Name: Imágenes de lapso de tiempo de enjambres bacterianos y la respuesta colectiva al estrés (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Aprende a generar películas de lapso de tiempo de enjambres de Pseudomonas aeruginosa y su respuesta repulsiva ante bacteriófagos y antibióticos. Este método simple utiliza un escáner de documentos para visualizar dinámicas de enjambre en tiempo real.

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J.-L.B., A.S., y N.M.H-K. escribió y revisó el manuscrito. Todos los autores diseñaron los experimentos. J.-L.B. realizó los experimentos y análisis. Este trabajo fue apoyado por el premio NIH K22AI112816 y la concesión R21AI139968 a A.S. y por la Universidad de California. N.M.H-K. fue apoyado por las Becas Lundbeck R220-2016-860 y R251-2017-1070. Los funderos no tuvieron ningún papel en la decisión de presentar la obra para su publicación. No tenemos intereses que declarar.

1. Preparación de placas de agar enjambre para P. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging
<ol><li>Preparar 1 L de 5x M8 medios mínimos en una botella de vidrio añadiendo 64 g de Na2HPO4•7H2O, 15 g de KH2PO4y 2,5 g de NaCl en agua de doble destilación de 500 ml (ddH2O). Ajuste el volumen final a 1 L con ddH2O. Autoclave adicional para esterilizar y almacenar medios líquidos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar 100 ml de 1 M MgSO4 (sulfato de magnesio) en una botella de vidrio añadiendo 24,6 g de MgSO4•7H2O en 50 ml ddH2O. Ajuste el volumen final a 100 ml con ddH2O. Autoclave adicional para esterilizar. Conservar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar 100 ml de 20% de ácidos casamino en una botella de vidrio añadiendo 20 g de ácidos casamino en 50 ml ddH2O. Ajuste el volumen final a 100 ml con ddH2O. Autoclave adicional para esterilizar. Conservar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar 100 ml de 20% de glucosa en un frasco de vidrio añadiendo 20 g de glucosa en 50 ml de ddH2O. Ajuste el volumen final a 100 ml con ddH2O. Esterilizar por filtración con filtro de 0,22 m. Conservar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Para hacer 10 placas de agar enjambre, añadir 1 g de agar en 100 ml de ddH2O y ajustar el volumen final a 160 ml con ddH2O adicional en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Esterilice mediante autoclave.<ol>
<li>Inmediatamente después del autoclave, coloque la solución de agar en un baño de agua de 55 oC durante 15 minutos.</li>
		<li>Retire la solución de agar del baño de agua y añada 40 ml de 5x M8 medios mínimos, 200 ml de 1 M MgSO4, 2 ml de 20% de glucosa y 5 ml de ácidos casamino al 20%15. Continúe con el paso 1.6 inmediatamente después de la mezcla. NOTA: Las concentraciones finales son 0,5% agar, 1 mM MgSO4, 0,2% glucosa y 0,5% ácidos casamino.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando una pipeta de 25 ml para un volumen constante, agregue 20 ml de la solución de agar enjambre por plato Petri de 10 cm de diámetro. NOTA: Un volumen fijo de solución de agar es importante, ya que el volumen afecta al tiempo de secado y al contenido de humedad del agar. Evite las burbujas al hacer las placas de agar enjambre.</li>
	<li>Deje que el agar se solidifique colocando las placas de agar enjambre en una sola pila con tapas puestas durante 1 h en el banco a temperatura ambiente. Encienda el deshumidificador para disminuir la humedad relativa de la habitación a 40-50% 1 h antes del siguiente paso.</li>
	<li>Seque las placas de agar enjambre durante 30 minutos adicionales con las tapas en una campana de flujo laminar a 300 pies3/min con 40-50% de humedad relativa a temperatura ambiente. Seque el interior de las tapas colocándolas boca arriba en la campana de flujo laminar. Almacene las placas de agar enjambre a 4 oC durante un máximo de 24 h.</li>
	<li>Prepare tapas negras de 10 cm petri para la toma de imágenes alisando el interior de la tapa con papel de lija. Coloque las tapas dentro de una caja de embalaje y coloque la caja de embalaje debajo de una campana química. Rocíe dentro de las tapas con pintura en aerosol negra. Deje que las tapas se sequen. NOTA: Las tapas negras se pueden reutilizar para experimentos adicionales. Es importante que las tapas estén pintadas para que no reflejen la luz durante el escaneo.</li>
</ol>2. Crecimiento de las condiciones de P. aeruginosa y Plating
<ol><li>Preparar 400 ml de caldo de lisógenia (LB) añadiendo 10 g de mezcla en polvo LB-Miller en 400 ml ddH2O. Para platos de Petri de 2% LB-agar, agregue 8 g de agar adicional. Autoclave para esterilizar.</li>
