Name: Análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células inmunitarias dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo de osteoartritis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Aprende citometría de flujo para identificar subconjuntos de células inmunitarias en bazo, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial de modelo murino de osteoartritis. Este protocolo permite caracterizar respuestas inmunitarias.

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Nos gustaría agradecer a Andrew Lim, Ph.D. y Giles Best, Ph.D. por su ayuda en la configuración del citómetro de flujo. Este proyecto fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) adjudicada a PH.

<ol><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology%2C+treatment%2C+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li>
<li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+in+Osteoarthritis%3A+Alterations+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356(2017).</li>
<li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+major+musculoskeletal+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li>
<li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-traumatic+osteoarthritis%3A+from+mouse+models+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li>
<li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research%3A+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li>
<li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis%3A+a+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li>
<li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Egyptian+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li>
<li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li>
<li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+and+Diagnostics+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li>
<li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+CD%284%29%28%2B%29+CD%282%29%285%29%28%2B%29+Foxp%283%29%28%2B%29+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%22%5BJournal%5D)">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li>
<li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29%2FhighCD127low%2F%28-%29+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane%2C+synovial+fluid+and+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97(2014).</li>
<li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li>
<li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li>
<li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li>
<li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li>
<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology%2C+treatment%2C+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li>
<li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+%28DMM%29+model+of+osteoarthritis+in+the+129%2FSvEv+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li>
<li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta%2C+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266(2017).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).</li>
<li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+osteoarthritis+models+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li>
<li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li>
<li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+mapping+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li>
<li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18(2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos descritos en este protocolo han sido diseñados y probados para identificar de forma fiable varios subconjuntos tanto de monocitos/macrofagos como de células T dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo murino de osteoartritis (OA). El protocolo actual se puede modificar fácilmente para investigar diferentes tipos de tejido u otros tipos de células mediante el intercambio de anticuerpos, y se puede utilizar para modelos murinos alternativos de OA. Al analizar otros ...

La osteoartritis (OA) es una enfermedad debilitante y dolorosa que involucra diversas patologías de todos los tejidos asociados con la articulación1. Afectando aproximadamente al 3,8% de la población mundial2,OA es una de las enfermedades musculoesqueléticas más prevalentes y se convertirá en la4a causa de discapacidad líder en todo el mundo para 20203. La OA postraumática ocurre después de una lesión articular y representa al menos el 12% de toda la OA y hasta el 25% de la OA en articulaciones susceptibles como la rodilla4,,5. Además, las lesiones articulares aumentan el riesgo de VA por más de cinco veces6. No todas las lesiones con una inestabilidad aparentemente similar desarrollarán OA, y por lo tanto los factores que definen el riesgo de OA a largo plazo sigue siendo difícil. Es crucial para desarrollar tratamientos eficaces para prevenir y/o tratar la OA postraumática, investigar y definir mejor la patología específica de la lesión, las causas y los mecanismos que predisponen a OA1.
OA y su definición de la destrucción del cartílago se atribuyó previamente por completo al estrés mecánico y, por lo tanto, OA se consideró una enfermedad no inflamatoria2. Sin embargo, estudios más recientes han demostrado una infiltración inflamatoria de membranas sinoviales y un aumento de las células inflamatorias en el tejido sinovial en pacientes con OA en comparación con controles saludables2,arrojando luz sobre un componente inflamatorio como una fuerza motriz potencial en OA. Otros estudios indicaron que las anomalías tanto en el perfil de células T CD4+ como en las de CD8+, así como en monocitos/macrofagos del sistema inmunitario innato, pueden contribuir a la patogénesis de OA2,,7. Las investigaciones detalladas sobre estas anomalías revelaron funciones relevantes para varios subconjuntos de células T2,tales como Th18, Th29, Th178 y T poblaciones reguladoras (Treg)10,11. A pesar de esta evidencia convincente, la relación causal entre la alteración de las respuestas de las células T y el desarrollo y progresión de OA todavía se desconoce2.
Además de que las células T específicas que desempeñan un papel en la OA, estudios recientes sugieren que los macrófagos polarizados/activados diferencialmente pueden estar asociados con la patogénesis de OA12. En particular, los macrófagos procedentes de monocitos sanguíneos se acumulan en el sinovium y se polarizan en macrófagos activados clásicamente (M1) o, alternativamente, macrófagos activados (M2) durante el desarrollo de OA, lo que implica una correlación entre los macrófagos derivados de monocitos y OA13. Por el contrario, ciertos subconjuntos de macrófagos pueblan los órganos a tiempo durante el desarrollo y sostenen sus números en una materia independiente de monocitos14. Recientemente, se mostró una función protectora conjunta mediada por una barrera de unión estrecha para estos macrófagos residentes en tejidos sinoviales (STRM)14. Estos hallazgos indican que las anomalías en subconjuntos de macrófagos particulares pueden desempeñar un papel crucial durante el desarrollo de la OA. Sin embargo, se desconocen las interacciones entre esta respuesta celular inflamatoria y los cambios estructurales en la articulación posterior al trauma.
Históricamente, el análisis de células inmunitarias en el tejido sinovial se limitó a la inmunohistoquímica (IHC) o a la expresión de ARNm mediante la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) se aproxima15,,16. Sin embargo, tanto IHC como RT-PCR carecen de la capacidad de identificar varios tipos de células diferentes y sus subconjuntos simultáneamente, limitando así la aplicabilidad de estos métodos. Además, IHC se limita al análisis de pequeñas muestras de tejido y puede perder las acumulaciones de células inflamatorias focales. En los últimos años, se han desarrollado una miríada de marcadores de superficie para varios tipos de células, y los subconjuntos de células inmunitarias ahora se pueden identificar de forma fiable mediante combinaciones distintas de estos marcadores. Debido al progreso técnico constante, los citometros de flujo ahora son capaces de identificar una multitud de fluorocromos diferentes simultáneamente permitiendo el análisis de grandes paneles de anticuerpos multicolores.
La citometría de flujo proporciona a los investigadores una técnica poderosa que permite la identificación y cuantificación simultáneas de una multitud de células inmunitarias y sus subconjuntos a nivel de célula única. Hemos desarrollado y optimizado tanto un ensayo de tinción extracelular para identificar monocitos/macrofagos y sus subconjuntos como un ensayo de tinción extra/intracelular para identificar las células T y sus subconjuntos dentro del bazo murino, la médula ósea, los ganglios linfáticos y el tejido sinovial. Cada paso de este protocolo fue optimizado y probado dando como resultado un ensayo altamente reproducible que se puede utilizar para otros modelos de ratón OA quirúrgicos y no quirúrgicos17.

