Configuración de Espectrometría de Masas De Plasma Acoplada Inductivamente Electroforesistiva (CE-ICP-MS) para Cuantificación de Especies redox de Hierro (Fe(II), Fe(III))
4 de mayo de 2020
Este método de especiación redox de hierro se basa en la espectrometría de masas plasmáticas acoplada inductivamente por electroforesis capilar con apilamiento de muestras combinada con análisis cortos en una sola ejecución. El método analiza rápidamente y proporciona bajos límites de cuantificación para las especies de redox de hierro en una amplia gama de tejidos y muestras de biofluidos.
El hierro excesivo da como resultado hierro rojoox-activo libre dos-plus que puede causar efectos devastadores dentro de la célula, como estrés oxidativo y muertes celulares por peroxidación lipídica conocida como ferroptosis. Las mediciones cuantitativas de hierro ferroso y férrico son la clave para una visión más detallada de estos procesos perjudiciales. Esta técnica CE-ICP-Ms proporciona tanto:análisis rápido y límites de cuantificación bajos, que son necesarios para cuantificar especies de hierro-redox.
Comience seleccionando un nebulizador con un bajo volumen de aspiración y preparando las piezas adecuadas para montar la interfaz casera. Conecte dos conectores luer hembra de tres vías con un conector de luer de cono macho conectando el extremo izquierdo de la barra de luer de tres vías inferior al conector macho y el conector macho a la conexión media del luer de tres vías superior. A continuación, coloque un tubo de un centímetro sobre el alambre de platino y utilice un tubo de silicona de un centímetro para conectar el primer tubo y la boquilla de un conector luer macho.
Fije el ensamblaje a la conexión central del conector luer de tres vías inferior mediante la rotación del tornillo. Empuje un tubo de un centímetro sobre la salida del capilar CE y colóquelo en ocho a nueve centímetros desde el extremo, luego conéctelo a la boquilla del conector macho con un tubo de silicona. Coloque todo el conjunto a través de la barra del conector T de tres vías superior y fije el conector de luer macho y el extremo izquierdo del conector luer de tres vías hembra mediante rotación de tornillo.
A continuación, fije el tubo de silicona de 25 centímetros en la boquilla de un conector de luer macho y fije todo el conjunto en la parte inferior de la barra desde el conector de señuelo de tres vías inferior. Empuje firmemente el tubo de silicona de un centímetro, cinco milímetros sobre el extremo del nebulizador. Mientras que el segundo conector de cono luer macho está conectado a la parte saliente del tubo.
Mueva la parte de la interfaz con el capilar CE saliente al cono macho en el nebulizador, luego inserte cuidadosamente el capilar a través del cono masculino y la parte más ancha del capilar del nebulizador. Si es necesario, ajuste la longitud del capilar saliente desenroscando el luer macho izquierdo, moviendo el luer con los tubos conectados en la posición requerida y reinstalándolo. Los conectores luer hembra superiores deben ajustarse firmemente al cono macho.
Cuando termine con la configuración proceda con el ICP-Ms. Se crearon curvas de calibración para el hierro tres y hierro dos especies de redox. Los límites de detección fueron de 3,1 microgramos por litro para el hierro dos y 3,2 microgramos por litro para el hierro tres y se demostró linealidad de hasta 150 microgramos por litro.
El análisis del lysato celular SH-SY5Y mostró una migración ligeramente más lenta para las especies de redox de hierro debido a la conductividad algo mayor. Las concentraciones medidas de hierro tres y hierro dos fueron 330 microgramos por litro y 84 microgramos por litro, respectivamente. Resultando en una relación de hierro de dos a tres de 0.25.
El paso más importante de este protocolo es la cuidadosa inserción del capilar CE saliente a través de la interfaz montada y su posicionamiento adecuado relacionado con el capilar del nebulizador. Los métodos aquí presentados pueden convertirse en una herramienta prometedora para profundizar la visión de los procesos moleculares dependientes del hierro. Se necesitan estudios cuidadosamente diseñados para validar si la cuantificación de hierro de dos más y tres plus puede servir como un biomarcador potencial para identificar el tejido en riesgo de daño letal mediado por hierro en el contexto de enfermedades neurodegenerativas y cancerosas.
Descripción general
Este estudio presenta un novedoso método de especiación redox del hierro que utiliza electroforesis capilar acoplada a espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (CE-ICP-MS). Esta técnica permite un análisis rápido y bajos límites de cuantificación de especies redox del hierro en diversos tejidos y biofluidos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Química analítica
Antecedentes
- El exceso de hierro puede provocar estrés oxidativo y muerte celular.
- La medición cuantitativa del hierro ferroso y férrico es fundamental para comprender estos procesos.
- La ferroptosis es una forma de muerte celular asociada con la sobrecarga de hierro.
- Los métodos existentes pueden no ofrecer la velocidad y sensibilidad necesarias para la cuantificación del hierro.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método rápido y sensible para cuantificar especies redox del hierro.
- Investigar las implicaciones de la cuantificación del hierro en enfermedades neurodegenerativas y cancerosas.
- Validar el potencial de la cuantificación del hierro como biomarcador de daño tisular.