	<li>Vierta 20 ml de medio de agar LB fundido en platos Petri de 10 cm de diámetro y deje que se solidifiquen a temperatura ambiente durante la noche. Almacene los medios líquidos a temperatura ambiente y a garares a 4oC.</li>
	<li>Streak P. aeruginosa en un plato de Petri LB-agar a partir de un caldo congelado almacenado a -80 oC utilizando lazos estériles o palos de madera. Incubar la placa Petri boca abajo durante la noche a 37oC. Almacene la placa de agar LB a 4 oC durante un máximo de 1 semana.</li>
	<li>Escoge una sola colonia de la placa Petri con un lazo estéril o palo de madera, inocularla en un medio LB de 2 ml e incubar el cultivo a la saturación durante la noche (16-18 h) a 37oC en un tambor de rodillos a 100 rpm.</li>
	<li>Pipeta de 5 l de cultivo nocturno del paso 2.4 utilizando un pipeta P20 y punto en el centro de la placa de agar enjambre acercándose a la punta del pipeta en un ángulo (10–45o) 2,5 cm por encima del área de manchado, pipeteando hasta la primera parada, y tocando el agar con sólo la gota de líquido(Figura 1B).<ol>
<li>Evite tocar el agar con la punta del pipeteo, ya que daña el agar. Utilice una plantilla para colocar el punto constantemente a través de diferentes placas de agar enjambre(Figura suplementaria S1).</li>
		<li>Para los ensayos de enjambre tradicionales, utilice solo el punto central y vaya al paso 2.8. Para los ensayos de respuesta al estrés colectivo, continúen con el paso 2.6 (para la infección por fagos) o el paso 2.7 (para el estrés antibiótico).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para la infección por fago, mezcle 30 ml de cultivo nocturno de P. aeruginosa a partir del paso 2.4 con 6 l de 1 x10 12 pfu/ml de fago DMS3vir20. Proceda inmediatamente al siguiente paso.<ol>
<li>Pipet a 6 l de la P. mezcla de aeruginosa-fago del paso 2.6 usando un pipeta P20 y punto en 6 posiciones de satélite equidistantes en un círculo concéntrico de radio de 2,8 cm que se centra en la placa Petri acercándose a la punta del pipeta en un ángulo (10 a 45o) 2,5 cm por encima del área de manchado, pipeteando hasta la primera parada, y tocando el agar con solo la caída de líquido(Figura 1).C</li>
		<li>Evite tocar el agar con la punta del pipeteo, ya que daña el agar. Utilice una plantilla de chapado para la coherencia (Figura suplementaria S1). Continúe con el paso 2.8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para los tratamientos antibiótico, mezcle el cultivo nocturno de 30 ml P. aeruginosa del paso 2.4 con 6 ml de gentamicina de 3 mg/ml, 10 ml de kanamicina de 100 mg/ml o 7,5 ml de fosfomicina de 100 mg/ml. Proceda inmediatamente al siguiente paso.<ol>
<li>Pipet 6 l de antibiótico tratado P. aeruginosa del paso 2.7 usando una pipeta P20 y spot en 6 posiciones de satélite equidistantes en un círculo concéntrico de radio de 2,8 cm alrededor del centro de la antena acercándose a la punta del pipeteo en un ángulo (10 a 45o) 2,5 cm por encima del área de detección, pipeteando hasta la primera parada, y tocando el agar con solo la gota de líquido).D</li>
		<li>Evite tocar el agar con la punta del pipeteo, ya que daña el agar. Utilice una plantilla de chapado para la coherencia (Figura suplementaria S1). Continúe con el paso 2.8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sustituya las tapas claras de la vajilla Petri por tapas negras hechas en el paso 1.9(Figura 2A).</li>
	<li>Coloque las placas de agar enjambre en un escáner en una incubadora a 37 oC con un baño de agua de 10 L para mantener la humedad al 75%(Figura 1E, Figura 2B). ADVERTENCIA: No moleste las células manchadas en las placas de agar enjambre. Mantenga las placas hacia arriba en todo momento.</li>
</ol>3. Adquisición de imágenes con escáner
<ol><li>Disminuya la iluminación ambiental de los platos Petri conectando tela mate negra a un estante de 40-60 cm por encima del escáner de documentos de base plana. Asegúrelo usando corbatas(Figura 2B).</li>
	<li>El escáner se controlará mediante un software de escaneo y un software de scripting automático.<ol>
<li>En el software de escaneado, seleccione Modo de inicio(figura 3A). Capture imágenes en color seleccionando Color en Tipo de imagen. Para establecer la calidad de imagen, seleccione Otro en Destino y ajuste la Resolución a 300 ppp. Mantenga el tamaño estándar de las imágenes seleccionando Original para Tamaño de destino. Deje todas las opciones en Ajustes de imagen desactivadas para obtener la calidad de imagen estándar. NOTA: Tamaño de destino se establece en Original de forma predeterminada. Para seleccionar otras opciones para Tamaño de destino, haga clic en Vista previa primero.</li>
	</ol></li>
	<li>Establezca la ruta de guardado de las imágenes haciendo clic en el icono de carpeta a la derecha de Escanear para abrir Configuración de guardado de archivos(Figura 3A).<ol>
