo, debido a restricciones anatómicas), lo que resulta en una resección incompleta y una posterior recurrencia tumoral6. Se sabe que el estrés quirúrgico y el proceso posterior de cicatrización de heridas crean un microambiente tumoral inmunosupresor favorable para la recurrencia tumoral7,,8. Por lo tanto, el descubrimiento y desarrollo de nuevas terapias para el sarcoma de tejidos blandos, particularmente las inmunoterapias, deberían tener en cuenta idealmente la respuesta quirúrgica de cicatrización de heridas.
La mayoría de los estudios preclínicos para terapias adyuvantes se llevan a cabo inicialmente utilizando modelos de ratón singénero subcutáneo o xenotrasplante, sin incorporar el estrés quirúrgico y la respuesta de cicatrización de heridas9,,10. Por lo tanto, desarrollamos un modelo de sarcoma de tejido blando de ratón subcutáneo singéneo que incorpora una resección quirúrgica incompleta. WeHI 164 células de fibrosarcoma se inoculan por vía subcutánea, y una vez que se establecen los tumores, extirpamos 50-75% del volumen tumoral (Figura 1A-E). Los tumores rea cultivaron constantemente a partir del tumor restante. Este modelo permite probar terapias adyuvantes teniendo en cuenta el efecto del estrés quirúrgico y la cicatrización de heridas. Modelos quirúrgicos similares de resección incompleta se han utilizado en varios estudios por varios grupos y se ha encontrado que son reproducibles y eficaces11,12,13. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de este protocolo.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de insulina de 0,5 ml de calibre 26</td><td>Becton Dickinson, Australia</td><td>326769</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>21985023</td><td>Ninguno Máquina</td>de</tr><tr><td>gas anestésico</td><td>Darvall Vet, Australia</td><td>SKU: 2848</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Anti-CTLA-4</td><td>BioXcell, EE. UU</td>. <td>BE0164</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Anti-PD-1</td><td>BioXcell, EE. UU.</td><td>BP0273</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Clorhidrato de buprenorfina inyectable, 0,3 mg/ml</td><td>RB healthcare UK Limited, UK</td><td>55175</td><td>Pedido de prescripción</td></tr><tr><td>Exfoliante quirúrgico de clorhexidina 4%</td><td>Perigo Australia, Australia</td><td>CHL01449F(scrub</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>CellSera, Australia</td><td>AU-FBS-PG</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Pinzas Finas 10,5 cm</td><td>Casa quirúrgica, Australia</td> <td>OccidentalCC74110</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Pinzas Finas 12 cm</td><td>Quirófano dentado, Australia Occidental</td><td>CC74212</td><td>Ninguna</td></tr><tr><td>Pinza Halsted 14 cm</td><td>Casa quirúrgica, Australia Occidental</td><td>CD01114</td><td>Ninguna</td></tr><tr><td>Cámara de calentamiento</td><td>Datesand Ltd, Reino Unido</td><td>Mini-Thermacage</td><td>Ninguna</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>15630080</td><td>Ninguna</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein Animal Health, Australia</td><td>SKU: 29405</td><td>Pedido de prescripción</td></tr><tr><td>Ungüento lubricante para los ojos</td><td>Alcon</td><td>n/a</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina 1000X</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>15140122</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Solución tamponada de fosfato 10x</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>70013-032</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Reflex 7mm Clips</td><td>Able científico, Australia</td><td>AS59038</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Aplicador de clip para heridas Reflex de 7 mm</td><td>Able scientific, Australia</td><td>AS59036</td><td>Ninguno Removedor</td></tr> de <tr><td>clips para heridas reflejos</td><td>Able scientific, Australia</td><td>AS59037</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Circuito de respiración de anestesia Qube para roedores</td><td>Darvall Vet, Australia</td><td>#7885</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medio + L-glutamina</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>21870092</td><td>Ninguna</td></tr><tr><td>Tijeras Iris STR 11 cm</td><td>Casa quirúrgica, Australia Occidental</td><td>KF3211</td><td>Ninguna</td></tr><tr><td>Tijera Iris STR 9 cm</td><td>Casa quirúrgica, Australia Occidental</td><td>JH4209</td><td>Ninguna</td></tr><tr><td>Cámara de inducción pequeña</td><td>Darvall Vet, Australia</td><td>SKU: 9630</td><td>Ninguna</td></tr><tr><td>TrypLE express 1x</td><td>Life Technologies Australia Pty Ltd</td><td>12604-021</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Germinador 500 Esterilizador de perlas de vidrio</td><td>Cellpoint Scientific Inc., EE. UU.</td><td>5-1460-DK</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón de sarcoma de tejido blando insegurado incompletamente para terapias adyuvante de pruebas (neo)

