Name: Uso de una biopsia química para la evaluación de la calidad del injerto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min
Description: Aprenda a evaluar la calidad de injertos renales mediante biopsia química con sondas SPME. Este protocolo utiliza análisis metabolómicos y lipidómicos por LCMS para monitoreo poco invasivo.

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El estudio fue apoyado por la concesión Opus UMO-2017/27/B/NZ5/01013 del Centro Nacional de Ciencias. Los autores desean reconocer a MilliporeSigma, una empresa de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania, por proporcionar dispositivos SPME. El negocio de ciencias de la vida de Merck opera como MilliporeSigma en los Estados Unidos y Canadá. Además, los autores quieren agradecer a Thermo Fisher Scientific por el acceso al espectrómetro de masas orbitrap Q-Exactive Focus. Los autores desean dar las gracias a la Dra. Aleksandra Woderska-Jasi-ska y al personal del Departamento de Trasplantes y Cirugía General de Bydgoszcz por su amable asistencia en el proyecto. BB quiere agradecer al profesor Janusz Pawliszyn por la oportunidad de la recolección de muestras en el Hospital General de Toronto durante su estancia en la Universidad de Waterloo.

Todos los animales recibieron atención humana de conformidad con los "Principios de Cuidado Animal de Laboratorio" formulados por la Sociedad Nacional de Investigación Médica y la "Guía para el Cuidado de Animales de Laboratorio" publicada por el Instituto Nacional de Salud de Ontario, Canadá. El Comité de Cuidado Animal del Instituto General de Investigación de Toronto aprobó todos los estudios. La investigación involucraba a sujetos humanos fue aprobada por el Comité Bioético en Collegium Medicum en la Universidad Bydgoszcz Nicolaus Copernicus en Torun.
NOTA: Obtenga la aprobación de las juntas éticas apropiadas. Recuerde usar siempre guantes de seguridad. No toque la fase de extracción de las sondas SPME. Se recomienda el uso de viales de vidrio desactivado para análisis lipidómicos.
1. Preparación de sondas
<ol><li>Preparar sondas de aleación de titanio-níquel (40 mm de longitud; 0,2 mm de diámetro) recubiertas con sorbente de modo de mezcla de 7 mm. El número de sondeos depende de los puntos de tiempo dirigidos durante todo el procedimiento y del número de réplicas (se recomienda 3 por punto de tiempo). NOTA: La longitud y el tipo de fase de extracción pueden ajustarse en función del modo de estudio, la polaridad de los metabolitos y la matriz de muestras.</li>
	<li>Preparar una mezcla de limpieza compuesta de 2:1 cloroformo:metanol (v/v). Pipet 1.0 mL de la solución a cada vial de vidrio de 2,0 ml y colocar una sonda, previamente perforada a través de la tapa, en cada vial. NOTA: Antes de su uso, limpie todas las sondas para eliminar las partículas contaminantes.</li>
	<li>Coloque los viales en el agitador y ajuste la velocidad de agitación a 1.200 rpm. Después de 45 minutos, detenga el dispositivo y enjuague los recubrimientos con agua de grado LC-MS.</li>
	<li>Como los recubrimientos deben someterse a un paso de preacondicionamiento para activarlos, prepare una mezcla de preacondicionamiento compuesta de metanol 1:1: agua (v/v). Pipet 1.0 mL de la solución a cada vial de vidrio de 2,0 ml y colocar una sonda, previamente perforada a través de la tapa, en cada vial.</li>
	<li>Coloque los viales en el agitador de vórtice y ajuste la velocidad de agitación a 1.200 rpm.</li>
	<li>Después de 60 min, detenga el agitador y enjuague los recubrimientos con agua de grado LC-MS.</li>
	<li>Esterilice las sondas de acuerdo con el protocolo de esterilización estándar del equipo quirúrgico.</li>
</ol>2. Extracción
<ol><li>Abra el paquete estéril justo antes del muestreo para garantizar un entorno estéril.</li>
	<li>Inserte dos sondas directamente en la corteza renal durante 10 minutos en cada punto de tiempo. Toda la longitud del recubrimiento debe estar cubierta por la matriz tisular; no se requiere ningún ángulo específico, pero se suele utilizar aproximadamente 90 grados. NOTA: Todo el procedimiento médico sigue los protocolos estándar en una institución determinada. No se considera ninguna modificación relativa al muestreo SPME. El procedimiento implica los seis puntos de tiempo de muestreo siguientes: a) antes de la resección renal, in vivo del donante; b)-e) después de 1 h, 3 h, 5 h, 7 h de perfusión renal, ex vivo en la cámara de órganos; f) después de la reperfusión, in vivo del destinatario.</li>
	<li>Retirar las sondas sacándola del tejido y luego enjuague los recubrimientos con agua de grado LC-MS para eliminar cualquier sangre restante de la superficie de recubrimiento. Enjuague lejos del sitio quirúrgico, e inmediatamente después de la extracción de las sondas.</li>
</ol>3. Transporte y almacenamiento
<ol><li>Coloque las sondas en viales separados y ciérrelas.</li>
	<li>Coloque los viales en una caja de espuma de poliestireno llena de hielo seco o en nitrógeno líquido para su transporte.</li>
	<li>Almacene las muestras en un congelador (-80 oC) o comience inmediatamente el paso de desorción.</li>
</ol>4. Desorción
