Name: Microdisección de captura láser de las subregiones de Glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, los oncostreams y la invasión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprende microdisección láser de gliomas para analizar la heterogeneidad intratumoral mediante secuenciación de ARN. Este método optimizado preserva la morfología tisular y la integridad del ARN, permitiendo identificar vías moleculares y dianas terapéuticas potenciales.

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El trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud, (NIH/NINDS) Subvenciones: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 a M.G.C.; (NIH/NINDS) Subvenciones R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 a P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; el Departamento de Neurocirugía, Rogel Cancer Center en la Universidad de Michigan, ChadTough Foundation, y Leah's Happy Hearts Foundation to M.G.C. and P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 to M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 for Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) Proyecto F049768 a A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, un Premio Médico-Científico de Investigación para Prevenir la Ceguera, Inc. (RPB), otorga R01 EY022633 de la NEI del NIH (AK), y una subvención sin restricciones de RPB al Departamento de Oftalmología y Ciencias Visuales. Esta investigación utilizó el Núcleo de Investigación de la Visión (P30 EY007003), y el Núcleo de Investigación del Centro de Cáncer (P30 CA046592). AK cuenta con el apoyo del Premio De Académico Emergente Mrs. William Davidson del Instituto de Investigación Médica A. Alfred Taubman.

<ol><li>Reifenberger, G., Wirsching, H. G., Knobbe-Thomsen, C. B., Weller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+molecular+genetics+of+gliomas+-+implications+for+classification+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Advances in the molecular genetics of gliomas - implications for classification and therapy.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 434-452 (2017).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li>
<li>Rabien, A., Kristiansen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1381, 39-52 (2016).</li>
<li>Lovatt, D., Bell, T., Eberwine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+isolation+for+RNA+analysis+using+pipette+capture+and+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-neuron isolation for RNA analysis using pipette capture and laser capture microdissection.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (1), (2015).</li>
<li>Erickson, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+RT-PCR+gene+expression+analysis+of+laser+microdissected+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples.</a> Nature Protocols. 4 (6), 902-922 (2009).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+microdissection+in+translational+research%3A+theory%2C+technical+considerations%2C+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+%26+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted microdissection in translational research: theory, technical considerations, and future applications.</a> Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).</li>
<li>Butler, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+high-quality+RNA+from+laser+capture+microdissected+human+and+rodent+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and rodent pancreas.</a> Journal of Histotechnology. 39 (2), 59-65 (2016).</li>
<li>Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+RNA+during+laser+capture+microdissection+by+performing+experiments+under+argon+atmosphere+or+using+ethanol+as+a+solvent+in+staining+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions.</a> RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).</li>
<li>van Dijk, M. C., Rombout, P. D., Dijkman, H. B., Ruiter, D. J., Bernsen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+resolution+by+mounting+of+tissue+sections+for+laser+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Improved resolution by mounting of tissue sections for laser microdissection.</a> Molecular Pathology. 56 (4), 240-243 (2003).</li>
<li>Núñez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDH1-R132H+acts+as+a+tumor+suppressor+in+glioma+via+epigenetic+up-regulation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">IDH1-R132H acts as a tumor suppressor in glioma via epigenetic up-regulation of the DNA damage response.</a> Science Translational Medicine. 11 (479), (2019).</li>
<li>Calinescu, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mediated+integration+of+plasmid+DNA+into+the+subventricular+zone+of+neonatal+mice+to+generate+novel+models+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Koschmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATRX+loss+promotes+tumor+growth+and+impairs+nonhomologous+end+joining+DNA+repair+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma.</a> Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).</li>
<li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive%2C+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li>
<li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+Big+data+from+small+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: Big data from small samples.</a> Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).</li>
<li>Lein, E., Borm, L. E., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+spatial+transcriptomics+for+neuroscience+in+the+era+of+molecular+cell+typing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing.</a> Science. 358 (6359), 64-69 (2017).</li>
<li>Gagner, J. P., Zagzag, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Glioblastoma+Tissue+Heterogeneity+with+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing Glioblastoma Tissue Heterogeneity with Laser Capture Microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 1741, 209-220 (2018).</li>
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Todos los autores de este artículo no declaran posibles conflictos de intereses.

Comprender los mecanismos moleculares subyacentes a la heterogeneidad e invasión del glioma es de vital importancia para descubrir nuevas dianas terapéuticas13. En este manuscrito, describimos un método detallado y optimizado para analizar el paisaje molecular de la heterogeneidad e invasión del glioma utilizando microdisección de captura láser (LMD) seguida de análisis transcriptomico.
La microdisección de captura láser (LMD) se puede utilizar para identificar diferent...

