Análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células inmunitarias dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo de osteoartritis

Nuestro protocolo permite la identificación y análisis detallados de monocitos y macrófagos y células T y sus subconjuntos relevantes dentro de las neuronas y el ovo y varios otros tejidos del sistema inmunitario. Nuestra técnica facilita la recolección fiable de células inmunitarias de la vida del sinovium y otros tejidos relevantes para una caracterización completa de la respuesta inmune osteoartrítica. Para el aislamiento de los tejidos de interés de un ratón modelo osteoartritis, con el ratón en posición supina, limpiar el pecho, abdomen y piernas con 70%etanol.

Usa tijeras para abrir cuidadosamente la piel a lo largo de la línea media del abdomen mientras dejas la cavidad abdominal intacta. Y tire suavemente de la piel en el lado derecho del animal lejos del músculo subyacente, dejando el tejido adiposo subcutáneo unido a la piel. Coloque el ratón bajo un microscopio diseccionado y use dos fórceps finos curvados para sacar suavemente el tejido adiposo situado en el muslo.

Después de identificar los tres vasos cruzados, utilice fórceps de disección fina para extraer el ganglio linfático inguinal situado en la intersección de los vasos, teniendo cuidado de no romper la cápsula. Utilice los fórceps para extraer la grasa restante de la superficie del ganglio linfático y abrir la cavidad abdominal. Si no se observa grasa restante, coloque el ganglio linfático inmediatamente en una placa de seis pozos previamente preparada y etiquetada llena de 0,5 mililitros de medios RPMI.

A continuación, abra la cavidad abdominal. Usa tijeras finas para extirpar el bazo y extraer suavemente los intestinos para exponer la aorta y su bifurcación. A partir de ahora, coloque el bazo inmediatamente en un medio RPMI previamente preparado y etiquetado con 0,5 mililitros de MEDIOS RPMI.

Retire el ganglio linfático ilíaco situado en el segmento terminal de la aorta abdominal y el origen de la arteria ilíaca común y retire cuidadosamente la piel de ambas extremidades posteriores. Coloque inmediatamente el ganglio linfático en una construcción de placa de seis pozos previamente preparada y etiquetada con 0,5 mililitros de medios RPMI que agrupan todos los ganglios linfáticos de dos animales. Usando tijeras finas o un bisturí, limpie el fémur izquierdo del tejido muscular adjunto y desconecte cuidadosamente tanto la sofocación como la articulación de la cadera, dejando todo el hueso intacto mientras se retira el fémur.

A continuación, se coloca el fémur en una placa de seis pozos previamente preparada y etiquetada llena de 0,5 mililitros de medios RPMI. Identifique el tendón de la rótula de la articulación de la asfixia derecha y utilice tijeras finas para eliminar el tejido muscular adyacente proximal a articulación hasta que se expongan aproximadamente cinco mililitros de tendón proximal del tendón de cuádriceps a la rótula. Cortar a través del tendón del cuádriceps aproximadamente de tres a cuatro milímetros proximal a la rótula para formar un mango y utilizar fórceps finos para tirar suavemente de la tensión de la articulación para exponer los bordes de la unión de la cápsula de la articulación.

Comenzando con el fémur y moviéndose hacia la tibia, utilice un bisturí para cortar cuidadosamente a lo largo de los bordes de la cápsula articular en ambos lados mientras mantiene una tracción suave en el tendón del cuádriceps. Cuando el bloque de tejido sinovial se une sólo a la tibia, la almohadilla de grasa intraarticular debe ser claramente visible distal a la rótula y se puede separar suavemente de la articulación y el aspecto anterior de la Minsky. A continuación, corte a lo largo de la parte restante de la cápsula articular para extraer el bloque de tejido sinovial e inmediatamente colóquelo en una placa de seis pozos previamente preparada y etiquetada llena de 1,5 mililitros de medios RPMI.

Cuando se hayan recogido todos los tejidos, coloque dos bazos agrupados por condición en un colador celular de 70 micrómetros en un tubo de 15 mililitros y utilice un émbolo estéril de jeringa de tres mililitros para la tasa de masa suave de los tejidos a través del filtro de malla que lava el colador con frecuencia con un total de seis mililitros de RPMI 1640 medio complementado con 10%FBS. Sedimentar las células por centrifugación, y volver a suspender el pellet en cinco mililitros de globo de lysis de glóbulos rojos. Después de cinco minutos, detenga la reacción con 10 mililitros de PBS y centrifugar las células.

Cuando no se observan más glóbulos rojos, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS fresco para el recuento. Para el procesamiento de ganglios linfáticos coloque los cuatro ganglios linfáticos en un colador celular de 70 micrómetros en un nuevo tubo de 15 mililitros y utilice un nuevo émbolo estéril de tres mililitros para burlar suavemente los ganglios linfáticos a través de la malla en una sola suspensión celular, luego centrifugar las células a 500 veces G durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de PBS para el recuento. Para aislar la médula ósea, usa un fórceps de tejido para agarrar cuidadosamente el fémur intacto y usa tijeras afiladas para cortar el extremo del fémur proximal.

