Name: Una plataforma de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) para investigar enzimas biosintéticas péptidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Aprende a utilizar HDX-MS para estudiar la dinámica conformacional de sintetasas de lantipéptidos en condiciones casi nativas. Este método identifica regiones funcionales importantes en enzimas biosintéticas.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá, los Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, la Fundación Canadiense para la Innovación y los fondos de puesta en marcha de la Universidad McGill.

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<li>Marion, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+the+overlap+problem+in+the+assignment+of+proton+NMR+spectra+of+larger+proteins+by+use+of+three-dimensional+heteronuclear+proton-nitrogen-15+Hartmann-Hahn-multiple+quantum+coherence+and+nuclear+Overhauser-multiple+quantum+coherence+spectroscopy%3A+application+to+interleukin+1.beta%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta.</a> Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).</li>
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<li>Burkitt, W., O'Connor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).</li>
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</ol>

No tenemos nada que revelar.

El flujo de trabajo HDX-MS presentado en este protocolo proporciona una plataforma notablemente robusta para mapear la distribución espacial de elementos estructuralmente dinámicos en proteínas y para investigar cómo estas dinámicas cambian en respuesta a la perturbación (unión de ligando, mutagénesis enzimática, etc.). HDX-MS tiene varias ventajas distintas sobre otros enfoques de biología estructural que se utilizan comúnmente para investigar la dinámica de conformación. En particular, sólo se necesitan pequeñas cantid...