<ol><li>Preparar soluciones de desorción compuestas de 80:20 acetonitrilo:agua (v/v) para análisis metabolómico, e 1:1 isopropanol:metanol (v/v) para el análisis lipidomico.</li>
	<li>Pipet 100 l de la solución a las plaquitas colocadas en viales etiquetados de 2,0 ml y colocar una sonda, previamente perforada a través de la tapa, en cada vial.</li>
	<li>Coloque los viales en el agitador de vórtice y ajuste la velocidad de agitación a 1.200 rpm durante 120 min.</li>
	<li>Retire las sondas de los viales. Los extractos obtenidos ya están listos para el análisis instrumental.</li>
</ol>5. Análisis LC-MS
<ol><li>Coloque los viales que contengan extractos en el muestreador automático del sistema LC-MS. NOTA: Para este estudio se utilizó una cromatografía líquida (RP, HILIC) junto con espectrometría de masas de alta resolución y un analizador de masa orbitrap. Para los parámetros de análisis metabolómico, vaya al paso 5.2. Para los parámetros de análisis lipidémico, vaya al paso 5.6.</li>
	<li>Utilice una columna de pentafluorofenilo (PFP) (2,1 mm x 100 mm, 3 m) para la separación de fase invertida.<ol>
<li>Establezca el caudal en 300 l/min, y las temperaturas del muestreador automático y de columna en 4 oC y 25 oC, respectivamente.</li>
		<li>Preparar las fases móviles de acuerdo con las siguientes proporciones: fase móvil A: agua: ácido fórmico (99.9:0.1, v/v), y fase móvil B: acetonitrilo:ácido fórmico (99.9:0.1, v/v). Establezca el flujo de fase móvil de acuerdo con los siguientes parámetros: flujo de fase móvil inicial (0-3 min): 100% A seguido de un gradiente lineal a 10% A (3-25 min), terminando con flujo isocrático de 10% A hasta 34 min, seguido de 6 minutos de tiempo de reejectividad de columna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para la separación HILIC, utilice una columna HILIC (2,0 mm x 100 mm, 3 m, 200A). Establezca el caudal en 400 l/min.<ol>
<li>Preparar las fases móviles según las siguientes proporciones: fase móvil A: acetonitrilo: tampón de acetato de amonio (9:1, v/v, concentración efectiva de sal 20 mM), fase móvil B: acetonitrilo: tampón de acetato de amonio (1:1, v/v, concentración efectiva de sal 20 mM).</li>
		<li>Ajuste el flujo de fase móvil de acuerdo con los siguientes parámetros: iniciar el flujo de fase móvil (0-3 min) en 100% A, mantener durante 3,0 minutos y luego rampa a 100% B dentro de 5 min. Mantenga pulsado con 100% B hasta 12 min, seguido de 8 min de tiempo de ree equilibrio de columna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Establezca el rango de escaneo en 85-1000 m/z. Establezca los parámetros de fuente de iones HESI en modo de ionización positiva en: voltaje de pulverización 1.500 V, temperatura capilar 300 oC, gas de vaina 40 a.u., caudal de gas auxiliar 15 a.u., temperatura del calentador de la sonda 300 oC, nivel de RF de lente S 55%.</li>
	<li>Ejecute muestras de control de calidad compuestas por 10 ml de cada muestra analizada (regularmente, cada 10-12 muestras) para supervisar el rendimiento del instrumento.</li>
	<li>Para la separación de fase invertida, utilice una columna C18 (2,1 mm x 75 mm, 3,5 m).<ol>
<li>Establezca el caudal en 200 l/min, y las temperaturas del muestreador automático y de columna a 4 oC y 55 oC, respectivamente. Preparar las fases móviles de acuerdo con las siguientes proporciones: fase móvil A: H2O:MeOH (60:40, v/v), acetato de amonio de 10 mM y ácido acético de 1 mM; fase móvil B: IPA:MeOH (90:10, v/v), acetato de amonio de 10 mM y ácido acético de 1 mM.</li>
		<li>Ajuste el flujo de fase móvil de acuerdo con los siguientes parámetros: 0-1 min (20% B), 1-1.5 min (20-50% B), 1.5-7.5 min (50-70% B), 7.55-13 min (70-95% B), 13-17 min (95% B), 17-17.1 min (95-20% B), 17.1-23 min (20%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para la separación HILIC, utilice una columna HILIC (100 x 2,1 mm, 3 m).<ol>
<li>Establezca el caudal en 400 l/min, y las temperaturas del muestreador automático y de columna a 4 oC y 40 oC, respectivamente.</li>
		<li>Preparar fases móviles de acuerdo con las siguientes proporciones: fase móvil A: ACN; fase móvil B: 5 mM de acetato de amonio en agua. Ajuste el flujo de fase móvil de acuerdo con los siguientes parámetros: 0-2 min (96% B), 2-15 min (96-80% B), 15-15.1 min (80-96% B), 15.1-21 min (96% B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Establezca los parámetros de fuente de iones HESI en modo de ionización positiva para pulverizar voltaje 3,500 V, temperatura capilar 275 oC, gas de vaina 20 a.u., caudal de gas auxiliar 10 a.u., temperatura del calentador de la sonda 300 oC, nivel de RF de lente S 55%.</li>
	<li>Ejecute muestras de control de calidad compuestas por 10 ml de cada muestra analizada (cada 10-12 muestras) para supervisar el rendimiento del instrumento.</li>
	<li>Realizar la adquisición de datos en software compatible con el instrumento.</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Realice el procesamiento de datos, la identificación putativa y el análisis estadístico con el uso de software dedicado a la metabolómica no segmentada y el análisis lipídico. NOTA: Se pueden obtener el análisis de componentes principales (PCA) y las gráficas de box-whisker para visualizar la estructura de datos.</li>
</ol>