A Mouse Model of Incompletely Resected Soft Tissue Sarcoma for Testing (Neo)adjuvant Therapies

La cirugía es a menudo el primer tratamiento para muchos tumores sólidos. Sin embargo, las recaídas locales ocurren con frecuencia después de la resección primaria del tumor, a pesar de las terapias adyuvante o neoadyuvante. Esto ocurre cuando los márgenes quirúrgicos no son suficientemente libres de tumores, lo que resulta en células cancerosas residuales. Desde una perspectiva biológica e inmunológica, la cirugía no es un evento nulo; el ambiente de cicatrización de heridas es conocido por inducir vías pro y anti-tumorigénicas. Como consecuencia, los modelos preclínicos para el desarrollo de fármacos destinados a prevenir la resección local deben incorporar resección quirúrgica al probar nuevas terapias (neo)adyuvante, para modelar los entornos clínicos en pacientes tratados con cirugía.
Aquí, describimos un modelo de ratón de resección quirúrgica incompleta del sarcoma de tejido blando WEHI 164 que permite probar terapias (neo)adyuvante en el entorno de una respuesta de cicatrización de heridas. En este modelo, se extirpa el 50% o 75% del tumor, dejando atrás algunos tejidos cancerosos in situ para modelar la enfermedad residual bruta después de la cirugía en el entorno clínico. Este modelo permite probar terapias en el contexto de la cirugía mientras se considera la respuesta de cicatrización de heridas, que puede afectar la eficacia de (neo)tratamientos adyuvantes. La resección quirúrgica incompleta da como resultado un recrecimiento reproducible del tumor en todos los ratones en ausencia de terapia adyuvante. El tratamiento adyuvante con bloqueo del punto de control reduce el crecimiento del tumor. Por lo tanto, este modelo es adecuado para las terapias de prueba en el contexto de la cirugía de desbulado y su respuesta de cicatrización de heridas asociada y se puede extender a otros tipos de cáncer sólido.

El crecimiento del tumor a un tamaño de 50 mm2 es un tamaño ideal para el debulk parcial. La resección quirúrgica incompleta de 50 mm2 tumores da como resultado un recrecimiento reproducible del 100% (n-5) de los tumores en ausencia de inmunoterapia adyuvante (Figura 4A). A continuación utilizamos el modelo para probar inmunoterapias adyuvante utilizando anticuerpos contra moléculas de punto de control Citotóxico T Lymph...

En este protocolo, describimos un modelo de ratón de resección quirúrgica incompleta de sarcoma de tejido blando para la prueba (neo)terapias adyuvantees.

Un modelo de ratón de sarcoma de tejido blando insegurado incompletamente para terapias adyuvante de pruebas (Neo)

Surgery is often the first treatment for many solid tumors. However, local relapses frequently occur following primary tumor resection, despite adjuvant ...