Las proteínas son moléculas estructuralmente dinámicas que muestras de diferentes conformaciones en escalas de tiempo que van desde la vibración de unión a escala femtosecond hasta reordenamientos de dominios proteicos enteros que pueden ocurrir durante muchos segundos1. Estas fluctuaciones de conformación suelen ser aspectos críticos de la función enzimática/proteica. Por ejemplo, los cambios de conformación inducidos por la unión de ligando suelen ser de vital importancia para modular la función enzimática, ya sea organizando los residuos activos del sitio necesarios para la catálisis, definiendo sitios de unión de sustratos en mecanismos cinéticos secuenciales, protegiendo los intermediarios reactivos del medio ambiente o modulando la función enzimática a través de redes alotéricas. Estudios recientes también han demostrado que la dinámica de conformación se puede conservar a lo largo de la evolución y que las perturbaciones a los movimientos moleculares conservados pueden correlacionar con cambios en la especificidad del sustrato y la aparición de nuevas funciones enzimáticas2,3.
En los últimos años, la espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) ha surgido rápidamente como una poderosa técnica para sondear cómo los paisajes de conformación de proteínas responden a perturbaciones como la unión de ligando o la mutagénesis4,5,6,7. En un experimento típico de HDX-MS(Figura 1),una proteína de interés se coloca en amortiguador preparado en D2O, lo que desencadena la sustitución de protones intercambiables con disolventes con deuteria. El tipo de cambio de la mitad de la mitad de los bonos de péptido depende fuertemente del pH, la secuencia local de aminoácidos, y del entorno estructural local de la mitad8. Las amides que se dedican a interacciones de unión al hidrógeno (como las presentes en α-helices y β hojas) intercambian más lentamente que en medio de regiones no estructuradas de la proteína que están expuestas a disolvente a granel. Por lo tanto, el alcance de la captación de deuterio es un reflejo de la estructura de la enzima. Se espera que las enzimas que son dinámicas de forma conformación, o que se someten a transiciones estructurales en la unión a los ligandos, produzcan una respuesta HDX medible.
La base mecanicista para el tipo de cambio lento de un medio estructurado se muestra en la Figura 25,8,9. Para someterse a HDX, la región estructurada primero debe muestrear transitoriamente una conformación desplegada, de manera que las moléculas solventes que catalizan el intercambio HDX a través de un mecanismo químico específico ácido/base, tengan acceso a la entresuela intercambiable. En última instancia, las magnitudes relativas del tipo de cambio químico (kchem) y las tasas de plegado y reencarnamiento (kopen y kclose) determinan la tasa HDX medida en el experimento5,8. A partir de este sencillo modelo cinético, está claro que el alcance de la captación de deuterio reflejará la dinámica de conformación subyacente (definida por kopen y kclose). La mayoría de los experimentos HDX-MS se realizan en un flujo de trabajo ascendente donde, tras la reacción de intercambio, la proteína de interés se digiere en péptidos y la captación de deuterio por cada péptido se mide como un aumento de la masa7. De esta manera, HDX-MS permite mapear perturbaciones a la dinámica de conformación enzimática en la escala espacial local de péptidos, lo que permite al investigador evaluar cómo la perturbación altera la dinámica en diferentes regiones de la enzima de interés.
Las ventajas del enfoque HDX-MS para dilucidar la dinámica estructural de las proteínas son numerosas. En primer lugar, el método se puede realizar con pequeñas cantidades de proteína nativa o en complejos proteicos en sistemas con estructura cuaternaria10. Ni siquiera es necesario que la preparación enzimática utilizada en el ensayo sea altamente purificada11,12, siempre y cuando el flujo de trabajo hdx-MS de abajo hacia arriba proporcione un número suficiente de péptidos identificados con confianza que cubren la secuencia de proteínas de interés. Además, HDX-MS puede proporcionar información sobre la dinámica de conformación en condiciones casi nativas sin la necesidad de etiquetado proteico específico del sitio, como se utilizaría en los estudios de fluorescencia de molécula única13,y no hay límite de tamaño para el complejo proteico o proteico que se puede investigar (lo que hace que enfoques como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear [NMR] sean desafiantes)7,14. Por último, se pueden emplear métodos HDX-MS resueltos en el tiempo para estudiar proteínas intrínsecamente desordenadas, que son difíciles de estudiar con cristalografía de rayos X15,16,17,18. La principal limitación de HDX-MS es que los datos son de baja resolución estructural. Los datos HDX-MS son útiles para señalar dónde están cambiando las dinámicas de conformación y para revelar cambios de conformación acoplados, pero a menudo no proporcionan mucha información sobre el mecanismo molecular preciso que impulsa el cambio observado. Los recientes avances en la combinación de métodos de disociación de captura de electrones con datos de proteínas HDX-MS han demostrado ser prometedores para mapear sitios de intercambio a residuos de aminoácidos individuales19,pero a menudo se necesitan estudios bioquímicos y estructurales de seguimiento para proporcionar claridad a los modelos estructurales reenviados por datos de HDX-MS.
A continuación, se presenta un protocolo detallado para el desarrollo de un ensayo HDX-MS20. Los protocolos de preparación de muestras que se presentan a continuación deben aplicarse generalmente a cualquier proteína que muestre una buena solubilidad en tampones acuosos. Los métodos de preparación de muestras más especializados y los flujos de trabajo HDX-MS están disponibles para proteínas que necesitan ser ensayos en presencia de detergente o fosfolípidos21,22,23,24. Los ajustes instrumentales para la recopilación de datos HDX-MS se describen para un espectrómetro de masa de tiempo de vuelo de cuadrúpeda de alta resolución acoplado al sistema de cromatografía líquida. Los datos de complejidad y resolución similares podrían recopilarse en cualquiera de una serie de sistemas de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) disponibles comercialmente. También se proporcionan aspectos clave del procesamiento de datos mediante un paquete de software disponible comercialmente. También presentamos directrices para la recopilación y el análisis de datos que sean coherentes con las recomendaciones formuladas por la comunidad más amplia de HDX-MS12. El protocolo descrito se utiliza para estudiar las propiedades estructurales dinámicas de HalM2, una sintátida de lanthipéptido que cataliza la maduración multipaso de un producto natural de péptido antimicrobiano20. Ilustramos cómo HDX-MS se puede utilizar para revelar sitios de enlace de sustratos y propiedades alotéricas que han eludido la caracterización anterior. Varios otros protocolos sobre proteína HDX-MS se han publicado en los últimos años25,26. Junto con el trabajo actual, estas contribuciones anteriores deberían proporcionar al lector cierta flexibilidad en el diseño experimental.