<ol><li>U.S. Department of Health & Human Services. Organ Procurement and Transplantation Network. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://optn.transplant.hrsa.gov">https://optn.transplant.hrsa.gov</a> (2019).</li>
<li>Branger, P., Undine, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBranger%2C+P+%22Annual+Report+2018%2FEurotransplant+International+Foundation%22">Annual Report 2018/Eurotransplant International Foundation</a>. , Eurotransplant Foundation. Leiden. (2018).</li>
<li>Dare, A. J., Pettigrew, G. J., Saeb-Parsy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preoperative+assessment+of+the+deceased-donor+kidney%3A+From+macroscopic+appearance+to+molecular+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Preoperative assessment of the deceased-donor kidney: From macroscopic appearance to molecular biomarkers.</a> Transplantation. 97, 797-807 (2014).</li>
<li>Mueller, T. F., Solez, K., Mas, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+kidney+organ+quality+and+prediction+of+outcome+at+time+of+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Assessment of kidney organ quality and prediction of outcome at time of transplantation.</a> Seminars in Immunopathology. 33, 185-199 (2011).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+comparing+DCD+and+DBD+liver+allografts+uncovers+lysophospholipids+elevated+in+recipients+undergoing+early+allograft+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Lipidomics comparing DCD and DBD liver allografts uncovers lysophospholipids elevated in recipients undergoing early allograft dysfunction.</a> Scientific Reports. 5, 1-10 (2015).</li>
<li>Rao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+lipid+changes+in+acute+kidney+injury+using+SWATH+lipidomics+coupled+with+MALDI+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Early lipid changes in acute kidney injury using SWATH lipidomics coupled with MALDI tissue imaging.</a> American Journal of Physiology - Renal Physiology. 310, 1136-1147 (2016).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics%3A+The+principles+and+potential+applications+to+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Metabolomics: The principles and potential applications to transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 5, 2814-2820 (2005).</li>
<li>Kim, S. J., Kim, S. H., Kim, J. H., Hwang, S., Yoo, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+metabolomics+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Understanding metabolomics in biomedical research.</a> Endocrinology and Metabolism. 31, 7-16 (2016).</li>
<li>Bojko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+phase+microextraction+fills+the+gap+in+tissue+sampling+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Solid phase microextraction fills the gap in tissue sampling protocols.</a> Analytica Chimica Acta. 803, 75-81 (2013).</li>
<li>Filipiak, W., Bojko, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPME+in+clinical%2C+pharmaceutical%2C+and+biotechnological+research+-+How+far+are+we+from+daily+practice%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+-+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SPME in clinical, pharmaceutical, and biotechnological research - How far are we from daily practice.</a> TrAC - Trends in Analytical Chemistry. , 115-213 (2019).</li>
<li>Bojko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+invasive+in+vivo+tissue+sampling+for+monitoring+biomarkers+and+drugs+during+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Low invasive in vivo tissue sampling for monitoring biomarkers and drugs during surgery.</a> Laboratory Investigation. 94, 586-594 (2014).</li>
<li>Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopsy+of+the+transplanted+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Interventional+Radiology%22%5BJournal%5D)">Biopsy of the transplanted kidney.</a> Seminars in Interventional Radiology. 21, 275-281 (2004).</li>
<li>Plattner, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+and+adequacy+of+transplant+kidney+biopsies%3A+A+comparison+of+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Access%22%5BJournal%5D)">Complications and adequacy of transplant kidney biopsies: A comparison of techniques.</a> Journal of Vascular Access. 19, 291-296 (2018).</li>
<li>Tapia-Canelas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+associated+with+renal+graft+biopsy+in+transplant+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nefrologia%22%5BJournal%5D)">Complications associated with renal graft biopsy in transplant patients.</a> Nefrologia. 34, 115-119 (2014).</li>
<li>Afshinnia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics+and+Biomarker+Discovery+in+Kidney+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Lipidomics and Biomarker Discovery in Kidney Disease.</a> Seminars in Nephrology. 38, 127-141 (2018).</li>
<li>Zhao, Y. Y., Vaziri, N. D., Lin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomics%3A+New+insight+into+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipidomics: New insight into kidney disease.</a> Advances in Clinical Chemistry. 68, 153-175 (2015).</li>
<li>Kaminski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+Consumption+by+Warm+Ischemia-Injured+Porcine+Kidneys+in+Hypothermic+Static+and+Machine+Preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Oxygen Consumption by Warm Ischemia-Injured Porcine Kidneys in Hypothermic Static and Machine Preservation.</a> Journal of Surgical Research. 242, 78-86 (2019).</li>
<li>Wijermars, L. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+postreperfusion+metabolic+recovery+directly+associates+with+incident+delayed+graft+function%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Defective postreperfusion metabolic recovery directly associates with incident delayed graft function.</a> Kidney International. 90, 181-191 (2016).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteo-metabolomics+reveals+compensation+between+ischemic+and+non-injured+contralateral+kidneys+after+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion.</a> Scientific Reports. 8, 1-12 (2018).</li>
<li>Solati, Z., Edel, A. L., Shang, Y., Karmin, O., Ravandi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidized+phosphatidylcholines+are+produced+in+renal+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxidized phosphatidylcholines are produced in renal ischemia reperfusion injury.</a> PLoS One. 13, 1-24 (2018).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+in+monitoring+kidney+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Metabolomics in monitoring kidney transplants.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 15, 637-642 (2006).</li>
<li>Abbiss, H., Maker, G. L., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+approaches+for+the+diagnosis+and+understanding+of+kidney+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Metabolomics approaches for the diagnosis and understanding of kidney diseases.</a> Metabolites. 9, (2019).</li>
<li>Zhang, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+insights+into+chronic+kidney+disease+and+modulatory+effect+of+rhubarb+against+tubulointerstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Metabolomics insights into chronic kidney disease and modulatory effect of rhubarb against tubulointerstitial fibrosis.</a> Scientific Reports. 5, 1-17 (2015).</li>
<li>Looby, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+phase+microextraction+coupled+to+mass+spectrometry%3A+Via+a+microfluidic+open+interface+for+rapid+therapeutic+drug+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Solid phase microextraction coupled to mass spectrometry: Via a microfluidic open interface for rapid therapeutic drug monitoring.</a> Analyst. 144, 3721-3728 (2019).</li>
<li>Gómez-Ríos, G. A., Tascon, M., Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coated+blade+spray%3A+Shifting+the+paradigm+of+direct+sample+introduction+to+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Coated blade spray: Shifting the paradigm of direct sample introduction to MS.</a> Bioanalysis. 10, 257-271 (2018).</li>
</ol>