Inserte una aguja de calibre 23 en el centro de la muesca intercondylar del fémur y gire la aguja mientras aplica una presión suave para perforar un agujero en la muesca. Cambiar la aguja según sea necesario, lavar el contenido óseo con seis mililitros de RPMI complementados con 10%FBS en un colador de células de 70 micrómetros en un nuevo tubo de 15 mililitros y utilizar un nuevo émbolo de jeringa de tres mililitros para presionar suavemente la médula ósea a través de la malla. A partir de ahora, realice el paso RBC como se muestra para el bazo.

Cuando no se observan más glóbulos rojos, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS fresco para el recuento. Para el procesamiento del tejido sinovial utilice tijeras quirúrgicas finas para cortar los dos bloques de tejido sinovial en trozos diminutos y transferir las muestras a un nuevo tubo de 15 mililitros. Enjuague el recipiente de recogida con 500 microlitros de medio para recoger las células restantes y los tejidos sinoviales y tire del lavado en el tubo de recogida de la muestra.

A continuación, agregue un volumen suficiente de enzima para lograr en una concentración final de una unidad por mililitro y digerir la muestra de tejido sinovial a 37 grados Celsius en una incubadora durante dos horas de un rotador. Asegúrese de un movimiento suficiente al colocar los tubos en el rotador. Al final de la incubación, detener la digestión con ocho mililitros de RPMI complementados con 10%FBS y filtrar la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros en un nuevo tubo de 15 mililitros.

Enjuague el tubo viejo de 15 mililitros con cinco mililitros de medio y utilícelo para lavar el filtro. Luego, sedimentar las células por centrifugación y resuspender el pellet en 500 microlitros de PBS para el conteo. Para realizar la tinción de viabilidad de las células inmunitarias aisladas, agregue cinco veces 10 a las cinco células de cada suspensión celular a los pozos apropiados de dos placas diferentes de 96 pozos en U y recoja las células en la parte inferior de cada pozo.

Incluya siempre suficientes células no manchadas de cada tipo de tejido como controles negativos. Lavar las células con 200 microlitros de PBS y volver a suspender los pellets en 100 microlitros de células en tinte reactivo de amina permeante por pozo durante una incubación de 15 minutos a cuatro grados centígrados protegidos de la luz. Al final de la incubación lavar las células dos veces en 200 microlitros de tampón FACS por lavado y re-suspender cada pellet en 100 microlitros del anticuerpo apropiado de interés o cóctel de control.

Si tanto la tinción intra como la extracelular se lleva a cabo en el mismo realizar el paso de tinción extracelular ahora. Después de 30 minutos de incubación a cuatro grados Celsius protegidos de la luz lavar las células dos veces con 200 microlitros de tampón FACS por pozo y volver a suspender las células y la placa del panel del subconjunto de monocitos en 250 microlitros de tampón FACS complementado con un EDTA milimotora. Lleve a cabo este paso sólo si no se planifica ninguna tinción intracelular, de lo contrario pasar al aspecto de tinción intracelular del protocolo.

A continuación, transfiera cada muestra de subconjunto de monocitos al tubo FACS correspondiente apropiado sobre hielo protegido de la luz. Para la tinción intercelular de las células del panel del subconjunto de células T, vuelva a suspender los pellets en 200 microlitros de tampón de fijación de un kit de fijación y permeabilización adecuado para una incubación de 40 minutos a cuatro grados Centígrados protegidos de la luz. Al final de la incubación lavar las células dos veces con 200 microlitros de permeabilización tampón de lavado tampón y re-suspender los pellets en 100 microlitros del anticuerpo de interés o cóctel de control apropiado para una incubación de 40 minutos a cuatro grados Celsius protegido de la luz.

Luego, lave las células dos veces en 200 microlitros de tamplón de lavado de permeabilización por lavado. Y vuelva a suspender las células en 250 microlitros de FACS más búfer EDTA antes de transferir las muestras a los tubos FACS correspondientes apropiados sobre hielo protegido de la luz. Aquí, se puede observar la estrategia jerárquica de gating para el panel de subconjuntos de monocitos en células inmunitarias recogidas de la médula ósea de los animales tratados con DMM.

Los trolls no manchados se pueden utilizar para determinar los verdaderos negativos para la mancha viva muerta y las puertas se pueden ajustar cada vez que el experimento se lleva a cabo según sea necesario. En este análisis representativo, las células inmunitarias se aislaron de los tejidos sinoviales y se tiñeron con marcadores de superficie extracelulares, seis semanas después de la cirugía de control DMM o falsa. Se observa un mayor porcentaje de macrófagos positivos MHC2 y M2 positivos de Ly-SC en animales tratados con DMM en comparación con las poblaciones celulares observadas en ratones de cirugía falsa.

Aquí, se puede observar la estrategia jerárquica de gating para el panel de células T extra e intracelular en células inmunitarias aisladas del bazo de los animales tratados con DMM. Se observa un mayor porcentaje de células TH1 en los ganglios linfáticos y tejidos sinoviales de los animales DMM, así como un mayor número de células reguladoras de T y células TH17. Para garantizar la adquisición de muestras de alta calidad, los tejidos deben ser cosechados de una manera rápida, meticulosa y consistente.

Una vez que las células inmunitarias han sido aisladas, se pueden realizar otros análisis posteriores como RTPCR, cultivo celular y descansar sobre la sangre para arrojar luz sobre los procesos moleculares de interés.