Los gliomas son los tumores primarios más agresivos del sistema nervioso central. Son altamente invasivos y heterogéneos1. El análisis de los componentes celulares y moleculares del tumor revelará nuevas dianas terapéuticas.
Entre los diferentes métodos disponibles actualmente, la microdisección de captura láser (LMD) del tejido tumoral cerebral congelado es una técnica rentable y fiable que permite el aislamiento de áreas anatómicas discretas o poblaciones celulares específicas de los tejidos tumorales para estudiar su perfil molecular2,,3. LMD permite el análisis de perfiles de expresión génica mRNA de células individuales seleccionadas o estructuras multicelulares4,5. LmD se puede utilizar para obtener un conocimiento mecánico en profundidad sobre los eventos moleculares que tienen lugar durante la progresión del tumor. La mejora en el procesamiento de los tejidos tumorales es necesaria para obtener una resolución óptica óptima de la morfología tisular y la calidad del ARN6. Aunque la fijación de paraformaldehído es la mejor opción para el análisis morfológico, la calidad del ARN se ve afectada y degradada en estas condiciones, lo que resulta en una mala calidad del ARN para el análisis de ARN-seq. El uso de secciones de tejido congelado evita la formación de cristales de hielo, que podrían romper las membranas celulares y producir agujeros dentro de las células, y sigue siendo la mejor opción para el análisis de ARN-Seq7.
Aquí, describimos un método optimizado de fijación y tinción de sección para procesar tejidos tumorales cerebrales de ratón congelados para LMD. Para evitar que se formen cristales de hielo en el tejido, perfundimos ratones con una solución de 30% de sacarosa. Esta solución interrumpe las interacciones entre las moléculas de agua polar y evita la formación de cristales de hielo, preservando la morfología del tejido. La tinción de tejido es necesaria para diferenciar y obtener población específica de células o áreas anatómicamente distintas dentro del tumor. Es esencial fijar y manchar el tejido con colorantes inocuos para mantener la integridad del ARN. Se ha demostrado previamente que la tinción de tejido con hematoxilina/eosina (H&E) deteriora la integridad del ARN8. Fijamos y tiñimos el tejido de interés con etanol, Cresyl violeta 4% y eosina Y 0.5% soluciones. Cresyl violeta es un tinte acidofílico que tiñe el núcleo celular con un color azul oscuro. EosinY es un tinte basófilo que tiñe los componentes básicos de las células, proporcionando una distinción entre el citoplasma y otras estructuras celulares8. Ambos tintes son solubles en etanol y no deterioran la calidad del ARN. Para evitar daños tisulares y mantener una alta resolución óptica de las estructuras celulares, montamos las secciones de tejido antes de LMD9.

<table><tbody><tr><td>Accutase Solución de Desprendimiento de Células Biolegend</td><td></td><td>423201</td><td></td></tr><tr><td>EGF humano recombinante sin animales</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50X), sin suero</td><td>Gibco</td><td></td> 17504044 <td></td></tr><tr><td>Tampón RLT Qiagen</td><td></td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Corning Tubos de PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS6530</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Acetato Violeta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mezcla de nutrientes F-12</td><td>Gibco</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Eosin y</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Microdisección Láser (LMD)</td><td>Leica</td><td>LMD7000</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplemento (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Normocin - Reactivo antimicrobiano</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de inclusión desechables despegables Electrónica</td><td>Microscopy Sciences</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>PEN Portaobjetos de vidrio de membrana (2 &micro; m)</td><td>Lieca</td><td>1150518</td><td></td></tr><tr><td>Solución Puntual</td><td>Zymo Research</td><td>D3001-1</td><td></td></tr><tr><td>FGF humano recombinante-básico</td><td>Peprotech</td><td>100-18B-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Criostato de investigación</td><td>Leica</td><td>CM3050s</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Solución de descontaminación de ARNasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer Kit de secuenciación de ARN total trenzado v2 - Pico Input Mammalian Takara</td><td>Bio</td><td>634411</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr></tbody></table>

microdisección de captura láser de las subregiones de glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, los oncostreams y la invasión

