Enfoque estereotáctico en ángulo adaptable para técnicas versátiles de neurociencia

Este protocolo es importante, ya que es un procedimiento estereotáctico adaptable que se puede utilizar tanto en ratones como en ratas, y se puede aplicar a muchas técnicas neurocientíficas nuevas. La principal ventaja de este procedimiento estereotáctico adaptable es su capacidad para dirigirse a regiones desafiantes y difíciles de alcanzar del cerebro. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Chelsea Faber, una joven y talentosa investigadora postdoctoral en el laboratorio.

Después de confirmar que el marco y el micromanipulador han sido calibrados, coloque el medidor de altura central en el zócalo de la placa base del soporte de la cabeza. Asegure el visor de centrado en el portaherramientas y mire hacia abajo. Ajuste la posición del micromanipulador hasta que los puntos de mira estén alineados y enfocados en los puntos de mira del medidor, y coloque las barras de las orejas en los soportes de modo que las líneas del indicador en ambos lados estén en cero.

Utilice las perillas medial-lateral y antero-posterior en el soporte de la cabeza para centrar las barras de la oreja en los planos X e Y por encima de la cruz del medidor de altura central. Para alinear la posición de la barra auricular en el eje Z, retire las barras auriculares del soporte y retire el indicador de altura central. Luego, reemplace las barras de los oídos y vuelva a centrar las barras en cero.

A continuación, vuelva a mirar hacia abajo y utilice los mandos de desplazamiento vertical e inclinación coronal, respectivamente, para bajar y girar las barras de la oreja hasta que el punto de mira del visor permanezca centrado entre las barras de la oreja durante toda la rotación coronal. Para alinear el eje central de rotación para coordenadas en ángulo, asegure el visor de centrado en el portaherramientas y coloque el micromanipulador en la coordenada calculada. Tenga en cuenta que la coordenada derecha/izquierda para la implantación en ángulo corresponde a la longitud del lado A. Al mirar hacia abajo en el endoscopio, marque esta coordenada para representar el punto en el que la cánula ingresará al cerebro, una vez que se gire la cabeza.

Vuelva a colocar el micromanipulador sobre la línea media y use la perilla de inclinación coronal para girar la cabeza al ángulo calculado. Si el punto de mira del visor no se alinea con la marca de referencia, utilice la perilla de desplazamiento vertical para ajustar la posición de la cabeza en el eje Z hasta que el punto de mira se alinee lo más cerca posible de la marca. En este punto, el punto arbitrario de rotación debe estar alineado con el centro de rotación de la estereotaxia.

Gire el cabezal de nuevo a la posición coronal de cero grados antes de continuar con los siguientes pasos de perforación y microinyección. Después de realizar la microinyección, regrese la cabeza a la posición de nivel de cero grados y use un taladro manual para colocar dos orificios, en la parte anterior, y dos orificios, en la parte posterior, lo suficientemente lejos de los orificios de rebaba de coordenadas en ángulo para acomodar la parte de la férula de la fibra óptica que se encuentra sobre el cráneo. Cuando se hayan perforado todos los agujeros, use un destornillador pequeño de punta plana para insertar los tornillos de hueso lo más suavemente posible, de modo que se asienten firmemente en el cráneo sin penetrar en el cerebro.

Sujete una cánula de fibra óptica en el soporte de la cánula y coloque el soporte de la cánula en el portaherramientas. Gire la cabeza hasta el ángulo calculado, teniendo en cuenta que las coordenadas del micromanipulador no se aplican a la nueva herramienta. Utilice el centro de los orificios de fresa en ángulo como objetivo de implantación.

Baje la fibra óptica hasta que toque la duramadre dentro del centro del orificio de la fresa y ponga a cero el micromanipulador en el eje Z. Baje lentamente la fibra óptica a la coordenada en ángulo ventral dorsal, luego use gel de cianoacrilato para conectar la férula de fibra óptica a los tornillos de anclaje ipsilateral. Utilice una punta de micropipeta para aplicar un acelerante.

Una vez que el gel se haya endurecido por completo, afloje suavemente y levante el soporte de la cánula hasta que esté libre de la férula. Implante la segunda fibra óptica en la coordenada angular contralateral, luego nivele la cabeza. Para mayor seguridad, use el gel de cianoacrilato y el acelerante para hacer una conexión adicional entre las dos cánulas de fibra óptica en ángulo, y aplique una cantidad pequeña y relativamente delgada de cemento dental en la superficie del cráneo, teniendo cuidado de cubrir completamente los tornillos de anclaje y la base de las cánulas de fibra óptica.

Para interrogar el papel de las neuronas del núcleo ventromedial del hipotálamo en el control glucémico, en este análisis representativo, se utilizó un enfoque estereotáctico estándar, no angulado, para la microinyección bilateral de un virus de rodopsina del canal inhibidor al núcleo ventromedial. Dada la proximidad del núcleo ventromedial a la línea media, las limitaciones de espacio no permitieron un implante no en ángulo de fibra óptica bilateral, lo que requirió el desarrollo de una estrategia quirúrgica para implantar con precisión la fibra óptica en ángulo. Lo más importante que hay que recordar es simplemente ser paciente y tomarse su tiempo, ya que ser coherente y preciso con sus tareas coordinadas es fundamental para el éxito.

Este procedimiento se puede adaptar y aplicar a cualquier método neurocientífico que requiera microinyección o implantación en el cerebro de roedores, incluidos los enfoques de quimiogenética, optogenética y fotometría de fibras.