Los autores desean reconocer a MilliporeSigma (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) por proporcionar dispositivos SPME y Thermo Fisher Scientific para el acceso al espectrómetro de masas Q-Exactive Focus Orbitrap.

La evaluación de la calidad de los órganos sigue siendo un gran desafío para los médicos, que deben tomar decisiones rápidas y informadas sobre si un órgano determinado es viable para el trasplante o si debe desecharse. Múltiples factores, como la edad del donante, la duración de la isquemia, las infecciones y los procesos inflamatorios, pueden afectar el resultado del injerto a largo plazo. Mientras que se han desarrollado diversos métodos hasta la fecha para diagnosticar la función de aloinjerto renal, la inspección histopatológica sigue siendo el estándar de oro en esa materia3,4,12. Aunque el procedimiento de biopsia puede producir información significativa sobre la enfermedad del donante preexistente y los cambios vasculares, no está libre de defectos. Los errores de muestreo asociados a la variabilidad entreobservados y al muestreo de glomérulos insuficientes para obtener información completa sobre la función de los órganos siguen siendo preocupaciones típicas a este respecto. Además, la preparación de muestras trae algunas cuestiones, como una evaluación incompleta del injerto en caso de secciones congeladas, y la extensión del tiempo de procedimiento para la sección de parafina. Sin embargo, el mayor riesgo de hemorragia, que puede aparecer agudamente como hematuria microscópica o grave, es la principal complicación potencialmente mortal asociada con el procedimiento de biopsia. Por esta razón, el número de biopsias permitidas está estrictamente limitado en los procedimientos de trasplante, un factor que dificulta la captura de cambios dinámicos y análisis de series temporales a través de este método12,,13,,14. Los beneficios de un análisis histológico deben sopesarse con los riesgos asociados con la metodología. El valor de los hallazgos histológicos es indiscutible, pero no explican los mecanismos moleculares de las aberraciones.
Metabolómica y lipidómica son los dominios más jóvenes de la familia científica "-omics". El conjunto completo de metabolitos y lípidos humanos bajos moleculares (<1,200 Da) conectados dentro de una red metabólica se define como un metaboloma humano. El genoma permanece relativamente constante a lo largo de su vida útil, con ligeras modificaciones causadas por mutaciones que ocurren con poca frecuencia. El metaboloma es el producto de la expresión génica, que es altamente sensible a los cambios en todos los procesos biológicos, así como factores ambientales. La naturaleza dinámica de los metabolitos y lípidos los convierte en indicadores perfectos de la condición actual del órgano7,8,15,16. El método SPME propuesto en el protocolo antes mencionado permite la detección de los cambios que se producen en el órgano durante su conservación, partiendo de la extracción de órganos del cuerpo del donante hasta la revascularización en el receptor. El pequeño diámetro de la sonda (200 m) proporciona una mínima invasividad y permite varios muestreos del mismo órgano sin causar ningún daño al tejido. La realización de estudios utilizando el riñón, como el órgano trasplantado con más frecuencia, permite una mejor comprensión y posterior caracterización de las vías metabólicas responsables de la disminución de la calidad y función de los injertos. La posibilidad de monitorear las modificaciones a lo largo del tiempo sin duda es una ventaja importante de la técnica en comparación con los métodos invasivos convencionales como la biopsia. El análisis presentado actualmente identificó concentraciones alteradas de varios grupos de lípidos y metabolitos, especialmente de aminoácidos esenciales, purinas, nucleósidos de purina y glucerofosfolípidos. Estos resultados son consistentes con los informes de análisis de tejidos anteriores5,6,17,18,19,20. Hasta la fecha, la mayoría de los informes científicos que utilizan metabolómica o lipidómica para explicar los procesos que inducen complicaciones después del trasplante o de la isquemia/lesión por reperfusión (IRI) se han limitado al análisis de biofluidos21,,22,,23.