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes></fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[glu-1]-fibrinopéptido B (Glu-Fib)</td><td>BioBasic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL Amicon Ultracel 10k dispositivo de filtración centrífuga (Millipore)</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrilo</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647-25MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>SIGMA</td><td>a2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>ALDRICH</td><td>435767-100G</td><td></td></tr><tr><td>ácido fórmico</td><td>Thermo Fisher</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>guanidina-HCl</td><td>VWR</td><td>97063-764</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>SiGMA-Aldrich</td><td>63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de</td> <td>potasioFosfato de potasio BioBasic</td><td>PB0440</td> El péptido de T012500 de Clorhidrato de TRC Canadá BioBasic PB0445 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>TCEP se sintetizó a pedido</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre del material/equipo</td><td>Compañía</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments/Description</td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deuteros</td><td>Andy M C Lau, et al</td><td>versión 1.08</td><td></td></tr><tr><td>DynamX</td><td>Waters</td><td>versión 3.0</td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters</td><td>versión 4.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lynx Global Server (PLGS)</td><td>Waters</td><td>versión 3.0.3</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml; versión</td><td>2.2.2</td><td></td></tr><tr><td>Nombre del Material/ Equipo</td><td>Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios/Descripción</td></tr><tr><td>Instrumentos y equipos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18 analítica Aguas</td><td>de columna</td><td>186002346</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Precolumna</td><td>de Waters</td><td>186003978</td><td></td></tr><tr><td>Sistema ACQUITY UPLC M-Class HDX</td><td>Waters</td> HDX Manager <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrodo de pH de micropunta Thermo</td><td>Fisher</td><td>13-620-291</td><td></td></tr><tr><td>Waters Enzymate BEH columna o pepsina solumn</td><td>Waters</td><td>186007233</td><td></td></tr><tr><td>Waters Synapt Aguas</td><td></td><td></td><td></td> G2-Si</tr></tbody></table>

una plataforma de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (hdx-ms) para investigar enzimas biosintéticas péptidos

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

La espectrometría de masas de intercambio de deuterio de hidrógeno (HDX-MS) es un potente método para la caracterización biofísica de los cambios de conformación enzimática y las interacciones enzima-sustrato. Entre sus muchos beneficios, HDX-MS consume sólo pequeñas cantidades de material, se puede realizar en condiciones casi nativas sin necesidad de etiquetado enzimático/sustrato, y puede proporcionar información resuelta espacialmente sobre dinámicas de conformación enzimática, incluso para enzimas grandes y complejos multiproteína. El método se inicia mediante la dilución de la enzima de interés en tampón preparado en D2O. Esto desencadena el intercambio de protium en cruces de bonos péptidos (N-H) con deuterio (N-D). En los puntos de tiempo de intercambio deseados, las alícuotas de reacción se enfadan, la enzima se proteica en péptidos, los péptidos están separados por cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC), y el cambio en la masa de cada péptido (debido al intercambio de hidrógeno por deuterio) es registrado por LA. La cantidad de captación de deuterio por cada péptido depende en gran medida del entorno local de unión al hidrógeno de ese péptido. Péptidos presentes en regiones muy dinámicas del deuterio de intercambio de enzimas muy rápidamente, mientras que péptidos derivados de regiones bien ordenadas se intercambian mucho más lentamente. De esta manera, la tasa HDX informa sobre la dinámica de conformación de enzimas locales. Las perturbaciones a los niveles de captación de deuterio en presencia de diferentes ligandos se pueden utilizar para mapear sitios de unión de ligando, identificar redes alotéricas y comprender el papel de la dinámica de conformación en la función enzimática. Aquí, ilustramos cómo hemos utilizado HDX-MS para entender mejor la biosíntesis de un tipo de productos naturales péptidos llamados lanthipeptides. Los lanthipeptides son péptidos genéticamente codificados que son modificados post-traslacionalmente por enzimas grandes, multifuncionales y dinámicas conformadamente que son difíciles de estudiar con enfoques tradicionales de biología estructural. HDX-MS proporciona una plataforma ideal y adaptable para investigar las propiedades mecanicistas de este tipo de enzimas.