<li>Seleccione el destino de la carpeta para guardar imágenes seleccionando Otro en Ubicación y haga clic en Examinar. Elija una carpeta para guardar las imágenes.</li>
		<li>Asigne un nombre a las imágenes en el cuadro de texto Prefijo. Establezca número de inicio 001 para comenzar la secuencia de nomenclatura de las imágenes. Establezca el formato de archivo en JPEG seleccionando JPEG (*.jpg) en Tipo en Formato de imagen y haga clic en Opciones para ajustar detalles. Establezca la calidad del formato de imagen ajustando El nivel de compresión a 16, Codificación a estándar y marque Incrustar perfil ICC. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana(Figura 3B).</li>
		<li>Deje la primera opción desactivada ("Sobrescribir cualquier archivo con el mismo nombre") y marque las 3 opciones siguientes ("Mostrar este cuadro de diálogo antes del siguiente escaneo", "Abrir carpeta de imagen después de escanear" y "Mostrar cuadro de diálogo Agregar página después de escanear"). Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana</li>
		<li>Compruebe la calidad de la imagen haciendo clic en Vista previa. Aparece la ventana de vista previa y el icono Escanear se vuelve funcional(Figura 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Utilice el software de scripting para automatizar la adquisición de imágenes. El script proporcionado hace clic en Escanear en la ventana Escanear y en Aceptar en la ventana Configuración de guardado de archivos a intervalos de 30 minutos.<ol>
<li>Importe el script haciendo clic en Tarea ( Task) Importe y seleccione Single_scan.tsk y Idle_scanning.tsk (archivos TSK proporcionados como archivos suplementarios 1 y 2). Vea la figura 3D. NOTA: Single_scan.tsk hace clic en el botón Escanear en la ventana Escanear y en Aceptar en la ventana Configuración de guardado de archivos. Idle_scanning.tsk activa Single_scan.tsk cada 30 minutos. Uno puede cambiar la frecuencia de escaneo cambiando la activación de Idle_scanning.tsk.</li>
		<li>Habilite el análisis automático a intervalos de 30 minutos seleccionando Análisis inactivo (importado) y Análisis único (importado),haciendo clic con el botón derecho en Análisis inactivo (importado)y haciendo clic izquierdo en Habilitado (Figura 3D, Figura suplementaria S2). NOTA: El análisis automático se ejecuta hasta que el usuario detiene manualmente el script. Para detener el script, seleccione Análisis inactivo (importado),haga clic con el botón derecho en Análisis inactivo (importado)y haga clic con el botón izquierdo en Habilitado. Se eliminará la marca de verificación.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Compilación de imágenes de lapso de tiempo y repulsión del enjambre de medición
<ol><li>Realice la edición de imágenes y el análisis de imágenes con ImageJ.</li>
	<li>Importe todas las imágenes escaneadas a ImageJ haciendo clic en Archivo . Importación de la lista de importaciones Secuencia de imágenes y seleccione las imágenes. En la ventana Opciones de secuencia, active Convertir a RGB para mantener las imágenes en color. El número de imágenes indica el número de imágenes seleccionadas.</li>
	<li>Mantenga Iniciar imagen en 1 para empezar desde la primera imagen de la carpeta y Escalar imágenes al 100% para conservar el tamaño original de las imágenes. Deje la opción Usar pila virtual desactivada. Haga clic en Aceptar y espere a que se carguen las imágenes(Figura 4A).</li>
	<li>Establezca el nivel de compresión de vídeo en 100 haciendo clic en Editar . Opciones de la página de opciones de la Entrada/Salida... y ajuste la calidad JPEG a 100.</li>
	<li>Guarde el archivo como un archivo .avi haciendo clic en Archivo . Guardar como ? AVI. Ajuste la compresión a JPEG y la velocidad de fotogramas a 5 fps(Figura 4B). Guarde el lapso de tiempo .avi en la carpeta deseada.</li>
	<li>Para cuantificar las distancias de repulsión del enjambre, abra una imagen cerca del final del período de enjambre en ImageJ. Haga clic en Archivo ? Abra y seleccione la imagen. Ajustar la escala haciendo clic en Analizar ( Analizar) Establezca Escala y ajuste Distancia en píxeles a 118, Distancia conocida en 1, Relación de aspecto de píxeles en 1,0 y Unidad de longitud a cm ( Figura4C). Deje Global sin marcar. Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana.</li>
	<li>Haga clic en el icono Recto y mida desde el centro de la colonia en la posición del satélite hasta el borde de la población enjambre. Seleccione Analizar (Analizar) Medida para hacer que aparezca una nueva ventana con las medidas (Longitud) (Figura 4D). NOTA: Utilice "+" para acercar el zoom y "-" para alejar.</li>
</ol>

