Modelo de cardiopatía isquémica y comparación basada en vídeo de la contracción de cardiomiocitos utilizando cardiomiocitos derivados de hiPSC
5 de mayo de 2020
Presentamos un modelo de cardiopatía isquémica utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos, junto con un método para la evaluación cuantitativa del daño tisular causado por la isquemia. Este modelo puede proporcionar una plataforma útil para la detección de fármacos y la investigación adicional sobre enfermedades cardíacas isquémicas.
La investigación de enfermedades cardíacas a menudo se realiza en pequeños y mamíferos como roedores. Sin embargo, la fisiología del corazón humano difiere significativamente de la del corazón del roedor. Nuestro protocolo utiliza cardiomiocitos diferenciados de las células iPS humanas para modelar enfermedades cardíacas isquémicas y cuantificar el daño y deterioro funcional de los cardiomiocitos isquémicos.
Este protocolo puede proporcionar un método conveniente para el cribado personalizado de fármacos utilizando células iPS derivadas de pacientes individuales, el manejo adecuado de las células iPS, como en el uso de medio fresco, y el cambio del medio lenta y puntualmente es fundamental para asegurar una diferenciación exitosa en cardiomiocitos funcionales. Demostrando el procedimiento con Yun Liu, Yin Liang y Mengxue Wang será Chen Wang, un estudiante de doctorado de un laboratorio. Para inducir la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en células cardíacas, cubra primero los pozos de una placa de cultivo de 96 pozos con 100 microlitros de 1.675 microgramos por mililitro de laminina en PBS.
Después de una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius, ver tres veces 10 a la cuarta célula madre en 200 microlitros de medio de mantenimiento IPS complementado con 10 micromolares Y27632 en cada pocótulo, y devolver la placa a la Incubadora de Cultivo Celular. Después de 24 horas, sustituya los súper medios por 200 microlitros de medio de crecimiento IPS por pozo, y devuelva la placa a la Incubadora de Cultivo Celular durante dos o tres días adicionales. Cuando las células alcanzan 70 a 80% de confluencia.
Sustituya el medio de cada pozo por 200 microlitros de medio de diferenciación precaluroso A y devuelva la placa a la Incubadora de Cultivo Celular durante otras 48 horas. Al final de la incubación reemplazó lentamente el sobrenadante en cada pozo con 200 microlitros de medio de diferenciación precalentado B y devolver la placa a la Incubadora de Cultivo Celular. Después de dos días, sustituya los sobrenadantes por 200 microlitros de medio de mantenimiento de cardiomiocitos precalentados por pozo y devuelva la placa a la Incubadora de Cultivo Celular durante un máximo de 30 días.
Para evaluar la contractilidad de los cardiomiocitos, instale el plugin de imagen de velocimetría de imagen de partícula y utilice un microscopio de contraste de fase y el objetivo de horquillas para grabar imágenes de vídeo de las células a aproximadamente 20 fotogramas por segundo durante unos 10 segundos. A continuación, guarde el archivo de vídeo como se ha analizado nuestra API y cree una estructura de carpetas como se indica. Para analizar campos vectoriales bidimensionales discretos de desplazamiento celular, inicie VG y seleccione plugins, macros y edite para abrir el análisis vectorial.
ijm, a continuación, haga clic en ejecutar el análisis se realizará automáticamente. Para el tratamiento isquémico, reemplace el sobrenadante en cada pozo con 200 microlitros de dmem sin glucosa y suero, luego coloque la placa en una cámara hipoxiica y luego infunda gas nitrógeno en la cámara, manteniendo la concentración interna de oxígeno en 2% y la concentración de dióxido de carbono en 5% durante 24 horas. Células diferenciadas con éxito, demuestra contracción espontánea como se observa bajo el microscopio con 50% de los pozos de cultivo que típicamente presentan contracción espontánea en menos de 20 días.
La proteína marcadora cardíaca también se puede utilizar para confirmar una diferenciación exitosa Las células del grupo isquémico suelen presentar una menor viabilidad en los ensayos de MTT, y una contractilidad menor que las del grupo de control normódico. La proporción de células positivas de yoduro propidium también es mayor en el grupo isquémico, que en el grupo de control, lo que indica una mayor incidencia de daño celular. Es importante que localice con precisión las regiones de interés en la placa de captura para permitir la comparación de la contractilidad de los cardocitos.
Esta técnica se puede utilizar para el cribado de fármacos, utilizando células iPS derivadas del paciente. También proporciona una plataforma única para dilucidar aún más los mecanismos subyacentes a las enfermedades cardíacas isquémicas
Resumen
Este artículo presenta un protocolo para modelar la enfermedad cardíaca isquémica utilizando cardiomiocitos diferenciados a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPS-CMs). El método permite la cuantificación del daño celular y del deterioro funcional bajo condiciones isquémicas, proporcionando una plataforma clínicamente relevante para la investigación de enfermedades cardíacas y el cribado personalizado de fármacos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Investigación cardiovascular
- Biología de células madre
- Fisiología celular
Antecedentes
- La enfermedad cardíaca isquémica es una de las principales causas de mortalidad en todo el mundo.
- Los modelos en roedores se utilizan comúnmente, pero difieren significativamente de la fisiología cardíaca humana.
- Los cardiomiocitos derivados de células iPS humanas ofrecen un modelo más relevante para estudiar las enfermedades cardíacas humanas.