Métodos Utilizados
- Espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente y electroforesis capilar (CE-ICP-MS).
- Preparación de muestras que implica el ensamblaje de una interfaz casera.
- Curvas de calibración para las especies redox de hierro dos y hierro tres.
- Análisis del lisado de células SH-SY5Y para la medición de la concentración de hierro.
Resultados principales
- Los límites de detección fueron de 3,1 µg/L para hierro dos y de 3,2 µg/L para hierro tres.
- Se observó una respuesta lineal hasta 150 µg/L.
- Las concentraciones medidas fueron de 330 µg/L para hierro tres y de 84 µg/L para hierro dos.
- Se encontró que la relación entre hierro dos y tres fue de 0,25.
Conclusiones
- El método desarrollado es prometedor para estudiar procesos moleculares dependientes del hierro.
- Un ajuste cuidadoso es crucial para obtener mediciones precisas.
- Se necesitan más estudios para explorar el papel de la cuantificación del hierro en contextos de enfermedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación precisa de especies redox del hierro (Fe(II)/Fe(III)) es fundamental para comprender el daño celular mediado por hierro en contextos neurodegenerativos y oncológicos. El método CE-ICP-MS permite la detección rápida y sensible de estas especies en matrices biológicas complejas, lo que facilita la eliminación temprana de riesgos mecanicistas en hipótesis terapéuticas relacionadas con el estrés oxidativo y las vías de ferroptosis. Esta capacidad mejora la validación de dianas al proporcionar biomarcadores cuantitativos y específicos del estado redox para la selección de carteras en programas en fase de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la homeostasis redox del hierro como hipótesis terapéutica en modelos de enfermedad.
- Valor operativo: Proporciona lecturas cuantitativas específicas del estado redox para aclarar las vías mecanicistas de la muerte celular inducida por hierro.
- Valor predictivo: Apoya la confianza en dianas guiada por biomarcadores mediante la correlación de las proporciones Fe(II)/Fe(III) con el estrés oxidativo y los resultados de ferroptosis.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Listo para ensayo: Ofrece bajos límites de detección (3,1-3,2 µg/L) y respuesta lineal hasta 150 µg/L, permitiendo una cuantificación confiable en lisados diluidos y biofluidos.
- Reproducibilidad: Demuestra una precisión en el tiempo de migración <3% y una precisión en la medición de 2,2-3,5%, asegurando resultados consistentes en el cribado de compuestos.
- Escalabilidad: El apilamiento por conductividad-pH permite volúmenes de inyección más altos sin comprometer la separación, mejorando el rendimiento para la validación de ensayos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Permite la medición de especies redox del hierro en lisados de SH-SY5Y y LCR, vinculando el descubrimiento con sistemas relevantes para la enfermedad.
- Decisiones Ajustadas al Riesgo: La precisión de recuperación (97–105 %) y la confirmación mediante adición de patrón respaldan la cuantificación fiable de biomarcadores para criterios de avance o interrupción.
- Reducción del Riesgo Mecanicista: Facilita la evaluación de estrategias de modulación del hierro al proporcionar lecturas directas de las especies Fe(II) y Fe(III) en modelos preclínicos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método CE-ICP-MS se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar datos cuantitativos específicos de estado redox que informan las etapas de validación de dianas y de identificación de compuestos prometedores, particularmente para vías que implican estrés oxidativo dependiente del hierro.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la disregulación del hierro en modelos de enfermedades neurodegenerativas y cáncer mediante cuantificación resuelta por especiación.
- Selección: Permite la estandarización de ensayos con bajo LDC y alta precisión, facilitando la evaluación confiable del efecto de compuestos sobre los estados redox del hierro.
- Análisis: Genera resultados cuantitativos basados en áreas de pico y métricas de tiempo de migración que permiten comparaciones entre condiciones y análisis de tendencias.
- Investigación Traducional: Se conecta con la validación preclínica mediante especies de hierro medibles en lisados celulares y biofluidos, apoyando la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: La detección independiente de plataforma mediante ICP-MS permite la reutilización en múltiples objetivos elementales más allá del hierro, aumentando la utilidad a largo plazo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al distinguir las contribuciones de Fe(II) y Fe(III) al estrés oxidativo y a la ferroptosis.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante la separación mejorada por apilamiento y la reducción de interferencias en modo DRC.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar biomarcadores redox cuantitativos vinculados a estados patológicos del hierro.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos según su impacto en la especiación del hierro en modelos relevantes para la enfermedad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la configuración de electroforesis capilar y en la optimización de ICP-MS, particularmente en modo DRC con gas de reacción NH3.
- Depende de un ensamblaje estable de la interfaz entre el capilar de CE y el nebulizador para mantener la integridad de la señal y prevenir cambios redox.
- Necesita estandarización entre equipos en los parámetros del electrolito de fondo (HCl 20 mM) y del voltaje (+25 kV) para garantizar la reproducibilidad.
- Requiere adaptación para muestras de conductividad variable (por ejemplo, LCR) mediante adición de patrón para confirmar la identificación de picos.
- Limitación práctica: la sensibilidad del método a los efectos de la matriz de la muestra exige dilución o estandarización para una cuantificación precisa en biofluidos complejos.