<table><tbody><tr><td>APC anti-ratón CD194 (CCR4)</td><td>BioLegend</td><td>131212</td><td>T-Cell Panel T-Cell Tampón</td></tr><tr><td>Brillante Tampón Plus 1000Tst</td><td>BD</td><td></td><td>566385 Tampones</td></tr><tr><td>Viabilidad Fijable Tinción 510, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>564406</td><td>Panel de células T</td></tr><tr><td>Mancha de viabilidad fijable 510, 100 y micro; g</td><td>BD</td><td>564406</td><td>Panel de monocitos</td></tr><tr><td>Liberasa, Grado de Investigación</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>Enzima para tejido sinovial</td></tr><tr><td>Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>564985</td><td>Panel de monocitos</td></tr><tr><td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 y micro; g</td><td>BD</td><td>562454</td><td>Panel de monocitos</td></tr><tr><td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 y micro; g</td><td>BD</td><td>742274</td><td>panel de células T</td></tr><tr><td>Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 y micro; g</td><td>BD</td><td>565250</td><td>Panel de monocitos</td></tr><tr><td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 y micro; g</td><td>BD</td><td>563061</td><td>Panel de células T</td></tr><tr><td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>557596</td><td>Panel de células T</td></tr><tr><td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 y micro; g</td><td>BD</td><td>552775</td><td>Panel de células T</td></tr><tr><td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 y micro; g</td><td>BD</td><td>565480</td><td>Panel de celdas T</td></tr><tr><td>Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 y micro; g</td><td>BD</td><td>565261</td><td>Panel de células T</td></tr><tr><td>Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 y micro; g</td><td>BD</td><td>740664</td><td>Panel de células T</td></tr><tr><td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 y micro; g</td><td>BD</td><td>563687</td><td>Panel de monocitos</td></tr><tr><td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 y micro; g</td><td>BD</td><td>563332</td><td>Panel de células T</td></tr><tr><td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 y micro; g</td><td>BD</td><td>565411</td><td>Panel de monocitos</td></tr><tr><td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 &micro; g</td><td>BD</td><td>560408</td><td>Panel de células T</td></tr><tr><td>MS I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 y micro; g</td><td>BD</td><td>563414</td><td>Panel de monocitos</td></tr><tr><td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>560593</td><td>Panel de monocitos</td></tr><tr><td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 &micro; g</td><td>BD</td><td>560600</td><td>Panel de monocitos</td></tr><tr><td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 y micro; g</td><td>BD</td><td>564143</td><td>Panel de células T</td></tr><tr><td>Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 y micro; g</td><td>BD</td><td>562894</td><td>Panel de células T</td></tr><tr><td>Tampón de lisado de glóbulos rojos</td><td>N/A</td> Tampones N<td>/A</td><td>Tampones</td></tr> de factor <tr><td>de transcripción 100Tst</td><td>BD</td><td></td><td>562574 Tampones</td></tr></tbody></table>

análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células inmunitarias dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo de osteoartritis