Es necesario evaluar la calidad de la digestión proteótica y la reproducibilidad del flujo de trabajo para cada conjunto de inyecciones de muestra. Por lo tanto, antes de realizar ensayos HDX-MS, es esencial establecer condiciones efectivas para la proteolisis de la proteína de interés, para la separación de péptidos utilizando cromatografía líquida en fase inversa y movilidad de iones de fase de gas, y para la detección de péptidos utilizando EM. A tal fin, las muestras de referencia para la proteína de interés (recogid...

Las síntesis de lanthipeptide catalizan las reacciones multipaso durante la biosíntesis de productos naturales péptidos. Aquí, describimos un flujo de trabajo continuo, ascendente, de intercambio de hidrógeno-deuterio de espectrometría de masas (HDX-MS) que se puede emplear para estudiar la dinámica de conformación de las sintesis de lanthipeptide, así como otras enzimas similares implicadas en la biosíntesis de productos naturales péptidos.

Una plataforma de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) para investigar enzimas biosintéticas péptidos

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Este protocolo puede proporcionar información especialmente resuelta sobre la dinámica conformacional de las proteínas. Lo que puede ayudar a identificar regiones funcionalmente importantes en la proteína de interés. Esta técnica explora la dinámica conformacional de las proteínas en condiciones casi nativas.Sin necesidad de marcaje de proteínas utilizando cantidad nanomolar de material para cada reacción. Comience preparando muestras de referencia no deuteradas para la proteína de interés por triplicado, en tubos de 500 microlitros. Enfríe las muestras con el volumen adecuado de tampón de enfriamiento por tubo para lograr una lectura del medidor de pH de 2,5.Congele rápidamente las muestras en nitrógeno líquido para almacenarlas a menos 80 grados centígrados hasta su análisis. A continuación, analice las muestras de referencia de enzimas protiadas utilizando un flujo de trabajo de espectrometría de masas de cromatografía líquida ascendente de acuerdo con los protocolos estándar. Analizar los datos brutos de espectrometría de masas en el programa de software Proteomic adecuado.Vaya a Bibliotecas y bancos de datos de secuencias de proteínas para importar la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés. Introduzca un nombre para la secuencia de proteínas de interés e importe la secuencia de proteínas en formato FASTA. Para definir los parámetros de procesamiento en el menú Biblioteca, seleccione Electrospray MSE como tipo de adquisición de datos.En el campo Bloquear masa para carga 2, introduzca 785,8426 para la relación de carga maestra para los dos iones más de glucano una fibra sin péptido B y haga clic en Finalizar. Para definir los parámetros del flujo de trabajo, seleccione Electrospray MSE para el tipo de búsqueda. En el encabezado Consulta de búsqueda de flujo de trabajo y base de datos, seleccione la proteína de base de datos creada en el campo Banco de datos y cambie el reactivo de resumen principal a no específico.Para borrar el campo de reactivo modificador fijo, mantenga presionado el botón de control mientras hace clic en Carbamidometilo C.To especificar el directorio de salida, seleccione Opciones, Configuración de automatización e Identificar E.A continuación, marque las casillas de salida de ápice 3D y péptido 3D y salida de contabilidad de iones. Y especifique el directorio deseado. Para procesar los datos de muestra a los que se hace referencia, haga clic con el botón derecho en la placa de microtitulación para crear una nueva placa.Haga clic con el botón izquierdo en un pocillo y arrastre a otros tres pocillos para resaltar un pocillo para cada muestra a la que se hace referencia. A continuación, haga clic con el botón derecho y seleccione Agregar datos sin procesar. En la ventana, navegue