<ol><li>Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+and+mobility+protect+swarming+bacteria+against+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).</li>
<li>Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+motility%3A+a+multicellular+behaviour+conferring+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance.</a> Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).</li>
<li>Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+a+complex+adaptation+leading+to+increased+production+of+virulence+factors+and+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance.</a> Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).</li>
<li>Yeung, A. T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+controlled+by+a+broad+spectrum+of+transcriptional+regulators%2C+including+MetR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR.</a> Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).</li>
<li>Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+physiochemical+properties+of+mucus+in+the+protection+of+the+respiratory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium.</a> The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).</li>
<li>Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhamnolipids+modulate+swarming+motility+patterns+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).</li>
<li>Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aD%C3%A9ziel%2C+E+%22Microbiology%22">Microbiology</a>. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).</li>
<li>Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+implications+on+rhamnolipid+biosurfactant+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Genetic+Engineering+Reviews%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production.</a> Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).</li>
<li>Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarming+of+Pseudomonas+aeruginosa+is+dependent+on+cell-to-cell+signaling+and+requires+flagella+and+pili%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili.</a> Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).</li>
<li>Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+forms+spreading+dendrites+that+have+characteristics+of+active+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility.</a> Scientific Reports. 5, 17698(2015).</li>
<li>Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotaxis+system%2C+but+not+chemotaxis%2C+is+essential+for+swarming+motility+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).</li>
<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).</li>
<li>Tremblay, J., Déziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+reproducibility+of+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays.</a> Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).</li>
<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+imaging%2C+and+quantification+of+bacterial+surface+motility+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338(2015).</li>
<li>Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plate-based+assay+for+swarming+motility+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).</li>
<li>Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-produced+extracellular+stimuli+modulate+the+Pseudomonas+aeruginosa+swarming+motility+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour.</a> Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).</li>
<li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+dependent+alkyl+quinolone+signaling+responses+to+antibiotics+in+Pseudomonas+aeruginosa+swarms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).</li>
<li>Bru, J. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PQS+produced+by+the+Pseudomonas+aeruginosa+stress+response+repels+swarms+away+from+bacteriophage+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li>
<li>van Kessel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PQS+signaling+for+more+than+a+quorum%3A+the+collective+stress+response+protects+healthy+Pseudomonas+aeruginosa+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations.</a> Journal of Bacteriology. , (2019).</li>
<li>Zegans, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+bacteriophage+DMS3+and+host+CRISPR+region+inhibits+group+behaviors+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).</li>
<li>Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+hardness+impairment+of+quorum+sensing+and+swarming+for+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa.</a> PloS One. 6 (6), 20888(2011).</li>
<li>Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Environmental+Factors+Influence+the+Importance+of+the+Phosphodiesterase+DipA+upon+Pseudomonas+aeruginosa+Swarming%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).</li>
<li>Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Metabolic+and+Quorum+Sensing+Signals+Governing+the+Decision+to+Cooperate+in+a+Bacterial+Social+Trait%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait.</a> PLoS computational biology. 11 (5), 10004279(2015).</li>
<li>Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Pseudomonas+aeruginosa+surface-associated+group+behaviors+by+individual+amino+acids+through+c-di-GMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling.</a> Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo se centra en minimizar la variabilidad en las placas de agar enjambre y proporcionar un método simple y de bajo costo para adquirir imágenes de lapso de tiempo de P. aeruginosa enjambre y responder al estrés. Este procedimiento se puede extender a la imagen de otros sistemas bacterianos mediante la adaptación de la composición de los medios y las condiciones de crecimiento. Para P. aeruginosa,aunque M9 o FAB medio mínimo se puede utilizar para inducir enjambre16<su...