Cada aplicación clínica requiere la optimización del protocolo de muestreo para garantizar que el rendimiento del método analítico cumpla los criterios esperados. A este respecto, el beneficio de utilizar SPME es la posibilidad de ajustar las condiciones para diversos diseños experimentales. La variedad de fases de extracción accesibles proporciona un amplio espectro de metabolitos extraídos con polaridades diversificadas. Al mismo tiempo, esto podría considerarse como una limitación del método debido al hecho de que cada sorbente proporciona selectividad hacia características específicas y no extrae todos los compuestos presentes en la matriz de muestra. Cabe señalar que los recubrimientos SPME se extraen sólo a través de moléculas libres, y simplemente no interactúan con una fracción enlazada del analito. La biocompatibilidad de los recubrimientos no introduce toxicidad en el tejido al tiempo que se restringe la extracción de moléculas grandes como proteínas; como consecuencia, los procesos enzimáticos se inhiben ya en la etapa de recolección de muestras y se minimiza la presencia de artefactos, lo que es una gran ventaja sobre los métodos de muestreo alternativos. La longitud del recubrimiento influye en la eficiencia de la extracción (es decir, la longitud del recubrimiento designa el área de superficie y el volumen de fase de extracción); por lo tanto, los recubrimientos más largos producen mayores recuperaciones. Por otro lado, los recubrimientos más cortos permiten una mayor resolución espacial. Para obtener resultados fiables, es crucial sumergir la sonda a la misma profundidad exacta de la corteza renal. La inserción demasiado profunda causa el riesgo de entrar en la médula renal. El tiempo de extracción también es proporcional a la eficiencia de extracción. Por lo tanto, la selección del tiempo de extracción óptimo es uno de los pasos más críticos en el desarrollo del método SPME. La precisión de la medición del tiempo proporciona la repetibilidad más alta. En aplicaciones biológicas como la discutida, siempre existe un compromiso entre la sensibilidad y la repetibilidad del protocolo analítico y las restricciones del procedimiento médico. Mientras que la extracción de equilibrio proporciona la mayor sensibilidad, por razones de seguridad, las condiciones de pre-equilibrio se utilizan a menudo en tales aplicaciones, ya que el tiempo de extracción no debe afectar la duración total de la cirugía. La eficiencia de la desorción viene determinada por el momento del proceso y la composición del disolvente de desorción, que debe ser compatible con la fase móvil utilizada para la separación cromatográfica9,10,11.
Uno de los principales requisitos para la instrumentación diagnóstica utilizada para las evaluaciones intraquirúrgicas es el tiempo de análisis. Se están realizando intentos actuales para desarrollar una herramienta rápida para la extracción de SPME in vivo acoplada directamente a un espectrómetro de masas a través de una interfaz abierta microfluídica (MOI)24 o pulverización de cuchilla recubierta (CBS)25. Estos enfoques permitirían la divulgación de resultados analíticos en tiempo real o cercano al tiempo real. El uso de estos métodos para los análisis previos a la intervención de perfiles metabólicos y lipídicos podría mejorar el proceso de toma de decisiones durante los procedimientos de trasplante, permitiendo el mejor enfoque personalizado posible y una respuesta rápida en caso de fallo de órganos.
Como resumen, se presume que el protocolo propuesto permitirá la realización de perfiles metabólicos y lipídicos completos de los injertos renales, lo que a su vez proporcionaría una evaluación exhaustiva de la calidad de los órganos y la caracterización de los procesos responsables de la lesión por isquemia-reperfusión. La novedad del proyecto incluye la utilización de la microextracción de fase sólida (SPME), ofreciendo un muestreo poco invasivo de sistemas vivos, en combinación con una de las tecnologías más innovadoras disponibles para el análisis metabolómico y lipidómico (por ejemplo, el espectrómetro de masas de alta resolución Orbitrap). SPME combina la recolección de muestras, la extracción y el enfriamiento de metabolitos en un solo paso, lo que la convierte en una herramienta perfecta para un análisis rápido. Se espera que este protocolo ayude a responder preguntas relacionadas con qué condiciones previas al trasplante del riñón son responsables de la función retardada del órgano o sus disfunciones después del trasplante, así como de cómo el protocolo de preservación del injerto influye en la bioquímica del órgano. Estos conocimientos no sólo tendrían un impacto significativo en la prevención de posibles complicaciones relacionadas con el trasplante, sino que pueden ayudar a mejorar los protocolos actuales de preservación del injerto, minimizando la pérdida de tejido de trasplante viable, así como la pérdida de vidas. La solución propuesta abrirá la puerta a nuevas investigaciones en este campo, incluida la validación de biomarcadores potenciales específicos y la mejora de los resultados terapéuticos en la trasplanteología.