hasta el directorio que contiene los tres archivos a los que se hace referencia y seleccione los tres archivos al mismo tiempo.Haga clic en Siguiente y seleccione los parámetros de procesamiento definidos. Haga clic en Siguiente de nuevo y seleccione los parámetros de flujo de trabajo definidos. A continuación, haga clic en Finalizar.Una vez que los datos sin procesar, los parámetros de procesamiento y los parámetros de flujo de trabajo se hayan asignado a cada pocillo de la placa, los pocillos se volverán azules. Seleccione los pozos, haga clic con el botón derecho y seleccione Procesar los datos sin procesar más recientes. Para realizar un seguimiento del procesamiento de los datos, haga clic en la esquina inferior derecha de la ventana.Cuando no aparece ningún trabajo para ejecutar, el procesamiento se completa y los pocillos de la placa de microtitulación se volverán verdes. Haga clic con el botón derecho en los pozos y seleccione Ver resultados del flujo de trabajo. Se abrirá una ventana separada para cada archivo de datos al que se haga referencia.Inspeccione los datos para asegurarse de que la mayoría de las señales de espectrometría de masas en los datos de muestra referenciados se hayan mapeado correctamente con los péptidos predichos a partir de la digestión in silico de la proteína de interés. Los péptidos coincidentes aparecerán en azul en el espectro de salida. Haga doble clic en el filtro correcto y verifique que el porcentaje de cobertura sea superior al 99%Importe la salida del software Proteomic en el software de procesamiento de intercambio de hidrógeno y deuterio para un umbral adicional.Y haga clic en Datos e importar los resultados de PLGS. Haga clic en el icono Agregar y navegue hasta el directorio apropiado para seleccionar los archivos de datos procesados. Haga clic en Siguiente y establezca el mínimo de iones consecutivos en mayor o igual que dos.El error de masa a cinco partes por millón. Y el umbral de archivos a tres, luego haga clic en Finalizar. Para llevar a cabo reacciones de intercambio de hidrógeno y deuterio, alícuota de enfriamiento tampón en tubos de 500 microlitros.Y centrifugar brevemente para transferir todo el tampón de enfriamiento al fondo de cada tubo. Coloque los tubos que contienen la solución enfriada sobre hielo. A continuación, premezcle todos los componentes de la reacción deuterada en un tubo separado de 1,5 mililitros.Luego transfiera la mezcla de reacción a un baño de agua a temperatura controlada de 25 grados Celsius para una incubación de 10 minutos. Agregue enzima a los componentes de la reacción deuterada para iniciar la reacción de intercambio. Mezcle bien el contenido de la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo.En los puntos de tiempo de intercambio experimental apropiados, elimine 50 alícuotas de microlitros de cada reacción de intercambio de hidrógeno y deuterio. Y mezcle las reacciones de forma rápida y uniforme con una alícuota de tampón de enfriamiento helado en tubos individuales de 500 microlitros. A continuación, tapone inmediatamente los tubos para la congelación instantánea en nitrógeno líquido.Almacene las muestras a menos 80 grados centígrados hasta que estén listas para el análisis. Después de descongelar las muestras congeladas, analice las muestras de referencia de enzimas deuteradas utilizando el mismo flujo de trabajo de especificación de masas de cromatografía líquida ascendente desarrollado para las muestras de referencia no deuteradas. Después de recopilar los datos LCMS para las muestras deuteradas, importe los datos en el proyecto de intercambio de hidrógeno y deuterio creado anteriormente para el procesamiento de datos.Y haga clic en Nuevo estado y Nueva exposición para definir los estados bioquímicos y los tiempos de exposición al deuterio, respectivamente, pertinentes para el análisis. Haga clic en Nuevo sin procesar para seleccionar los archivos