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Los gliomas son tumores cerebrales primarios caracterizados por su invasividad y heterogeneidad. Patrones histológicos específicos como pseudopalisades, proliferación microvascular, transformación mesenquimal y necrosis caracterizan la heterogeneidad histológica de los gliomas de alto grado. Nuestro laboratorio ha demostrado que la presencia de altas densidades de células mesenquimales, llamadas oncostreams, se correlacionan con la neoplasia tumoral. Hemos desarrollado un enfoque único para entender los mecanismos que subyacen al crecimiento y la invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo integral que utiliza microdisección de captura láser (LMD) y secuenciación de ARN para analizar la expresión diferencial de ARNm de estructuras multicelulares heterogéneas intratumorales (es decir, áreas mesenquimales o áreas de invasión tumoral). Este método mantiene una buena histología tisular y la integridad del ARN. La perfusión, la congelación, la incrustación, la seccionamiento y la tinción se optimizaron para preservar la morfología y obtener muestras de microdisección láser de alta calidad. Los resultados indican que la perfusión de ratones portadores de glioma utilizando 30% de sacarosa proporciona una buena morfología y calidad de ARN. Además, la tinción de secciones tumorales con un 4% de cresyl violeta y 0,5% de eosina da como resultado una buena tinción nuclear y celular, preservando al mismo tiempo la integridad del ARN. El método descrito es sensible y altamente reproducible y se puede utilizar para estudiar la morfología tumoral en varios modelos tumorales. En resumen, describimos un método completo para realizar LMD que preserva la morfología y la calidad del ARN para la secuenciación para estudiar las características moleculares de las estructuras multicelulares heterogéneas dentro de tumores sólidos.

Nuestro laboratorio ha generado modelos de ratón genéticamente diseñados (GEMM) utilizando el sistema de transposasa de belleza durmiente(Figura 1A). Este sistema incorpora alteraciones genéticas específicas en el genoma de las células progenitoras neuronales en ratones neonatales. Estas células progenitoras alteradas forman tumores glioma endógenos. Las secuencias de plásmidos utilizadas para generar los tumores fueron: (1) pT2C-LucPGK-SB100...

La microdisección láser (LMD) es una técnica sensible y altamente reproducible que se puede utilizar para descubrir vías que median la heterogeneidad e invasión del glioma. Aquí, describimos un protocolo optimizado para aislar áreas discretas del tejido glioma usando LMD láser seguido de análisis transcriptomático.

Microdisección de captura láser de las subregiones de Glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, los oncostreams y la invasión

