Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético
16 de mayo de 2020
Este protocolo ilustra 1) el aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios del músculo gastrocnemio de ratón adulto, así como 2) la purificación y caracterización de exosomas utilizando un método de ultracentrifugación diferencial combinado con gradientes de densidad de sacarosa seguidos de análisis de Western blot.
La ventaja de utilizar la centrifugación diferencial para este protocolo es que es fácilmente escalable hasta litros y, por lo tanto, es ideal para aislar exosomas de fibroblastos primarios. Los exosomas purificados se pueden obtener a partir de diferentes tipos de células y tejidos aislados de varios modelos de enfermedades. Los exosomas se pueden utilizar como biomarcadores de diagnóstico.
Para demostrarlo será Diantha van de Vlekkert, científica del Laboratorio d'Azzo Para empezar, pesar los músculos del ratón y luego transferirlos a un plato de 10 centímetros. Trabajando bajo una capucha de bioseguridad, pica los músculos con bisturíes para producir una pasta fina. Transfiera la pasta muscular finamente picada a un tubo de 50 mililitros y agregue la solución de digestión usando 3,5 veces el volumen por miligramo de tejido.
Incubar durante 45 minutos a 37 grados centígrados. Para ayudar a la disociación completa, mezcle bien la suspensión con una pipeta de 5 mililitros cada 10 minutos. Para inactivar la solución de digestión, agregue 20 mililitros de DMEM Complete a la suspensión celular.
Pipetear a través de un colador de células de nailon de 70 micrómetros colocado en un tubo de 50 mililitros y, a continuación, lavar el filtro de células con 5 mililitros adicionales de DMEM Complete. Centrifugar la suspensión celular a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de DMEM Complete.
Siembre las células en un plato de 10 centímetros, luego coloque el plato en la incubadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 3% de oxígeno. Los cultivos de fibroblastos del músculo esquelético deben mantenerse a un nivel bajo de oxígeno para garantizar las condiciones fisiológicas de luz. El nivel de oxígeno en el músculo esquelético es de aproximadamente 2.5%Después de que las células alcancen el 100% de confluencia, cultive durante un día adicional, luego enjuáguelas con PBS y agregue un mililitro de solución de tripsinización.
Después de incubar las células durante 10 minutos, detenga la tripsinización agregando 10 mililitros de DMEM Complete. Transfiera la suspensión de celdas a un tubo de 50 mililitros y luego centrifugue las celdas a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 20 mililitros de DMEM completo y siembre las células en un plato de 15 centímetros.
Recoja el medio acondicionado de los fibroblastos cultivados en un tubo de 15 mililitros. Centrifugar el medio acondicionado a 300 g durante 10 minutos para peletizar las células vivas. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mililitros y granule las células muertas centrifugando el tubo a 2.000 g durante 10 minutos.
A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo de polipropileno de 38,5 mililitros y centrifugue el tubo a 10.000 g durante 30 minutos para eliminar orgánulos, cuerpos apoptóticos y fragmentos de membrana. Para granular los exosomas, transfiera el sobrenadante a un tubo ultratransparente de 38,5 mililitros y ultracentrífugo a 100.000 g durante 1,5 horas. Deseche con cuidado el sobrenadante, dejando aproximadamente un mililitro de medio acondicionado.
Lave el pellet de exosoma y vuelva a suspenderlo en hasta 30 mililitros de PBS helado. Centrifugar los exosomas de nuevo a 100.000 g durante 1,5 horas. Para completar la purificación, retire el sobrenadante mediante pipeteo, teniendo cuidado de no alterar la bolita exosomal.
El escalón de los gránulos de exosomas puede estar suelto y desprenderse fácilmente. Por lo tanto, la eliminación del sobrenadante PBS debe realizarse con mucho cuidado con la ayuda de una pipeta de 200 microlitros. Vuelva a suspender el pellet en PBS helado usando 25 microlitros por plato de 15 centímetros de fibroblastos.
Por último, mida la concentración de proteínas con el kit de ensayo de proteínas BCA y un lector de microplacas a 562 nanómetros. Este protocolo es un método altamente reproducible y consistente para purificar exosomas. La microscopía electrónica de transmisión muestra los tamaños relativamente uniformes de estos exosomas.
El inmunoblot de los lisados de exosomas muestra un patrón canónico de expresión de proteínas y la ausencia de contaminantes proteicos LDH y calnexina. Los exosomas se separaron mediante un gradiente de densidad de sacarosa y las fracciones individuales se sondearon en un western blot con anticuerpos contra Alix, CD9 y CD81. Los exosomas se sedimentaron consistentemente en las fracciones tres a seis.
Los exosomas bioactivos aislados y concentrados se pueden utilizar para análisis de microscopía electrónica y espectrometría de masas, así como para experimentos de absorción in vitro e in vivo para estudios funcionales. Este protocolo es adecuado para el aislamiento de exosomas de células de baja secreción y se puede aplicar para explorar la participación de exosomas en enfermedades fibróticas humanas.