Este protocolo tiene como objetivo imitar el entorno clínico de la enfermedad residual después de la cirugía de desbulado tumoral, y por lo tanto nos permite probar nuevas terapias oncológicas en el contexto de la cicatrización postoperatoria de heridas. La ventaja de esta técnica es que permite estandarizar la cantidad de herida infligida y la cantidad de tumor que queda. Esta técnica es particularmente importante para los estudios preclínicos en la identificación de nuevos tratamientos para el cáncer, que recidivte localmente un ejemplo de lo cual es el sarcoma de tejidos blandos.Esta demostración visual es fundamental para demostrar la técnica de inversión, que nos permite exponer el tumor unido al lado de la piel. Comience este procedimiento con la inoculación subcutánea de células cancerosas preparadas en ratones, como se describe en el protocolo de texto. En el día 12, después de la inoculación, cuando los tumores han alcanzado un tamaño de aproximadamente 50 milímetros cuadrados, ratones con 100 microlitros de buprenorfina por vía subcutánea en el escrúpulo del cuello, 30 minutos antes de la cirugía.Configure el área quirúrgica con la almohadilla de calor cubierta con una capa de banco y configure un cono nasal para la anestesia. Organice equipos quirúrgicos limpios para que estén al alcance de la mano, incluyendo clorhexadina, hisopo, gasa, gel para los ojos, dos fórceps curvos, tijeras, aplicador de clip, removedor de clip y recargas de clip. Caliente la cámara de calentamiento a 37 grados centígrados y configure otra almohadilla de calor para la recuperación.Tenga en cuenta que este procedimiento requiere dos personas. Un asistente debe vigilar de cerca la respiración del ratón durante el procedimiento. Después de anestesiar el ratón como se describe en el protocolo de texto, realice una prueba de pellizcar y una prueba de reflejo corneal para asegurarse de que el ratón está completamente anestesiado antes de comenzar la cirugía.Cubra los ojos del ratón con una pequeña cantidad de gel oftálmico para evitar la sequedad ocular. Comience esta cirugía frotando el área quirúrgica con clorhexadina. Usando fórceps y un par de tijeras hacen una incisión recta de un centímetro a lo largo del lado dorsal, a tres milímetros del tumor.No corte la piel que cubre directamente el tumor, ya que no sanará bien. Evite usar un bisturí para cortar el tumor y use pinzas para recoger las piezas. Con pinzas, retira la fascia y el tejido graso subcutáneo entre el tumor y el peritoneo.El tumor subcutáneo normalmente se une al lado de la piel. Abra la herida sosteniendo suavemente la piel en el lado del rodamiento del tumor usando pinzas e invierta el tumor para que sea visible en el exterior. Usando un par de tijeras, corta la cápsula tumoral de la mitad para extraerla, comenzando desde la base del tumor más cercana a la abertura.Para la cirugía del 50%debulk, corte a través de la mitad del tumor. El uso de fórceps curvos recoge la sección del tumor que se va a extirpar. Recoja los restos del área de debulk.Para el 75%debulk, comienza por realizar un 50% de debulk tumor y luego corta a la mitad el 50% restante del tumor. Recoge el 25% del tumor usando fórceps curvos. Para cerrar el sitio quirúrgico, coloque el tumor restante debajo de la piel y usando fórceps, tire de los colgajos de la piel y alinee la piel a lo largo de la herida.Sujete la piel a cinco milímetros del borde de la herida y utilice clips quirúrgicos para cerrar la herida comenzando en el lado, más cerca de los fórceps. Aplique tantos clips como sea necesario para asegurarse de que no se exponga ningún tejido subyacente. Generalmente, se aplican de tres a cuatro clips con espacios de dos milímetros entre clips.Permita que los ratones se recuperen poniéndolos en la cámara de calentamiento caliente. Coloque la jaula del ratón en la almohadilla de calor. Monitoree a los ratones en la cámara de calentamiento hasta que se hayan recuperado del anestésico.Luego, vuelva a colocar los ratones en la jaula, deje la jaula en la almohadilla de calor durante otros 10 minutos hasta que los ratones se hayan vuelto más activos. Dale a los ratones alimentos húmedos y suaves. Monitoree a los ratones una hora después de la cirugía para la recuperación.Supervise los ratones de nuevo al final del día y a la mañana siguiente y asegúrese de que los clips permanezcan en su lugar. Tratar los ratones perioperatorios con terapia de advenimiento o neoadyuvante en un momento dado, dependiendo del tratamiento de interés. Por ejemplo, tratar ratones con una dosis de 100 microgramos de anti-CTLA-4 intraperitonealmente el día 15 después de la inoculación.Alternativamente, tratar a los ratones con tres dosis de 200 microgramos de anti-PD-1 intraperitonealmente en días, 15, 17 y 19 después de la inoculación. La resección quirúrgica incompleta de 50 tumores de milímetros cuadrados, indicada aquí por la línea punteada da como resultado un recrecimiento 100% reproducible de los tumores en ausencia de inmunoterapia adyuvante. Por lo tanto, el crecimiento del tumor a un tamaño de 50 milímetros cuadrados es un tamaño ideal para el debulk parcial.El modelo se utilizó entonces para probar inmunoterapias adyuvante utilizando anticuerpos contra módulos de punto de control, proteína asociada al linfocitos T citotóxicos cuatro y receptor de muerte programado uno. El tratamiento de ratones con anti-CTLA-4, dio lugar a una tasa de curación del 80%Mientras que el tratamiento de ratones con anti-PD-1 dio lugar a una tasa de curación del 25%La respuesta con anti-PD-1 ofrece la oportunidad de probar nuevas combinaciones, para mejorar aún más la tasa de respuesta. Es importante que el tumor restante permanezca unido a la piel, de lo contrario se cortará el suministro de sangre y el tumor se convertirá en el necrótico.Después de este procedimiento, los tumores pueden ser analizados por una variedad de métodos, como la citometría de flujo con el fin de evaluar cómo la cirugía afecta a las células infiltrantes tumorales. Este modelo de ratón nos ha permitido explorar cómo la cicatrización de heridas afecta a las inmunoterapias contra el cáncer.