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

La osteoartritis (OA) es una de las enfermedades musculoesqueléticas más frecuentes, que afecta a los pacientes que sufren de dolor y limitaciones físicas. La evidencia reciente indica un componente inflamatorio potencial de la enfermedad, con células T y monocitos/macrófagos potencialmente asociados con la patogénesis de OA. Otros estudios postularon un papel importante para subconjuntos de linajes celulares inflamatorios, como Th1, Th2, Th17 y linfocitos reguladores de T, y M1, M2 y macrófagos residentes en tejidos sinovium. Sin embargo, se desconoce la interacción entre la respuesta celular inflamatoria sinovial y sistémica local y los cambios estructurales en la articulación. Para entender completamente cómo las células T y los monocitos/macrofagos contribuyen hacia el OA, es importante ser capaz de identificar cuantitativamente estas células y sus subconjuntos simultáneamente en el tejido sinovial, los órganos linfáticos secundarios y sistémicamente (el bazo y la médula ósea). Hoy en día, los diferentes subconjuntos de células inflamatorias se pueden identificar mediante una combinación de marcadores de superficie celular haciendo de la citometría de flujo multicolor una técnica poderosa en la investigación de estos procesos celulares. En este protocolo, describimos pasos detallados con respecto a la cosecha de tejido sinovial y órganos linfáticos secundarios, así como la generación de suspensiones de una sola célula. Además, presentamos tanto un ensayo de tinción extracelular para identificar monocitos/macrofagos y sus subconjuntos, así como un ensayo de tinción extra e intracelular para identificar las células T y sus subconjuntos dentro del bazo murino, la médula ósea, los ganglios linfáticos y el tejido sinovial. Cada paso de este protocolo fue optimizado y probado, resultando en un ensayo altamente reproducible que se puede utilizar para otros modelos de ratón OA quirúrgicos y no quirúrgicos.

A continuación se describen los resultados representativos del panel de subconjuntos de monocitos y del panel de subconjuntos de células T.
La Figura 1 ilustra la estrategia jerárquica de gating para el panel de subconjuntos de monocitos en células inmunitarias recogidas de la médula ósea de animales tratados con DMM. La misma estrategia fue utilizada y verificada en todos los demás tipos de tejido. Al configurar el experimento, se determinó la tensión de área de ...

Aquí, describimos un protocolo de citometría de flujo detallado y reproducible para identificar subconjuntos de monocitos/macrofagos y células T utilizando ensayos de tinción extra e intracelular dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial, utilizando un modelo quirúrgico establecido de osteoartritis murina.

Análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células inmunitarias dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo de osteoartritis