El enjambre es una forma colectiva de motilidad bacteriana coordinada que aumenta la resistencia a los antibióticos y la producción de factores de virulencia en el huésped1,2,3. Este comportamiento multicelular ocurre en superficies semisólidas que se asemejan a las de las capas mucosas que cubren las membranas epiteliales en los pulmones4,5. Los biosurfactantes son comúnmente producidos por poblaciones enjambres para superar la tensión superficial en las superficies y la producción de estos está regulada por complejos sistemas de señalización de células celulares, también conocidos como cuórum de sensato6,7,8. Muchas especies de bacterias son capaces de enjambre, incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,y Escherichia coli9,10,11,12. Los patrones de enjambre creados por las bacterias son diversos y se ven afectados por las propiedades físicas y químicas de la capa superficial, incluyendo la composición de nutrientes, porosidad y humedad13,14. Además de las propiedades de la superficie, la temperatura de crecimiento y la humedad ambiental afectan a varios aspectos de la dinámica de enjambre, incluyendo la tasa de enjambre y los patrones12,,13,,14,,15. Las variables de crecimiento que afectan al enjambre crean desafíos que afectan la reproducibilidad experimental y la capacidad de interpretar los resultados. Aquí, describimos un método estandarizado simple para monitorear la dinámica de los enjambres bacterianos a través de imágenes de lapso de tiempo. El método describe cómo controlar las condiciones críticas de crecimiento que afectan significativamente la progresión del enjambre. En comparación con los métodos tradicionales de análisis de enjambres, este método de imágenes de lapso de tiempo permite realizar un seguimiento de la motilidad de múltiples enjambres simultáneamente durante períodos prolongados de tiempo y con alta resolución. Estos aspectos mejoran la profundidad de los datos que se pueden obtener de la supervisión de enjambres y facilitan la identificación de los factores que afectan el enjambre.
El enjambre en P. aeruginosa se facilita a través de la producción y liberación de ácidos rhamnolipids y 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic en el área circundante6,16. La introducción del estrés a partir de concentraciones subletales de antibióticos o infección por el virus del fago afecta la organización de enjambres. En particular, estas tensiones inducen a P. aeruginosa a liberar la molécula de sensibilidad de quórum 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolona, también conocida como la señal de quinolona Pseudomonas (PQS)17,18. En los ensayos de enjambres que contienen dos poblaciones de enjambres, los PQS producidos por la población inducida por el estrés repele que los enjambres no tratados entren en el área que contiene la tensión (Figura 1). Esta respuesta de estrés colectivo constituye un sistema de señalización de comunicación de peligro que advierte a P. aeruginosa sobre amenazas cercanas18,,19. Los efectos del estrés en P. aeruginosa, la activación de la respuesta de estrés colectivo y la repulsión de enjambres se pueden visualizar utilizando el método de imagen de lapso de tiempo descrito aquí. El protocolo descrito aquí explica cómo: (1) preparar placas de agar para enjambre, (2) cultivo P. aeruginosa para dos tipos de ensayos (ensayos de enjambre tradicionales o ensayos de respuesta de estrés colectivo)(Figura 1), (3) adquirir imágenes de lapso de tiempo, y (4) utilizar ImageJ para compilar y analizar las imágenes.
Brevemente, P. aeruginosa de un cultivo nocturno se ve en medio de una placa de agar enjambre, mientras que P. aeruginosa que están infectados con fago o tratados con antibióticos son vistos en las posiciones del satélite. La progresión del enjambre de P. aeruginosa se supervisa en un escáner de cama plana de documentos de consumo que se coloca en una incubadora de 37 oC regulada por humedad. El escáner está controlado por un software que escanea automáticamente las placas a intervalos regulares durante el período de crecimiento del enjambre, normalmente de 16 a 20 h. Este método produce videos simultáneos de lapso de tiempo de hasta seis placas de enjambre de 10 cm. Las imágenes se compilan en películas y la repulsión de enjambres por poblaciones inducidas por el estrés se cuantifica mediante el uso de software ImageJ disponible libremente. Se presta especial atención a garantizar la coherencia y reproducibilidad entre los diferentes experimentos de enjambre.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivos</fuerte></td>Bacto agar, deshidratado BD Difco 214010 Para placa de agar LB y placa de agar enjambre Ácidos Casamino BD Difco 223050 Para medios de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>enjambre</td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dextrosa. Para medios de enjambre</td></tr><tr><td>Sal disódica de fosfomicina Industria</td><td>química de Tokio</td><td>F0889</td><td>Concentración de existencias: 200 mg/mL. Disuelto en ddH2O</td></tr><tr><td>sulfato de gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td>Concentración de stock: 3 mg/mL. Disuelto en ddH2O</td></tr><tr><td>Sulfato de kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>Concentración de existencias: 100 mg/mL. Disuelto en ddH2O</td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>Para caldo LB y placas de agar LB</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>Para enjambre de medios</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>Para 5 medios M8</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Para 5 medios</td></tr> <tr><td>M8Fosfato de sodio dibásico heptahidratado</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td>Para 5x M8 media</td></tr><tr><td><fuerte>Cepas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS27E.118</td><td>PA14 cepa</td></tr><tr><td>DMS3vir</td><td>O'Toole lab</td><td>DMS3vir20</td><td>Bacteriófago</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel de lija de óxido de aluminio</td><td>3M</td><td>150 Fine</td><td>Para tapas negras Tela</td></tr><tr><td></td><td>negra Joann</td><td>PRD7089</td><td>Tela negra Pintura</td></tr> en <tr><td>aerosol negra</td><td>Krylon</td><td>5592 Negro mate</td><td>Para tapas negras</td></tr><tr><td>Matraz Erlenmeyer</td><td>Kimax</td><td>26500</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Botellas de vidrio</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1,000 mL</td></tr><tr><td>Bridas de 8 pulgadas</td><td>Gardner Bender</td><td>E173770</td> Para colocar placas de Petri de <td>tela mate negra</td></tr><tr><td>(100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>placas de poliestireno de 100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Palos de madera</td><td>Fisher</td><td>23-400-102</td><td>Para rayar e inocular bacterias</td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mercado de autoclaves</td><td>Forge Industries</td><td>STM-E</td><td>Para reactivos esterilizantes</td></tr><tr><td>Pipeta de 25 mL</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1072-5410</td><td>Para pipetear 20 mL para enjambre de placas de agar</td></tr><tr><td>Deshumidificador</td><td>Frigidaire</td><td>FAD704DWD 70 pintas</td><td>Para mantener la humedad relativa de la habitación en aproximadamente 45%</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v1.52a</td><td>Software para el análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>Para el crecimiento de bacterias a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Baño de agua Isotemp</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>Para enfriar medios hasta 55 &deg; C</td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar</td><td>The Baker Company</td><td>SG603A</td><td>Para placas de secado</td></tr><tr><td>Pipeta P-20</td><td>Gilson</td><td></td><td>F123601 Manchado en placas de agar de enjambre</td></tr><tr><td>Controlador de pipetas</td><td>BrandTech</td><td>accu-jet</td><td>Para pipetear 20 mL para enjambre de placas de agar</td></tr><tr><td>Tambor de rodillo</td><td>New Brunswick</td><td>TC-7</td><td>Para el crecimiento de bacterias a 100 rpm</td></tr><tr><td>Escáner</td><td>Epson</td><td>Epson Perfection V370</td><td>Photo Scanner para placas de imagen Software de</td></tr><tr><td>automatización de escáner</td><td>RoboTask Lite</td><td>v7.0.1.932</td><td>Para imágenes internas de 30 minutos Software de</td></tr><tr><td>adquisición de imágenes de escáner</td><td>Epson</td><td>v9.9.2.5US</td><td>Software para placas de imagen</td></tr></tbody></table>