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Research

Investigación

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Medicine

Medicina

Este video describe el protocolo para establecer un modelo de ratón de metástasis espontánea de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer colorrectal o PDX. Estos modelos de xenoinjertos imitan parcialmente las características de los carcinomas humanos y comprenden los aspectos críticos de las neoplasias malignas humanas, incluidas la invasión y la metástasis.

Modelos de ratón con metástasis espontánea: una plataforma para estudiar el potencial metastásico de las células de cáncer colorrectal inyectadas ortotópicamente

Este video ilustra las pruebas de terapia adyuvante o adicional en un modelo de ratón con tumores subcutáneos resecados incompletamente. El ratón parcialmente resecado del tumor se trata con un anticuerpo dirigido a la proteína anticitotóxica de las células T reguladoras, lo que podría reducir el recrecimiento del tumor y sugerir una terapia adyuvante eficaz.

Terapia adyuvante en un modelo de ratón con un tumor subcutáneo resecado de forma incompleta

Fuente: Alomari, S., et al. Implementación de la resección de tumores cerebrales mínimamente invasivos en roedores para la recolección de tejidos de alta viabilidad. J. Vis. Exp. (2022)Este video demuestra el uso de un sistema de resección mínimamente invasivo (MIRS) para extirpar el tejido tumoral de un ratón anestesiado implantado con un tumor. El procedimiento consiste en asegurar el ratón en un marco estereotáctico, reabrir el sitio quirúrgico anterior para acceder al cerebro e insertar una...

Resección de tumores cerebrales en un ratón mediante un sistema de resección mínimamente invasivo

Un modelo de tumor de ratón de estrés quirúrgico se utiliza para explorar la forma en la inmunosupresión postoperatoria promueve la enfermedad metastásica y para evaluar las terapias perioperatorias inmunoestimulantes.

Un modelo de tumor de Estrés quirúrgico para explorar los mecanismos de inmunosupresión postoperatoria y Evaluar Novel perioperatorias Inmunoterapias Ratón

Modelos de progresión de la enfermedad espontánea carcinoma metastásico de células renales (CCR) pueden ser utilizados para la evaluación de los tratamientos en un entorno clínicamente relevante. Este protocolo demuestra diferentes procedimientos para la implantación de células tumorales de riñón ortotópico, nefrectomía adecuado, y finalmente describe una guía para la necropsia de puntuación visual y bioluminiscente de carga metastásica y la localización.

Modelado espontánea metastásico Carcinoma de células renales (CCR metastásico) en ratones después de la nefrectomía

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La aplicación de un modelo ortotópico de carcinoma de células renales en ratones inmunocompetentes proporciona el investigador un sistema clínicamente relevante definido por la presencia de una metástasis de tumores primarios de pulmón y renales en el mismo animal. Este sistema puede ser utilizado para probar preclínicamente una variedad de tratamientos in vivo.

Un carcinoma de células singénicas modelo de ratón de la renales metastásico para la evaluación cuantitativa y longitudinal de preclínicos sobre Terapias

Inyección directa de vesículas extracelulares derivadas de cáncer (EVs) conduce a la reprogramación de la médula ósea apoyando la progresión del tumor; sin embargo, está claro que las células median este efecto. Adjunto, describimos un protocolo paso a paso para investigar EV-mediada de células madre tumorales mesenquimales (MSC) interacciones en vivo, revelando un papel crucial para MSCs EV-educado en metástasis.

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Un modelo de ratón de sarcoma de tejido blando insegurado incompletamente para terapias adyuvante de pruebas (Neo)

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