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Este protocolo utiliza la microdisección láser y la secuenciación de ARN para analizar la expresión diferencial de ARNm de la heterogeneidad intratumoral, como áreas de acumulación de células mesenquimales o áreas de invasión tumoral. Este método se ha optimizado para preservar la histología tisular de buena calidad y la integridad del ARN para facilitar la adquisición de muestras de microdisección láser de alta calidad. Este método es sensible y altamente reproducible.Se puede utilizar para estudiar la morfología tumoral y la heterogeneidad en varios modelos tumorales. La microdisección láser del tejido tumoral cerebral congelado es una técnica rentable y confiable para el aislamiento de áreas anatómicas discretas de las poblaciones celulares de los tejidos tumorales para estudiar sus perfiles moleculares. LMD se puede utilizar para obtener un conocimiento mecánico profundo sobre los eventos moleculares que tienen lugar durante la progresión tumoral, y podría revelar nuevas dianas terapéuticas.Una bioluminiscencia in vivo de la carga tumoral del ratón alcanza una señal entre una por 10 y una por 10 a la 7a fotones. Enjuague la solución de tiradró oxigenado a través del sistema circulatorio del ratón con tumor eutanizado hasta que el hígado y los pulmones hayan sido completamente despejados de sangre. Continúe perfundiendo al animal con una solución de sacarosa al 30% disuelta en solución de tiranos durante 15 minutos adicionales.Para evaluar el éxito de la perfusión, confirme que el cuello, la cola y las patas son rígidos al final de la circulación. Luego cosecha el cerebro de acuerdo con los protocolos estándar y almacenar el cerebro durante la noche en solución fresca de 30%sacarosa. Para preparar la criopreservación, llene un frasco con isopentano frío-2-metilbutano y coloque el frasco en un recipiente lleno de nitrógeno líquido.Mientras el disolvente se enfría, seque el cerebro en un pedazo de papel de filtro y coloque el cerebro en una Cryomold etiquetada. Cuidadosamente a unos cinco mililitros de medio de corte de temperatura óptimo al centro de la Cryomold y coloque el cerebro en el molde en la orientación deseada. Usando fórceps limpios, coloque rápidamente el Cryomold en el isopentano refrigerado-2-metilbutano durante 30 a 40 segundos.Una vez que el medio de corte se haya solidificado, transfiera el Cryomold al hielo seco y envuelva el tejido cerebral Cryomold y a presión en papel de aluminio para un almacenamiento de menos 80 grados Centígrados. Para adquirir secciones de tejido tumoral cerebral congelado, primero establezca la temperatura de un criostato entre menos 20 y menos 24 grados Celsius, y coloque el bloque de muestra en la cámara de criostato durante 30 a 60 minutos. Mientras la muestra se está equilibrando, limpie la cámara y el portacuchillas con 100% de etanol y rocíe los cepillos de sección con la solución de limpieza RNase.Cuando la muestra esté lista, retire el molde y utilice un medio de corte fresco para unir el bloque de tejido congelado al disco de muestra del criostato. Coloque el bloque en el soporte del disco y alinee el bloque con la cuchilla. Adquiera secciones de 10 micrómetros del cerebro usando uno de los cepillos libres de arnés para aplanar cuidadosamente y desenroscer las piezas de tejido en la superficie de corte.Para montar las secciones del tejido cerebral en las diapositivas, presione suavemente el lado cargado positivamente de una diapositiva de vidrio PEN sin RNase etiquetada sobre la sección y coloque la diapositiva en una caja de almacenamiento dentro de la cámara. Cuando se hayan recogido todas las diapositivas, coloque la caja de almacenamiento a menos 80 grados centígrados. Para disolver el medio de corte antes de la microseección láser, sumerja los portaobjetos en inmersiones secuenciales de etanol descendente de 30 segundos seguidas de tinción de solución violeta cristalina durante 20 segundos y cinco segundos en una solución de 0,5% de eosina Y.Al final de la incubación de eosin Y, utilice papel de filtro para bloquear los portaobjetos en seco y deshidratar los portaobjetos en inmersiones secuenciales ascendentes de etanol. Después de la inmersión en etanol de 60 segundos, enjuague los portaobjetos en un recipiente de xileno durante tres minutos. A continuación, seque los portaobjetos en la superficie libre de RNase a temperatura ambiente durante 10 segundos antes de montar las muestras en un medio de montaje preparado con agua libre de RNase.Después de 10 a 20 segundos, transfiera las diapositivas a la plataforma de microdisección del microscopio. Para la microdisección de captura láser, encienda la alimentación antes de encender el láser. A continuación, encienda el controlador del microscopio en el ordenador e inicie el software de microdisección de captura láser.En el panel Control del microscopio, seleccione la ampliación 10 veces. En Control láser, establezca los parámetros del láser para la disección de tejidos y seleccione una frecuencia láser de 120 hercios y una corriente láser del 100% Para una microdisección láser precisa, establezca la velocidad en 10 y ajuste la apertura a 10 micrómetros. A continuación, ajuste la alimentación a 53.Cargue el colector de tejido que capturará el tejido después de la sección y haga clic en el segundo botón Descargar. Sustituya el colector vacío por tubos de cabeza plana PCR de 0,5 mililitros libres de DNase y Rnase que contengan 30 microlitros de tampón de lelisis por tubo. Devuelva el colector a la máquina y haga clic en continuar para continuar.Cargue la muestra procesada en el microscopio y haga clic en Descargar en el software de microdisección láser. Suba la muestra sobre el portaobjetos y coloque el portaobjetos en el escenario. Haga clic en Continuar para continuar y seleccione Dibujar corte en la ventana Formas de corte.Utilice los controles del microscopio para encontrar el área de interés y dibujar un esquema alrededor de la región de interés. A continuación, seleccione un tubo colector de destino y haga clic en Iniciar corte para continuar con la microdisección de tejido. Cuando todas las áreas de interés hayan sido diseccionadas, transfiera los tubos colectores del soporte al hielo seco hasta que estén en el procesamiento aguas abajo.Para adquirir tejidos con una morfología superior e integridad del ARN, se evaluaron varios enfoques de perfusión. Para diseccionar las áreas de interés, es necesario manchar los tejidos con tintes inocuos para el ARN. La posterior perfusión de ratones portadores de tumores con solución de tirante y 30%sacarosa seguida de una incubación durante la noche en 30%sacarosa da como resultado la preservación de la morfología y la integridad del ARN del tejido del ratón.Aunque la fijación del tejido de paraformaldehído da como resultado una morfología tisular de alta calidad, la integridad del ARN se ve afectada negativamente. Otros enfoques como el uso de una incubación de la solución tyrode, o la solución de tyrode más 30%incubación de la solución de sacarosa no afectan la calidad del ARN, pero se observa una resolución reducida en la morfología tisular. Si los tejidos no se montan con medio de montaje, las secciones se deshidratan y la morfología se deteriora mientras que el montaje de las muestras de tejido con un 15% de montaje medio disuelto en agua mantiene una morfología tisular de alta calidad.Las imágenes del microscopio de microdisección de captura láser permiten la selección del tejido tumoral para la disección. Esta región de selección de interés permite entonces la disección de áreas de interés dentro de cada muestra de tejido para el análisis de integridad del ARN. Mantener una morfología del tejido tumoral de alta calidad y la integridad del ARN es fundamental.La solución de Tyrode y la perfusión de sacarosa al 30% con conservación durante la noche en 30% de sacarosa mejoran significativamente la morfología tisular para la LMD. La fijación rápida del lyoma, la tinción y el montaje con la solución GAN son pasos críticos para preservar la calidad del ARN y evitar que se formen grietas dentro del tejido. Recomendamos secciones de al menos 2,5 veces 10 a los micrómetros cuadrados totales del tumor por área tisular para obtener cantidades adecuadas de ARN para el control de calidad del ARN y el análisis transcriptómico.LMD permite el análisis de las vías de señalización molecular que regulan la heterogeneidad y la invasión del glioma, lo que podría revelar nuevos objetivos potenciales para el desarrollo traslacional futuro en modelos de glioma preclínico.