imágenes de lapso de tiempo de enjambres bacterianos y la respuesta colectiva al estrés

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

El enjambre es una forma de motilidad superficial observada en muchas especies bacterianas incluyendo Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. Aquí, las poblaciones densas de bacterias se mueven a grandes distancias en comunidades características en forma de zarcillo en el transcurso de horas. El enjambre es sensible a varios factores, incluyendo humedad media, humedad y contenido de nutrientes. Además, la respuesta al estrés colectivo, que se observa en P. aeruginosa que se estresa con antibióticos o bacteriófagos (fago), repele que los enjambres se acerquen a la zona que contiene el estrés. Los métodos descritos aquí abordan cómo controlar los factores críticos que afectan al enjambre. Presentamos un método sencillo para monitorear la dinámica de enjambre y la respuesta de tensión colectiva con alta resolución temporal usando un escáner de documentos de base plana, y describimos cómo compilar y realizar un análisis cuantitativo de enjambres. Este método simple y rentable proporciona una cuantificación precisa y bien controlada del enjambre y puede extenderse a otros tipos de ensayos de crecimiento a base de placas y especies bacterianas.

Los pasos para cultivar P. aeruginosa, estresar las células e imaginar las placas de agar enjambre se representan en la Figura 1. Inoculamos una sola colonia de cepas de tipo salvaje P. aeruginosa UCBPP-PA14 a partir de una placa de agar LB en 2 ml de caldo LB durante la noche a 37 oC y nos detectamos 5 oC en el centro de la placa de agar enjambre. Las imágenes de lapso de tiempo de esta placa revelan el crecimiento inicial en forma de colonia en el centro y luego la propagación de zarc...

Detallamos un método simple para producir películas de lapso de tiempo de alta resolución de enjambres Pseudomonas aeruginosa que responden al bacteriófago (fago) y estrés antibiótico utilizando un escáner de documentos de base plana. Este procedimiento es un método rápido y sencillo para monitorear la dinámica de enjambre y puede adaptarse para estudiar la motilidad y el crecimiento de otras especies bacterianas.