de datos de intercambio de hidrógeno y deuterio que se van a analizar. Y asigne los tiempos de intercambio y el estado bioquímico adecuados a cada archivo de datos sin procesar que se importe.Para el análisis y la visualización de los datos, seleccione el primer péptido de la lista de péptidos y abra el gráfico espectral apilado en el menú Vistas. Haga clic con el ratón para asignar y anular la asignación de barras según sea necesario para asegurarse de que se ha localizado la distribución de isótopos adecuada en los datos. Y que se le ha asignado cada pico de isótopo.Para comprobar las asignaciones de varillas para cada estado de carga, alterne el estado de carga en la parte superior de la ventana de gráfico espectral apilado. Para comprobar la desviación estándar de los valores de absorción del péptido deuterio en el menú Vistas, seleccione el mapa de cobertura. Que muestra cada péptido en la lista de péptidos mapeados a lo largo de la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés.Colorea los péptidos según la desviación estándar relativa y busca visualmente en el mapa péptidos atípicos con la desviación estándar relativa alta. Haga clic en los péptidos atípicos en el mapa de cobertura para rellenar los gráficos espectrales apilados y la ventana del visor de datos con el péptido objetivo. Muestre la diferencia de interés en el mapa de cobertura y haga clic con el botón derecho en el mapa para exportar los datos de diferencia a un archivo CSV.Importe los datos de diferencia, estado y el archivo PDB de la proteína de interés en Deuteros. Y seleccione el intervalo de confianza del 99% y Habilitar suma y procese los datos. A continuación, en pi mol, seleccione Exportar, Absorción y Exportar para generar un script PyMOL para mapear las regiones de diferencia de intercambio significativa en la estructura PDB de la proteína de interés en el software PyMOL.Estos cromatogramas representativos de iones totales para tres muestras de referencia de péptido lambda sintetasa Hal-M2 muestran los cambios dependientes del tiempo en la suma de todos los recuentos de iones en todos los valores de relación masa-carga incluidos en el escaneo espectral de masas. La forma y la intensidad del perfil del cromatograma iónico total deben ser similares. Lo que indica que la digestión proteolítica de Hal-M2 es reproducible.Y tiene una eficiencia similar en las tres muestras de referencia. Los espectros de masas en un intervalo de tiempo dado también deben ser similares. Proporcionando la confianza de que péptidos similares están presentes dentro de cada muestra y están aludiendo en momentos similares desde la columna C18.La mayoría de los péptidos en las muestras intercambiadas de deuterio deberían exhibir cambios obvios en sus distribuciones isotópicas hacia valores más altos de relación masa-carga. Por ejemplo, estos datos indican que una fracción sustancial de la etiqueta de deuterio se mantuvo durante todo el curso de la recopilación de datos de espectrometría de masas de enfriamiento ácido, digestión de pepsina y cromatografía líquida. Después de la caracterización de las propiedades bioquímicas de la enzima como se ha demostrado, se pueden generar resultados representativos de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno y deuterio como estos.Para ilustrar la unión del péptido precursor Hal-A2 al complejo Hal-M2 AMP, PMP. Las reacciones de intercambio de hidrógeno y deuterio deben prepararse y enfriarse de manera consistente. Y debe ser metódico a la hora de determinar los valores de intercambio de deuterio para numerosos péptidos detectados.La espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno y deuterio proporciona información a nivel de péptidos y cambios dinámicos en la conformación de proteínas. La relevancia funcional de cualquier intercambio de hidrógeno y deuterio debe validarse para Meter Genesis. Y ensayos de actividad ortogonal.