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

Nuestro protocolo permite la identificación y análisis detallados de monocitos y macrófagos y células T y sus subconjuntos relevantes dentro de las neuronas y el ovo y varios otros tejidos del sistema inmunitario. Nuestra técnica facilita la recolección fiable de células inmunitarias de la vida del sinovium y otros tejidos relevantes para una caracterización completa de la respuesta inmune osteoartrítica. Para el aislamiento de los tejidos de interés de un ratón modelo osteoartritis, con el ratón en posición supina, limpiar el pecho, abdomen y piernas con 70%etanol.Usa tijeras para abrir cuidadosamente la piel a lo largo de la línea media del abdomen mientras dejas la cavidad abdominal intacta. Y tire suavemente de la piel en el lado derecho del animal lejos del músculo subyacente, dejando el tejido adiposo subcutáneo unido a la piel. Coloque el ratón bajo un microscopio diseccionado y use dos fórceps finos curvados para sacar suavemente el tejido adiposo situado en el muslo.Después de identificar los tres vasos cruzados, utilice fórceps de disección fina para extraer el ganglio linfático inguinal situado en la intersección de los vasos, teniendo cuidado de no romper la cápsula. Utilice los fórceps para extraer la grasa restante de la superficie del ganglio linfático y abrir la cavidad abdominal. Si no se observa grasa restante, coloque el ganglio linfático inmediatamente en una placa de seis pozos previamente preparada y etiquetada llena de 0,5 mililitros de medios RPMI.A continuación, abra la cavidad abdominal. Usa tijeras finas para extirpar el bazo y extraer suavemente los intestinos para exponer la aorta y su bifurcación. A partir de ahora, coloque el bazo inmediatamente en un medio RPMI previamente preparado y etiquetado con 0,5 mililitros de MEDIOS RPMI.Retire el ganglio linfático ilíaco situado en el segmento terminal de la aorta abdominal y el origen de la arteria ilíaca común y retire cuidadosamente la piel de ambas extremidades posteriores. Coloque inmediatamente el ganglio linfático en una construcción de placa de seis pozos previamente preparada y etiquetada con 0,5 mililitros de medios RPMI que agrupan todos los ganglios linfáticos de dos animales. Usando tijeras finas o un bisturí, limpie el fémur izquierdo del tejido muscular adjunto y desconecte cuidadosamente tanto la sofocación como la articulación de la cadera, dejando todo el hueso intacto mientras se retira el fémur.A continuación, se coloca el fémur en una placa de seis pozos previamente preparada y etiquetada llena de 0,5 mililitros de medios RPMI. Identifique el tendón de la rótula de la articulación de la asfixia derecha y utilice tijeras finas para eliminar el tejido muscular adyacente proximal a articulación hasta que se expongan aproximadamente cinco mililitros de tendón proximal del tendón de cuádriceps a la rótula. Cortar a través del tendón del cuádriceps aproximadamente de tres a cuatro milímetros proximal a la rótula para formar un mango y utilizar fórceps finos para tirar suavemente de la tensión de la articulación para exponer los bordes de la unión de la cápsula de la articulación.Comenzando con el fémur y moviéndose hacia la tibia, utilice un bisturí para cortar cuidadosamente a lo largo de los bordes de la cápsula articular en ambos lados mientras mantiene una tracción suave en el tendón del cuádriceps. Cuando el bloque de tejido sinovial se une sólo a la tibia, la almohadilla de grasa intraarticular debe ser claramente visible distal a la rótula y se puede separar suavemente de la articulación y el aspecto anterior de la Minsky. A continuación, corte a lo largo de la parte restante de la cápsula articular para extraer el bloque de tejido sinovial e inmediatamente colóquelo en una placa de seis pozos previamente preparada y etiquetada llena de 1,5 mililitros de medios RPMI.Cuando se hayan recogido todos los tejidos, coloque dos bazos agrupados por condición en un colador celular de 70 micrómetros en un tubo de 15 mililitros y utilice un émbolo estéril de jeringa de tres mililitros para la tasa de masa suave de los tejidos a través del filtro de malla que lava el colador con frecuencia con un total de seis mililitros de RPMI 1640 medio complementado con 10%FBS. Sedimentar las células por centrifugación, y volver a suspender el pellet en cinco mililitros de globo de lysis de glóbulos rojos. Después de cinco minutos, detenga la reacción con 10 mililitros de PBS y centrifugar las células.Cuando no se observan más glóbulos rojos, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS fresco para el recuento. Para el procesamiento de ganglios linfáticos coloque los cuatro ganglios linfáticos en un colador celular de 70 micrómetros en un nuevo tubo de 15 mililitros y utilice un nuevo émbolo estéril de tres mililitros para burlar suavemente los ganglios linfáticos a través de la malla en una sola suspensión celular, luego centrifugar las células a 500 veces G durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de PBS para el recuento. Para aislar la médula ósea, usa un fórceps de tejido para agarrar cuidadosamente el fémur intacto y usa tijeras afiladas para cortar el extremo del fémur proximal.Inserte una aguja de calibre 23 en el centro de la muesca intercondylar del fémur y gire la aguja mientras aplica una presión suave para perforar un agujero en la muesca. Cambiar la aguja según sea necesario, lavar el contenido óseo con seis mililitros de RPMI complementados con 10%FBS en un colador de células de 70 micrómetros en un nuevo tubo de 15 mililitros y utilizar un nuevo émbolo de jeringa de tres mililitros para presionar suavemente la médula ósea a través de la malla. A