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The third affiliation was&#160;updated from:
Department of Transplantation and General Surgery, University Hospital, University of Nicolaus Copernicus Torun&#34;
to:
Department of Transplantology and General Surgery, Collegium Medicum in Bydgoszcz, Antoni Jurasz University Hospital No. 1 in Bydgoszcz, Nicolaus Copernicus University in Torun, Bydgoszcz, Poland

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Erratum: Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Según la Red de Adquisiciones y Trasplantes de Órganos de los Estados Unidos, había 94.756 pacientes esperando trasplantes de riñón en los Estados Unidos en 2019; mientras que en Europa en 2018, esa cifra fue de 10.791. Cada diez minutos, alguien es añadido a la lista nacional de espera de trasplantes en los EE.UU., y se estima que 20 personas mueren cada día esperando un trasplante1,2. El trasplante de riñón es un tratamiento que salva vidas para un gran número de personas que sufren de disfunción renal terminal en todo el mundo. El procedimiento se asocia con una mayor tasa de supervivencia y una mayor calidad de vida en comparación con la diálisis convencional.
Sin embargo, el trasplante enfrenta muchos problemas graves, como la escasez de órganos o la falta de herramientas eficaces para la evaluación de la calidad de los órganos. Los protocolos estándar se limitan a la inspección de apariencia macroscópica o biopsia de tejido invasiva, que no proporcionan información completa sobre la calidad del injerto. Mientras que una evaluación visual permite la identificación de tumores visibles para el ojo, anomalías anatómicas o daños extensos a los injertos, este enfoque es muy subjetivo, variando en su eficacia de acuerdo con la experiencia de los observadores. La biopsia, por otro lado, puede proporcionar información valiosa sobre trastornos renales preexistentes, y por lo tanto se considera un método de valor objetivo y evidenciado para determinar los resultados del injerto. Sin embargo, el procedimiento de biopsia no está libre de defectos; existe el riesgo de complicaciones potenciales como sangrado y se requieren 4-5 horas adicionales de preparación de la muestra, lo que prolonga significativamente el tiempo isquémico en frío. Por lo tanto, especialmente en Europa, el uso del análisis directo de tejidos se limita a criterios ampliados donantes (ECD) y donantes después de la muerte circulatoria (DCD)3,4.
Metabolómica y lipidómica han sido recientemente reconocidos como enfoques prometedores para lograr una mejor comprensión de los cambios en las vías bioquímicas que ocurren durante la preservación de órganos. El perfilado metabolómico y lipidomico permite monitorizar las respuestas inmediatas del sistema a cambios ambientales repentinos relacionados con la extracción de órganos con consecuencias posteriores: isquemia, estrés oxidativo o respuestas inflamatorias5,,6,,7,,8. El riñón es un órgano que se asocia en gran medida con procesos metabólicos, por lo tanto, las mediciones de metabolitos y concentraciones de lípidos pueden permitir la identificación de biomarcadores de calidad de órganos potenciales y permitir mejores predicciones del resultado del injerto.
Dadas las complicaciones y limitaciones anteriores asociadas con los métodos actuales de evaluación de la calidad de los órganos, se necesita una solución de diagnóstico menos invasiva para una evaluación rápida y compleja de la calidad de los órganos. La microextracción de fase sólida (SPME) cumple con estos requisitos como un método analítico mínimamente invasivo que permite la cobertura de un amplio espectro de metabolitos y lípidos. La técnica se basa en la inserción de una sonda de aleación de titanio-níquel biocompatible (200 m) cubierta con una fase de extracción selectiva en el órgano examinado durante un corto período de tiempo. Cabe destacar que SPME previene la extracción de proteínas, y por lo tanto permite la inhibición del metabolismo ya en la etapa de recolección de muestras, lo que es una ventaja significativa sobre los métodos alternativos. Además, la miniaturización del dispositivo permite la ejecución de análisis repetitivos y simultáneos de pocas estructuras del órgano9,,10,,11.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>Merck</td><td>5330010050</td><td>Aditivo de fase móvil</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Alchem</td><td>696-34967-4X2.5L</td><td>Disolvente de HPLC</td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>Merck</td><td>5330040050</td><td>Aditivo de fase móvil</td></tr><tr><td>BATIDORA DE BANCO XL VÓRTICE MULTITUBO</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BV1010</td><td>Mezclador de vórtice</td></tr><tr><td>Caps</td><td>Perlan Technologies</td><td>5183-2076</td><td>Azul scrw tp, PTFE/Si spta precortado, 100PK</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Merck</td><td>1024441000</td><td></td></tr><tr><td>Discovery HS F5 Cartucho Supelguard, 3 &mu; m, L y veces; Diámetro interior 2 cm y veces; 2,1 mm</td><td>Merck</td><td>567570-U Columna de protección para</td><td>HPLC</td></tr><tr><td>Discovery HS F5, 2,1 mm x 100 mm, 3 &mu; m</td><td>Merck</td><td>567502-U</td><td>Columna de HPLC</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Alchem</td><td>497-94318-50ML</td><td>Aditivo de fase móvil</td></tr><tr><td>Viales de vidrio</td><td>Perlan Technologies</td><td>5182-0714</td><td></td></tr><tr><td>HILIC Luna 3 &mu; m, 200A, 100 x 2,0 mm</td><td>Shim-Pol</td><td>PHX-00D-4449-B0</td><td>Columna de HPLC</td></tr><tr><td>Cartucho HILIC SecurityGuard, 3 &mu; m, 4 x 2,0 mm</td><td>Shim-Pol</td><td>PHX-AJ0-8328 Columna de</td><td>protección para HPLC</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Alchem</td><td>231-AL03262500</td><td>Disolvente de HPLC</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Alchem</td><td>696-34966-4X2.5L</td><td>Disolvente de HPLC</td></tr><tr><td>Agua nanopura</td><td>Disolvente</td> de <td></td><td>1037281002 HPLC</td></tr><tr><td>Merck Q Exactive Focus cuadrupolo híbrido-Orbitrap MS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive Focus</td><td>Mass Espectrómetro</td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-cHILIC 3&micro; m,100&Aring; 100 x 2,1 mm</td><td></td><td>Columna de HPLC</td><td>1506570001 Merck</td></tr><tr><td>Kit de protección SeQuant ZIC-HILIC 20 x 2,1 mm</td><td>Columna de protección de 1504360001 HPLC</td><td>DE MERCK</td><td></td></tr><tr><td>Sondas de fibra LC SPME, modo mixto</td><td>Fibras prototipo de</td><td>Supelco</td> Sistemas de <td></td></tr><tr><td>HPLC UltiMate 3000</td> Sistema de <td>HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>UltiMate 3000</td></tr><tr><td>Insertos de viales (desactivados)</td><td>Perlan Technologies</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>XSelect CSH C18 3.5&mu; m 2.1x75mm</td><td>Columna</td><td></td><td>de HPLC</td></tr><tr><td>186005644 de Aguas XSelect CSH C18 VanGuard Cartucho 3.5&mu; m, 2,1 x 5 mm</td><td>Waters 186007811</td><td></td><td>columna de protección HPLC</td></tr></tbody></table>