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Descripción general
Este protocolo describe el aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios del músculo gastrocnemio de ratón adulto, así como la purificación y caracterización de exosomas mediante un método de ultracentrifugación diferencial combinado con gradientes de densidad de sacarosa, seguido de análisis por inmunotransferencia. La capacidad de aislar exosomas a partir de fibroblastos primarios hace que este método sea significativo para estudiar su potencial como biomarcadores diagnósticos.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Biología celular
- Investigación de exosomas
- Enfermedades fibróticas
Antecedentes
- El aislamiento de fibroblastos primarios proporciona información sobre los mecanismos celulares.
- Los exosomas desempeñan un papel fundamental en la comunicación celular y pueden servir como biomarcadores de enfermedades.
- La técnica permite el aislamiento escalable de exosomas a partir de diversos tejidos.
Métodos Utilizados
- Ultracentrifugación diferencial para la purificación de exosomas
- Músculo gastrocnemio de ratón como sistema biológico
- Análisis mediante blot de Western para la caracterización
Resultados Principales
- Aislamiento y caracterización exitosos de exosomas procedentes de fibroblastos.
- Observación de un patrón de sedimentación constante de exosomas mediante gradientes de sacarosa.
- Confirmación de la ausencia de contaminantes proteicos en exosomas purificados.
Conclusiones
- Este estudio establece un método reproducible para aislar exosomas que podría contribuir a comprender las enfermedades fibróticas.
- Los hallazgos destacan las posibles aplicaciones terapéuticas de los exosomas en diagnósticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de exosomas a partir de fibroblastos primarios del músculo esquelético permite la producción escalable de vesículas extracelulares para el descubrimiento de biomarcadores y estudios funcionales en modelos de enfermedades fibróticas. El protocolo permite una purificación reproducible mediante centrifugación diferencial y gradientes de densidad de sacarosa, facilitando aplicaciones posteriores como espectrometría de masas y microscopía electrónica. Este enfoque mejora la validación de objetivos al proporcionar una fuente constante de exosomas bioactivos para la reducción de riesgos mecanicistas en investigaciones preclínicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar el contenido de exosomas derivados de fibroblastos para aclarar los mecanismos de señalización paracrina en la homeostasis tisular y la fibrosis.
- Valor operativo: Proporciona un método escalable para aislar exosomas de células primarias, lo que favorece un suministro constante para el análisis de vías diana.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Los exosomas purificados proporcionan perfiles cuantitativos de proteínas y lípidos adecuados para la estandarización de ensayos y el desarrollo de paneles de biomarcadores.
- Valor operativo: El método permite el procesamiento de grandes volúmenes, posibilitando el cribado de alto rendimiento de cargas asociadas a exosomas en diferentes condiciones experimentales.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Los exosomas aislados de fibroblastos relevantes para la enfermedad respaldan la alineación de biomarcadores traslacionales y la validación funcional preclínica.
- Valor operativo: La adaptabilidad del protocolo a diversos tejidos y fluidos facilita la continuidad entre modelos en estudios de desactivación de riesgos de dianas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se enmarca en el continuo de descubrimiento desde la biología inicial del blanco hasta la validación preclínica, especialmente para estudios que involucran la comunicación entre células estromales y la señalización mediada por vesículas extracelulares.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre los roles de los exosomas de fibroblastos en la progresión de la fibrosis y la señalización intercelular.
- Tamizaje: Permite la preparación estandarizada de muestras de exosomas para el análisis comparativo de la composición de su carga bajo condiciones variables.
- Análisis: Genera muestras listas para inmunotransferencia (western blot), microscopía electrónica y espectrometría de masas, destinadas a la caracterización multi-ómica.
- Investigación Traducional: Conecta el aislamiento de exosomas de fibroblastos con modelos preclínicos de enfermedades fibróticas mediante la producción consistente y escalable de vesículas.
- Reutilización Empresarial: El protocolo es adaptable a diferentes tipos celulares y tejidos, lo que lo posiciona como una plataforma reutilizable para programas de biomarcadores basados en exosomas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la variabilidad en la pureza y el rendimiento de los exosomas.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante pasos estandarizados de centrifugación y purificación en gradiente.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción al proporcionar candidatos confiables de biomarcadores procedentes de fuentes celulares mecanísticamente relevantes.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de vías diagnósticas o terapéuticas basadas en exosomas, fundamentada en datos funcionales consistentes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células primarias, ultracentrifugación y técnicas de inmunotransferencia (western blot).
- Depende del acceso a equipos de ultracentrifugación y capacidad para la preparación de gradientes de sacarosa.
- Necesita estandarización entre equipos para una evaluación consistente del rendimiento y la pureza de exosomas.
- La adaptación a modelos de tejidos humanos o enfermos puede requerir optimización de las condiciones de digestión y cultivo.
- Las limitaciones prácticas incluyen la posible coaislación de agregados proteicos si los pasos del gradiente no se realizan cuidadosamente.