partir de ahora, realice el paso RBC como se muestra para el bazo.Cuando no se observan más glóbulos rojos, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de PBS fresco para el recuento. Para el procesamiento del tejido sinovial utilice tijeras quirúrgicas finas para cortar los dos bloques de tejido sinovial en trozos diminutos y transferir las muestras a un nuevo tubo de 15 mililitros. Enjuague el recipiente de recogida con 500 microlitros de medio para recoger las células restantes y los tejidos sinoviales y tire del lavado en el tubo de recogida de la muestra.A continuación, agregue un volumen suficiente de enzima para lograr en una concentración final de una unidad por mililitro y digerir la muestra de tejido sinovial a 37 grados Celsius en una incubadora durante dos horas de un rotador. Asegúrese de un movimiento suficiente al colocar los tubos en el rotador. Al final de la incubación, detener la digestión con ocho mililitros de RPMI complementados con 10%FBS y filtrar la suspensión celular a través de un colador celular de 70 micrómetros en un nuevo tubo de 15 mililitros.Enjuague el tubo viejo de 15 mililitros con cinco mililitros de medio y utilícelo para lavar el filtro. Luego, sedimentar las células por centrifugación y resuspender el pellet en 500 microlitros de PBS para el conteo. Para realizar la tinción de viabilidad de las células inmunitarias aisladas, agregue cinco veces 10 a las cinco células de cada suspensión celular a los pozos apropiados de dos placas diferentes de 96 pozos en U y recoja las células en la parte inferior de cada pozo.Incluya siempre suficientes células no manchadas de cada tipo de tejido como controles negativos. Lavar las células con 200 microlitros de PBS y volver a suspender los pellets en 100 microlitros de células en tinte reactivo de amina permeante por pozo durante una incubación de 15 minutos a cuatro grados centígrados protegidos de la luz. Al final de la incubación lavar las células dos veces en 200 microlitros de tampón FACS por lavado y re-suspender cada pellet en 100 microlitros del anticuerpo apropiado de interés o cóctel de control.Si tanto la tinción intra como la extracelular se lleva a cabo en el mismo realizar el paso de tinción extracelular ahora. Después de 30 minutos de incubación a cuatro grados Celsius protegidos de la luz lavar las células dos veces con 200 microlitros de tampón FACS por pozo y volver a suspender las células y la placa del panel del subconjunto de monocitos en 250 microlitros de tampón FACS complementado con un EDTA milimotora. Lleve a cabo este paso sólo si no se planifica ninguna tinción intracelular, de lo contrario pasar al aspecto de tinción intracelular del protocolo.A continuación, transfiera cada muestra de subconjunto de monocitos al tubo FACS correspondiente apropiado sobre hielo protegido de la luz. Para la tinción intercelular de las células del panel del subconjunto de células T, vuelva a suspender los pellets en 200 microlitros de tampón de fijación de un kit de fijación y permeabilización adecuado para una incubación de 40 minutos a cuatro grados Centígrados protegidos de la luz. Al final de la incubación lavar las células dos veces con 200 microlitros de permeabilización tampón de lavado tampón y re-suspender los pellets en 100 microlitros del anticuerpo de interés o cóctel de control apropiado para una incubación de 40 minutos a cuatro grados Celsius protegido de la luz.Luego, lave las células dos veces en 200 microlitros de tamplón de lavado de permeabilización por lavado. Y vuelva a suspender las células en 250 microlitros de FACS más búfer EDTA antes de transferir las muestras a los tubos FACS correspondientes apropiados sobre hielo protegido de la luz. Aquí, se puede observar la estrategia jerárquica de gating para el panel de subconjuntos de monocitos en células inmunitarias recogidas de la médula ósea de los animales tratados con DMM.Los trolls no manchados se pueden utilizar para determinar los verdaderos negativos para la mancha viva muerta y las puertas se pueden ajustar cada vez que el experimento se lleva a cabo según sea necesario. En este análisis representativo, las células inmunitarias se aislaron de los tejidos sinoviales y se tiñeron con marcadores de superficie extracelulares, seis semanas después de la cirugía de control DMM o falsa. Se observa un mayor porcentaje de macrófagos positivos MHC2 y M2 positivos de Ly-SC en animales tratados con DMM en comparación con las poblaciones celulares observadas en ratones de cirugía falsa.Aquí, se puede observar la estrategia jerárquica de gating para el panel de células T extra e intracelular en células inmunitarias aisladas del bazo de los animales tratados con DMM. Se observa un mayor porcentaje de células TH1 en los ganglios linfáticos y tejidos sinoviales de los animales DMM, así como un mayor número de células reguladoras de T y células TH17. Para garantizar la adquisición de muestras de alta calidad, los tejidos deben ser cosechados de una manera rápida, meticulosa y consistente.Una vez que las células inmunitarias han sido aisladas, se pueden realizar otros análisis posteriores como RTPCR, cultivo celular y descansar sobre la sangre para arrojar luz sobre los procesos moleculares de interés.

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Análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células inmunitarias dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo de osteoartritis (Video) | JoVE Journal

Análisis de citometría de flujo de subconjuntos de células inmunitarias dentro del bazo murino, médula ósea, ganglios linfáticos y tejido sinovial en un modelo de osteoartritis

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