uso de una biopsia química para la evaluación de la calidad del injerto

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

El trasplante de riñón es un tratamiento que salva vidas para un gran número de personas con disfunción renal terminal en todo el mundo. El procedimiento se asocia con una mayor tasa de supervivencia y una mayor calidad de vida del paciente en comparación con la diálisis convencional. Lamentablemente, la transplantología sufre de la falta de métodos confiables para la evaluación de la calidad de los órganos. Las técnicas de diagnóstico estándar se limitan a la inspección de apariencia macroscópica o a la biopsia de tejido invasiva, que no proporcionan información completa sobre el injerto. El protocolo propuesto tiene como objetivo introducir la microextracción de fase sólida (SPME) como un método analítico ideal para la metabolómica integral y el análisis lipidémico de todos los compuestos moleculares bajos presentes en los riñones asignados para el trasplante. El pequeño tamaño de la sonda SPME permite el rendimiento de una biopsia química, que permite la extracción de metabolitos directamente del órgano sin ninguna recolección de tejido. La mínima invasividad del método permite la ejecución de múltiples análisis a lo largo del tiempo: directamente después de la recolección de órganos, durante su conservación, e inmediatamente después de la revascularización en el cuerpo del receptor. Se presume que la combinación de este novedoso método de muestreo con un espectrómetro de masas de alta resolución permitirá la discriminación de un conjunto de compuestos característicos que podrían servir como marcadores biológicos de la calidad del injerto y los indicadores del posible desarrollo de la disfunción orgánica.

La recolección de muestras se realizó de acuerdo con el método SPME descrito anteriormente, utilizando sondas recubiertas con una fase de extracción de modo mixto de 7 mm. El muestreo se realizó directamente desde el tejido del injerto (in vivo antes del trasplante), ex vivo en la cámara renal después de 1 h, 3 h, 5 h y 7 h de perfusión, y in vivo después de la revascularización en el receptor. Los análisis metabolómicos y lipidómicos no dirigidos se llevaron a cabo con el uso de cromatografía líquida (RP, HILIC) junto con espectrometría de masas de alta resolución, con el analizador de masas establecido en modo de ionización positiva. Para evaluar la calidad de los datos y obtener información general sobre los resultados, los datos se someten al análisis de componentes principales (PCA). Como se muestra en la Figura 1, lasmuestras de control de calidad formaron un clúster apretado, confirmando la calidad de los análisis. Los grupos estudiados presentan una separación relativamente buena, lo que permite la visualización de las diferencias en los perfiles metabólicos y lipidómicos antes y después del trasplante, así como durante la perfusión de órganos (Figura 2). El muestreo SPME permite el perfilado metabólico del órgano con el tiempo. Las gráficas de box-whisker de metabolitos seleccionados sirven para ejemplificar alteraciones en los niveles de metabolitos a lo largo del experimento (Figura 3). El amplio espectro de entidades extraídas separadas en las columnas RP e HILIC se muestra en la Figura 4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig01.jpg"> Figura 1: Análisis de componentes principales que muestran la agrupación de muestras de control de calidad para análisis metabolómicos de fase invertida (A), HILIC (B) y fase invertida lipidémica (C), HILIC (D). El control de calidad es necesario en el análisis no dirigido para monitorear cualquier posible cambio inducido por la inestabilidad instrumental. Un grupo apretado de muestras de control de calidad garantiza que todos los cambios observados sean de origen biológico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig02.jpg"> Figura 2: Análisis de componentes principales que muestran diferencias metabolómicas (A) y lipidómicas (B) entre puntos de muestreo particulares. El perfilado no dirigido del riñón con SPME-LC-HRMS permite observar diferencias bioquímicas en los órganos en los pasos posteriores de su preservación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig2v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig03.jpg"> Figura 3: Gráficas de bóxer de compuestos seleccionados que muestran alteraciones en metabolitos (A, B) y lípidos (C, D) durante el período peritransplano. Después de la selección e identificación de compuestos discriminantes, las parcelas de box-whisker permiten monitorear los cambios en los niveles de estos compuestos en los pasos posteriores del protocolo y comparar los niveles de metabolitos en órganos sometidos a diferentes protocolos de preservación o cosechados de diferentes donantes, por ejemplo, donantes que laten corazón o donantes después de la muerte cardíaca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60946/60946fig04.jpg"> Figura 4: Mapa de iones (m/z frente al tiempo de retención) de las entidades obtenidas mediante el análisis LC-MS con (A) fase invertida y (B) separación HILIC. La gráfica permite estimar el número total de características obtenidas con el protocolo propuesto (desde la extracción hasta la detección) y evaluar la cobertura de analitos en función de la polaridad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60946/60946fig4v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El protocolo presenta la utilización del enfoque de biopsia química seguido de un análisis metabolómico y lipidémico completo para la evaluación de la calidad de los injertos renales asignados para el trasplante.