Imágenes de lapso de tiempo de enjambres bacterianos y la respuesta colectiva al estrés

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Este protocolo se puede utilizar para producir películas de lapso de tiempo de Pseudomonas aeruginosa enjambre y para capturar la repulsión de enjambre por bacteriófagos o antibióticos. Las películas de lapso de tiempo capturan la dinámica detallada de la respuesta enjambre a los antibióticos y los bacteriófagos y la técnica solo requiere un deshumidificador, computadora, incubadora y escáner de documentos. Para preparar placas de agar enjambre para imágenes de lapso de tiempo enjambre de P.aeruginosa, utilice una pipeta de 25 mililitros para agregar 20 mililitros de solución de agar enjambre a cada plato experimental de Petri de 10 centímetros de diámetro.Coloque las placas en una sola pila con tapas durante una hora a temperatura ambiente. Encienda un deshumidificador para disminuir la humedad relativa de la habitación a 40-50%Cuando el agar se haya solidificado, seque las placas de agar enjambre durante 30 minutos adicionales en una capucha de flujo laminar con las tapas apagadas y boca arriba a 300 pies cúbicos por minuto con una humedad relativa del 40-50% a temperatura ambiente. A continuación, guarde las placas de agar enjambre secas a cuatro grados centígrados durante un máximo de 24 horas.Para enjambre de agar, sostenga una punta de pipeta P20 cargada con cinco microlitros de un cultivo de P.aeruginosa durante la noche en un ángulo de 10-45 grados 2-1/2 centímetros por encima del centro de una placa enjambre y presione el émbolo hasta el primer punto de tocar el agar con sólo la gota de líquido. Utilice una plantilla para colocar el punto de forma consistente en las diferentes placas de agar enjambre. Para placar una infección de fago, primero mezcle 30 microlitros de P.aeruginosa cultivada durante la noche con seis microlitros de una por 10 a las 12 unidades formadoras de placas por mililitro de fago DMS3 vir e inmediatamente agregue seis microlitros de la mezcla de faje P.aeruginosa en seis posiciones de satélite equidistantes en un círculo concéntrico de radio de 2,8 centímetros como se demuestra.Utilice una plantilla para colocar el punto de forma consistente en diferentes placas de agar enjambre. Para plato de tratamientos antibiótico, mezclar 30 microlitros de P.aeruginosa cultivado durante la noche con la concentración y el volumen apropiados del antibiótico de interés e inmediatamente añadir seis microlitros de las bacterias tratadas con antibióticos en seis posiciones de satélite equidistantes en un círculo concéntrico de radio de 2,8 centímetros sobre el centro de la placa. Utilice una plantilla para colocar el punto de forma consistente en las diferentes placas de agar enjambre.Cuando todos los cultivos hayan sido chapados, sustituya las tapas transparentes del plato Petri por tapas negras hechas a medida. Coloque cuidadosamente las placas de agar enjambre en un escáner en una incubadora situada en 37 grados Celsius con un baño de agua de 10 litros para mantener la humedad en 75%Después de colocar las placas en el escáner, abra el archivo y guarde los ajustes para establecer la ruta de guardado para las imágenes y haga clic en escanear y OK a intervalos de 30 minutos. Para automatizar la adquisición de imágenes, utilice el software de scripting.Seleccione el análisis inactivo y el análisis único y haga clic con el botón derecho en el análisis inactivo y, a continuación, haga clic con el botón izquierdo del 200 al 200 al 200 del hotel. Al final de la incubación, importe todas las imágenes escaneadas en ImageJ. En la ventana de opciones de secuencia, el número de imágenes indicará el número de imágenes seleccionadas.Siga iniciando la imagen en una para comenzar desde la primera imagen de la carpeta y las imágenes de escala al 100% para conservar el tamaño original de las imágenes. Haga clic en encubierto a RGB para mantener las imágenes en color. Deje la opción Usar pila virtual desactivada y haga clic en Aceptar para cargar las imágenes.Haga clic en archivo, guardar como y AVI para fusionar las imágenes en un archivo AVI. Ajuste la compresión a JPEG y la velocidad de fotogramas a cinco fotogramas por segundo. A continuación, guarde el lapso de tiempo AVI en la carpeta de almacenamiento adecuada.Las imágenes de lapso de tiempo de una sola colonia de P.aeruginosa de tipo salvaje a partir de una placa de agar LB en caldo LB durante la noche a 37 grados centígrados y manchadas en el centro de una placa de agar enjambre revela un crecimiento inicial en forma de colonia en el centro de la placa que se extiende en los zarcillos radialmente desde la colonia. Los enjambres se mueven desde el centro de las placas de agar enjambre a la periferia y son repelidos por una señal de estrés emitida por las bacterias que fueron infectadas con fagos o tratadas con Gentamicina. Los fagos o gentamicina detectados solos en las posiciones de los satélites no hacen que las poblaciones enjambres eviten estas áreas.Utilice una pipeta de 25 mililitros para asegurarse de que las placas de agar enjambre contienen exactamente 20 mililitros. También es importante ajustar el tiempo de secado de la placa de acuerdo con el entorno de laboratorio. Nuestra técnica nos permite visualizar los patrones generales de enjambre de las poblaciones de Pseudomonas aeruginosa.El siguiente objetivo es monitorear la motilidad celular individual usando la microscopía Brightfield.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Registro del comportamiento multicelular en Myxococcus xanthus Las biopelículas con Time-lapse Microcinematography

Fuente: Bru, J., et al., Imágenes de lapso de tiempo de enjambres bacterianos y la respuesta colectiva al estrés. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra el procedimiento para analizar el comportamiento de enjambre de Pseudomonas aeruginosa mediante la observación del crecimiento bacteriano desde un cultivo central hacia puntos satélite que contienen el mismo cultivo mezclado con un antibiótico, utilizando una configuración de placa de agar e imágenes de lapso de tiempo.