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Las características moleculares de las células láser microdissected y estroma de, modelos de cáncer colorrectal ingeniería de tejidos sintéticos representa un enfoque novedoso y manipulable para caracterizar y diseccionar la biología distintiva en la interfaz entre las células tumorales en el cáncer de células del estroma asociado frente invasivo y.

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Los modelos ex vivo actuales de glioblastoma (GBM) no están optimizados para el estudio fisiológicamente relevante de la invasión tumoral humana. Aquí, presentamos un protocolo para la generación y mantenimiento de cultivos de corte organotípico de tejido humano GBM fresco. Se proporciona una descripción de microscopía de lapso de tiempo y técnicas de análisis de migración celular cuantitativa.

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Inmunohistoquímica Cuantitativa del Microambiente Celular en Resecciones de Glioblastoma Paciente

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Caracterización de los efectos de los inhibidores migratorios en la invasión de esferoides de tumores 3D por microscopía confocal de alta resolución

La desregulación proteómica juega un papel importante en la propagación de gliomas infiltrantes difusos, pero varias proteínas relevantes permanecen sin identificar. El procesamiento espacial digital (DSP) ofrece un enfoque eficiente y de alto rendimiento para caracterizar la expresión diferencial de proteínas candidatas que pueden contribuir a la invasión y migración de gliomas infiltrativos.

Perfil espacial digital para la caracterización del microambiente en glioma infiltrante difuso de tipo adulto

Informamos una técnica que permite obtener imágenes en vivo de la dinámica de los microtúbulos en células de glioblastoma (GBM) que invaden el tejido cerebral de un vertebrado. El acoplamiento de la inyección ortotópica de células GBM marcadas con fluorescencia en un cerebro transparente de pez cebra con imágenes intravitales de alta resolución permite la medición de la dinámica del citoesqueleto durante la invasión del cáncer in situ .

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La microdisección por captura láser de tejidos de fibrosis submucosa oral permite la extracción precisa de células de regiones histológicas de interés para el análisis de datos multiómicos con información morfológica y espacial.

Aislamiento de Células con Información Morfológica y Espacial a partir de Muestras de Fibrosis Submucosa Oral mediante Microdisección por Captura Láser

Presentamos un modelo de migración de glioblastoma 3D utilizando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes generadas a partir de tumores recién diagnosticados y recurrentes. Esta plataforma permite visualizar la dinámica migratoria específica del paciente y evaluar la eficacia terapéutica. El ensayo puede multiplexarse tras la migración para evaluar la localización y los patrones de expresión de proteínas.

Ensayo reproducible de migración de glioblastoma 3D con localización esferoide mediada por nanopartículas magnéticas bajo condiciones hipóxicas

Aprende microdisección láser de gliomas para analizar la heterogeneidad intratumoral mediante secuenciación de ARN. Este método optimizado preserva la morfología tisular y la integridad del ARN, permitiendo identificar vías moleculares y dianas terapéuticas potenciales.

Microdisección de captura láser de las subregiones de Glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, los oncostreams y la invasión (Video) | JoVE Journal

Microdisección de captura láser de las subregiones de Glioma para la caracterización espacial y molecular de la heterogeneidad intratumoral, los oncostreams y la invasión

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