Uso de una biopsia química para la evaluación de la calidad del injerto

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

La biopsia química es una nueva solución de diagnóstico en el trasplante de órganos para una evaluación rápida y compleja de la calidad del injerto. Actualmente, no hay otros métodos de bajo invasivo disponibles que permitan este tipo de análisis. La principal ventaja de esta técnica es la posibilidad de controlar las modificaciones del tejido del injerto en el tiempo de conservación debido a la simplicidad y baja invasividad de las sondas SPME.El pequeño diámetro de la sonda y una gran variedad de recubrimientos biocompatibles hacen que este método sea adecuado para el análisis de órganos trasplantados y aplicable en investigaciones médicas como el análisis tumoral. Al intentar esta técnica por primera vez prestar atención a los detalles y el tiempo de pasos particulares porque pequeños errores pueden influir en gran medida en los resultados. El protocolo es simple, pero es más fácil de entender y realizar después de la demostración visual.Comience preparando una mezcla de preacondicionamiento compuesta de un metanol y agua de uno a uno. Pipetear un mililitro de la solución en cada vial de vidrio de dos mililitros y colocar una sonda en cada vial. Agitar los viales en un agitador de vórtice a 1200 RPM durante una hora.A continuación, enjuague las sondas con agua de grado LCMS y esterivellas de acuerdo con el protocolo de esterilización quirúrgica estándar o en el departamento de procesamiento estéril. Cuando esté listo para extraer la muestra, abra el embalaje estéril e inserte dos sondas directamente en la corteza renal durante 10 minutos por punto de tiempo, asegurándose de que toda la longitud del recubrimiento esté cubierta por la matriz tisular. Asegúrese de realizar un seguimiento del tiempo de muestreo de cada sonda.Retirar la sonda extrayéndola del tejido y enjuague inmediatamente el recubrimiento con agua de grado LCMS para eliminar cualquier sangre restante asegurándose de enjuagar lejos del sitio quirúrgico. Para transportar las sondas, colóquelas en viales separados y ciérrelas. A continuación, coloque los viales en una caja llena de hielo seco o nitrógeno líquido.Almacene las muestras a 80 grados celsius negativos o proceda inmediatamente con desorción. Preparar una solución de desorción compuesta de acetonitrilo y agua para análisis metabolómico y otra compuesta de isopropanol y metanol para análisis lipidómico. Añadir 100 microlitros de la solución a las inserciones en los dos viales etiquetados por mililitros y colocar una sonda en cada vial agitar los viales a 1200 RPM durante dos horas y luego retirar las sondas de los viales y continuar con el análisis LCMS.La cromatografía líquida junto con la espectrometría de masas de alta resolución se utilizó para llevar a cabo análisis metabolómicos y lipidómicos no dirigidos. Los datos fueron sometidos a análisis de componentes principales para evaluar la calidad de entretener información general sobre los resultados. Las muestras de control de calidad formaron un racimo apretado que confirmaba la calidad del análisis.Los grupos estudiados mostraron una separación relativamente buena, lo que permitió la visualización de las diferencias en los perfiles metabólicos y lipídicos antes y después del trasplante, así como durante la perfusión de órganos. Un amplio espectro de características extraídas se separó tanto en columnas de cromatografía líquida y de fase invertida como en columnas de cromatografía líquida. Se demostraron alteraciones y niveles de metabolitos a lo largo del experimento con gráficas de bigote de caja de los metabolitos seleccionados.Al realizar este procedimiento, tenga en cuenta la heterogeneidad de los órganos. Coloque la sonda en la ubicación deseada, mantenga el tiempo de muestreo idéntico en todos los puntos de tiempo y asegure la fibra correctamente después del muestreo. Los biomarcadores descubiertos con SPME se pueden cuantificar utilizando este método de extracción acoplado a MSMS, LCMS u otra instrumentación analítica.Además, dado que no se consume ninguna muestra, se pueden realizar análisis de rutina como la biopsia. El método se puede adaptar para otros análisis metabolómicos y lipidómicos de tejidos sin necesidad de pretratamiento de muestras. Para metabolitos específicos.Otros recubrimientos se pueden utilizar para aumentar la selectividad y la sensibilidad del ensayo.

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Investigación

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