- Existe la necesidad de plataformas que faciliten tanto la modelización de enfermedades como el cribado de fármacos en un contexto humano.
Objetivo del estudio
- Establecer un protocolo para la diferenciación de células iPS humanas en cardiomiocitos.
- Modelar la enfermedad cardíaca isquémica in vitro utilizando CM-iPS-h.
- Cuantificar el daño celular y el deterioro funcional bajo condiciones isquémicas.
Métodos Utilizados
- Diferenciación de células iPS humanas en cardiomiocitos mediante medios de cultivo secuenciales y placas recubiertas con laminina.
- Inducción de isquemia exponiendo los CM-iPS-h a un 2 % de oxígeno y medio sin glucosa ni suero durante 24 horas en una cámara hipóxica.
- Evaluación de la viabilidad celular mediante ensayos de MTT y tinción con yoduro de propidio.
- Medición de la contractilidad mediante análisis del campo vectorial de desplazamiento utilizando microscopía de contraste de fases y software de velocimetría por imágenes de partículas.
Resultados Principales
- Las condiciones isquémicas aumentaron el porcentaje de células dañadas, como indica una mayor tinción con yoduro de propidio.
- La viabilidad celular disminuyó en el grupo isquémico en comparación con los controles.
- La contractilidad de los miocardiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas (hiPS-CMs) se redujo bajo condiciones isquémicas.
- Aproximadamente el 50 % de los pocillos de cultivo exhibieron contracción espontánea dentro de los 20 días posteriores a la diferenciación.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un modelo in vitro robusto para la enfermedad cardíaca isquémica utilizando cardiomiocitos derivados de humanos.
- Este sistema permite la cuantificación tanto del daño celular como del deterioro funcional.
- El modelo es adecuado para la selección personalizada de fármacos y estudios mecanicistas adicionales de la enfermedad cardíaca isquémica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los modelos de cardiomiocitos derivados de iPSC humanas abordan la brecha traslacional entre los estudios en roedores y las enfermedades cardíacas humanas, permitiendo un descubrimiento más predictivo en etapas tempranas de la enfermedad cardíaca isquémica. El análisis cuantitativo de la contractilidad basado en video y los ensayos de viabilidad proporcionan datos accionables para la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista. Esta plataforma apoya decisiones de cartera ajustadas al riesgo y estrategias de cribado personalizado de fármacos en I+D cardiovascular.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar los mecanismos de lesión isquémica en un sistema relevante para el ser humano.
- Posibilita la validación funcional de objetivos mediante mediciones cuantitativas de contractilidad y viabilidad.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante la modelización de respuestas celulares relevantes para la enfermedad.
- Mejora la confianza predictiva para la selección temprana de carteras en programas cardiovasculares.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Proporciona una plataforma estandarizada de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas para la evaluación reproducible de compuestos.
- Ofrece métricas cuantitativas de contractilidad mediante el análisis del campo vectorial de desplazamiento.
- Permite un cribado escalable basado en video para detectar alteraciones funcionales bajo condiciones isquémicas.
- Facilita la preparación del ensayo para cribados farmacológicos posteriores y estudios mecanicistas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea los hallazgos in vitro con la biología de las enfermedades humanas para lograr una continuidad traslacional.
- Permite el uso de células derivadas de pacientes para el perfilado personalizado de la respuesta a fármacos.
- Reduce la dependencia de modelos no humanos, mejorando la relevancia de las enfermedades en los datos preclínicos.
- Facilita el descubrimiento y la validación de biomarcadores en un contexto clínicamente relevante.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este modelo de isquemia en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas conecta el descubrimiento inicial, la identificación de compuestos prometedores y la investigación traslacional al proporcionar puntos finales funcionales y de viabilidad específicos del ser humano.
- Biología del Descubrimiento: Cuantifica la lesión isquémica y la disfunción contráctil para pruebas de hipótesis y análisis de vías.
- Tamizaje: Ofrece salidas cuantitativas y reproducibles de viabilidad y contractilidad para la selección de compuestos.
- Análisis: Integra el análisis de desplazamiento basado en video y ensayos de viabilidad para comparaciones estadísticas robustas.
- Investigación Traducional: Permite la modelización específica del paciente y apoya la alineación de biomarcadores con puntos finales clínicos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable y escalable para el descubrimiento de fármacos cardiovasculares y estudios mecanicistas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza los ensayos funcionales y apoya flujos de trabajo escalables y reproducibles.
- Valor estratégico: Informa las decisiones de avance o interrupción y mejora la eficiencia del capital al reducir los riesgos biológicos en fases tardías.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos cardiovasculares.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de hiPSC, diferenciación y validación de marcadores cardíacos.
- Necesita acceso a cámaras hipóxicas, microscopía de contraste de fase y software de análisis de video.
- Exige estandarización entre equipos para la reproducibilidad del ensayo y la comparabilidad de los datos.
- Puede ser necesaria una adaptación para distintas líneas de iPSC derivadas de pacientes o subtipos de enfermedades.
- La selección cuidadosa de la región de interés es fundamental para una comparación precisa de la contractilidad.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:05
Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC) Cardiac Differentiation Induction
2:30
Induced Pluripotent Stem Cell-Cardiomyocyte (iPS-CM) Contractility Assessment
3:15
Ischemia Exposure
3:42
Results: Representative Cardiac Cell Differentiation
4:27
Conclusion