Comportamiento de enjambre de Pseudomonas aeruginosa bajo estrés antibiótico

Fuente: Bru, J., et.al. Imágenes de lapso de tiempo de enjambres bacterianos y la respuesta colectiva al estrés. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra cómo visualizar y medir el comportamiento de evitación de enjambres en Pseudomonas aeruginosa utilizando un ensayo de placa de agar de enjambre. Muestra la configuración para imágenes de lapso de tiempo en condiciones controladas y explica cómo las señales de estrés inducidas por antibióticos redirigen el movimiento bacteriano, que se...

Obtención de imágenes y cuantificación de las respuestas de evitación de enjambres al estrés antibiótico en Pseudomonas aeruginosa

Fuente: Morales-Soto, N. et. al., Preparación, obtención de imágenes y cuantificación de ensayos de motilidad de la superficie bacteriana. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra un ensayo de enjambre utilizando bacterias que expresan proteína verde fluorescente para observar la motilidad de la superficie en agar blando. Las imágenes de lapso de tiempo capturan la expansión coordinada y la formación de zarcillos, destacando la motilidad de la superficie bacteriana.

Ensayo de enjambre para visualizar la motilidad de la superficie bacteriana

Fuente: Cayron, J., et al. Análisis multiescala de tratamientos de crecimiento bacteriano bajo estrés. J. Vis. Exp. (2019).Este video demuestra cómo preparar y usar una placa microfluídica para obtener imágenes de células bacterianas en condiciones de estrés. Describe el proceso de introducción de un cultivo bacteriano y un medio antibiótico que induce estrés, seguido de la carga celular y la configuración microscópica. A continuación, se utilizan imágenes de lapso de tiempo en modo de...

Análisis microscópico del crecimiento bacteriano bajo estrés utilizando cámaras microfluídicas

Fuente: Guo, S., et al. Cuantificación de la motilidad del enjambre de la superficie bacteriana en placas de gradiente inductor. J. Vis. Exp. (2022).Este video demuestra el uso de una placa de enjambre de gradiente de doble capa para estudiar el comportamiento del enjambre bacteriano bajo concentraciones variables de inhibidores. Una placa con un inhibidor formador de gradiente en la capa inferior se inocula con bacterias y se incuba. Las imágenes se capturan a intervalos regulares para...

Evaluación del enjambre bacteriano mediante una placa inhibidora de gradiente

ScanLag es un método de alto rendimiento para medir el retraso en el crecimiento, es decir, el tiempo de retraso, así como la tasa de crecimiento de las colonias para miles de células en paralelo. El cribado con ScanLag permite discriminar entre un retraso prolongado y un crecimiento lento a nivel de una sola variante.

ScanLag: De Alto Rendimiento La cuantificación del crecimiento de las colonias y Lag Tiempo

Este protocolo permite una descripción del crecimiento bacteriano en condiciones de estrés en los niveles de población de una sola célula y célula.

Análisis multiescala del crecimiento bacteriano bajo tratamientos de estrés

Los fenotipos de crecimiento de levadura se miden con precisión a través de imágenes de lapso de tiempo altamente paralelas de células inmovilizadas que crecen en microcolonías. Simultáneamente, se puede monitorear la tolerancia al estrés, la expresión proteica y la localización de proteínas, generando conjuntos de datos integrados para estudiar cómo las diferencias ambientales y genéticas, así como la heterogeneidad de la expresión génica entre las células isogénicas, modulan el crecimiento.

Imágenes en vivo de alto rendimiento de microcolonias para medir la heterogeneidad en crecimiento y expresión génica

En este manuscrito, proporcionamos un protocolo completo para evaluar la supervivencia antibiótica de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus, transformando plásmidos en P. aeruginosa y S. aureus para crear cepas reporteras y visualizar variantes fenotípicas, como persistentes, mediante microscopía de epifluorescencia de lapso de tiempo.

Imágenes de microscopía de epifluorescencia de lapso de tiempo de fenotipos heterogéneos de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus

Aprende a generar películas de lapso de tiempo de enjambres de Pseudomonas aeruginosa y su respuesta repulsiva ante bacteriófagos y antibióticos. Este método simple utiliza un escáner de documentos para visualizar dinámicas de enjambre en tiempo real.

Imágenes de lapso de tiempo de enjambres bacterianos y la respuesta colectiva al estrés

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