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MALDI-TOF espectrometría de masas fue utilizada con éxito para controlar la amida hidrógeno / deuterio cambio en la activación de proteína quinasa Pak2.

Amida de hidrógeno / deuterio intercambio y MALDI-TOF análisis de espectrometría de masas de Pak2 activación

Conformación de la proteína y la dinámica son claves para entender la relación entre estructura y función de proteínas. Intercambio de hidrógeno acoplada a espectrometría de masas de alta resolución es un método versátil para estudiar la dinámica conformacionales de proteínas, así como la caracterización de la proteína-ligando y proteína-proteína interacciones, incluidas las interfaces de contacto y los efectos alostéricos.

El análisis de dinámica de proteínas utilizando hidrógeno Intercambio de Espectrometría de Masas

Aquí, presentamos protocolos detallados para la espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio amida de estado sólido (ssHDX-MS) y la espectrometría de masas de marcado fotolítico de estado sólido (ssPL-MS) para proteínas en polvos sólidos. Los métodos proporcionan información de alta resolución sobre la conformación de proteínas y las interacciones en el estado sólido amorfo, que puede ser útil en el diseño de formulaciones.

Espectrometría de masas enfoque para estudiar la estructura de la proteína y las interacciones en liofilizadas Polvos

flexibilidad conformacional desempeña un papel crítico en la función de la proteína. En este documento, se describe el uso de la espectrometría de masas de ionización por electrospray resuelta en el tiempo junto con el intercambio de hidrógeno-deuterio para sondear los rápidos cambios estructurales que impulsan función en proteínas ordenadas y desordenadas.

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Una de las más difíciles condiciones de estrés que organismos durante toda su vida consiste en la acumulación de oxidantes. Durante el estrés oxidativo, las células dependen pesadamente chaperonas moleculares. Aquí, presentamos los métodos utilizados para investigar la regulación redox agregación de la actividad, así como para dar seguimiento a los cambios estructurales que rigen la función de chaperona con HDX-MS.

Definición acompañante Regulación Redox actividad de Hsp33 y mapeo de cambios conformacionales en la Hsp33 mediante espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio

Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de intercambio de hidrógeno / deuterio (HDX) basado en electroforesis capilar junto con espectrometría de masas de arriba hacia abajo. Este enfoque caracteriza la diferencia en las estructuras de orden superior entre diferentes especies de proteínas, incluidas proteínas en diferentes estados y diferentes proteoformas, mediante la realización de HDX diferencial concurrente y separación electroforética.

Intercambio de hidrógeno/deuterio basado en electroforesis capilar para la caracterización conformacional de proteínas con espectrometría de masas de arriba hacia abajo

El conjunto estructural de la alfa-sinucleína monomérica afecta su función fisiológica y sus propiedades fisicoquímicas. El presente protocolo describe cómo realizar espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos y análisis de datos posteriores para determinar información conformacional sobre el monómero de esta proteína intrínsecamente desordenada en condiciones fisiológicas.

Espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos para el estudio de la dinámica estructural de la alfa-sinucleína en condiciones fisiológicas

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

gotitas de lípidos son orgánulos importantes para la replicación de varios patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC). Se describe un método para aislar las gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas; se puede utilizar bajo una variedad de condiciones, tales como infección por el virus, el estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.

Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

Diferentes métodos para manipular arquitectura tridimensional en Hidrogeles basados en proteína se evalúan aquí con respecto a las propiedades del material. Las redes macroporoso son funcionalizadas con un péptido de la célula-adhesivo, y se evalúa su viabilidad en cultivo de células utilizando dos líneas celulares de diferentes modelos.

Fácil manipulación de arquitecturas en Hidrogeles basados en proteínas para aplicaciones de la cultura de célula

Aprende a utilizar HDX-MS para estudiar la dinámica conformacional de sintetasas de lantipéptidos en condiciones casi nativas. Este método identifica regiones funcionales importantes en enzimas biosintéticas.

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Una plataforma de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) para investigar enzimas biosintéticas péptidos

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