Name: Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Aprende a aislar y caracterizar exosomas de fibroblastos primarios del músculo esquelético de ratón mediante ultracentrifugación diferencial y gradientes de sacarosa. Este método reproducible permite obtener biomarcadores diagnósticos para estudiar enfermedades fibroticas.

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Alessandra d'Azzo es titular de la Cátedra de Genética y Terapia Génica de Jewelers for Children (JFC). Este trabajo fue financiado en parte por las subvenciones de los NIH R01GM104981, RO1DK095169 y CA021764, la Fundación Asís de Memphis y las Caridades Asociadas Sirio-Libanesas Estadounidenses.

Todos los procedimientos en ratones se realizaron de acuerdo con los protocolos con animales aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del St. Jude Children's Research Hospital y las pautas de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Preparación de soluciones y medios
<ol><li>Prepare la solución de digestión mezclando 15,4 ml de PBS con 2,5 ml de 20 mg/ml de colagenasa P (concentración final de 5 mg/ml), 2 ml de 11 U/ml de dispasa II (concentración final de 1,2 U/ml) y 100 μl de 1,0 M de CaCl2 (concentración final de 5 mM).</li>
	<li>Prepare 500 mL de medio de fibroblastos primarios (DMEM completo) mezclando 440 mL de DMEM con 50 mL de FBS (10%), 5.0 mL de pluma/estreptococo (100 U/mL y 100 μg/mL, respectivamente) y 5.0 mL de suplemento de glutamina (2 mM). Filtrar-esterilizar el medio con un filtro de vacío de 0,22 μm de tamaño de poro.</li>
	<li>Preparar suero libre de exosomas mediante ultracentrifugación nocturna de FBS en tubos de polipropileno de 38,5 ml a 100.000 x g a 4 °C y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.</li>
	<li>Prepare 500 ml de medio libre de exosomas mezclando 440 ml de DMEM con 50 ml de suero libre de exosomas (10%), 5 ml de pluma/estreptococo (100 U/ml y 100 μg/ml) y 5 ml de suplemento de glutamina (2 mM). Filtrar-esterilizar el medio con un filtro de vacío de 0,22 μm de tamaño de poro.</li>
	<li>Preparar 0,5 M de Tris-HCl (pH 7,4) disolviendo 6,057 g de Tris base en 90 mL de dH 2 O y ajustando elpH a 7,4 con HCl. Ajustar el volumen a 100 mL con dH2O.</li>
	<li>Preparar 10 mM de solución de Tris-HCl (pH 7,4)/1 mM de Mg(Ac)2 (solución de trabajo de sacarosa) mezclando 97,9 mL dedH2Ocon 2 mL de Tris-HCl 0,5 M (pH = 7,4) y 100 μL de 1 M de Mg(Ac)2. Agregue inhibidores de la proteasa a la solución justo antes de usarla y manténgala en hielo.</li>
	<li>Prepare soluciones de gradiente de densidad de sacarosa en hielo de acuerdo con la Tabla 1. Estas soluciones son suficientes para preparar dos tubos de gradiente de sacarosa.</li>
	<li>Prepare 100% TCA agregando 40 ml de dH2O a 100 g de TCA en polvo y mezcle hasta que se disuelva por completo. Ajuste el volumen final con dH2O a 100 mL.</li>
	<li>Prepare etanol al 80% mezclando 20 mL de dH2O con 80 mL de etanol al 100%.</li>
	<li>Prepare el tampón de Western blot mezclando 1,8 L de dH2O con 200 ml de tampón de funcionamiento 10x.</li>
	<li>Prepare el tampón de transferencia Western blot mezclando 1,4 L de dH2O con 200 ml de tampón de transferencia 10x y 400 ml de metanol. Enfríe previamente el tampón de transferencia a 4 °C.</li>
	<li>Preparar 20x solución salina tamponada con Tris (TBS) disolviendo 122 g de Tris base y 180 g de cloruro de sodio en 850 mL dedH2O (pH 8,0). Ajuste el volumen a 1 L con dH2O.</li>
	<li>Prepare el tampón de bloqueo disolviendo 5 g de leche en polvo descremada con 1 ml de Tween-20 al 10%, 5 ml de 20x TBS y 94 ml dedH2O.</li>
	<li>Prepare el tampón de anticuerpos disolviendo 3 g de BSA con 1 ml de Tween-20 al 10 %, 5 ml de TBS 20x y 94 ml dedH2O.</li>
	<li>Prepare el tampón de lavado mezclando 100 ml de 20x TBS y 20 ml de Tween-20 al 10% (10x) con 1,88 L dedH2O.</li>
	<li>Prepare la solución de revelado mezclando 1 volumen de luminol/enhance con 1 volumen de tampón de peróxido estable.</li>
</ol>2. Disección del músculo gastrocnemio (GA) del ratón15,16
<ol><li>Prepare tubos de 50 ml que contengan 10 ml de PBS en hielo.</li>
	<li>Sacrificar a los ratones en una cámara de CO2 seguida de una luxación cervical.</li>
	<li>Retire el músculo gastrocnemio de ambas piernas y transfiéralas a la sonda con PBS en hielo. NOTA: Retire el músculo sóleo del músculo GA antes de transferir el músculo GA al PBS.</li>
</ol>3. Aislamiento y cultivo primario de fibroblastos de ratón
<ol><li>Pesar los músculos y transferirlos a un plato de 10 cm debajo de una capucha de bioseguridad. Pica los músculos con bisturíes hasta que se convierta en una pasta fina.</li>
	<li>Transfiera la pasta muscular finamente picada a un tubo de 50 ml y agregue 3,5 veces el volumen/mg de tejido de la solución de digestión al tubo e incube durante 45 minutos a 37 ° C. Mezcle bien la suspensión con una pipeta de 5 ml cada 10 minutos (esto ayudará a la disociación completa). NOTA: Alternativamente, se puede usar un disociador de tejidos para este paso.</li>
	<li>Añadir 20 ml de DMEM completo a la suspensión celular para inactivar la solución de digestión. Transfiera a un filtro de células de nailon de 70 μm colocado en un tubo de 50 ml. Recoja el flujo y lave el filtro de células con 5 ml adicionales de DMEM completo.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 300 x g a temperatura ambiente (RT) durante 10 min y retirar con cuidado el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender el gránulo en 10 ml de DMEM completo y siembre las células en un plato de 10 cm.</li>
	<li>Cultivar las células a 37 °C, 5% CO 2, 3% O2 (paso 0 o P0). NOTA: 1) Estos cultivos deben mantenerse a un nivel bajo de oxígeno para garantizar condiciones similares a las fisiológicas (el nivel deO2 en el músculo esquelético es de alrededor del 2,5%)17. 2) El número de paso (por ejemplo, P0) de un cultivo celular es un registro del número de veces que el cultivo ha sido subcultivado. 3) Los fibroblastos primarios en P0 se cultivan rutinariamente hasta el 100% de confluencia más 1 día (y solo para P0). Esto es para purgar otros tipos de células y asegurar que las células presentes en el cultivo sean solo fibroblastos, sin células miogénicas según el examen microscópico. El músculo esquelético de un animal adulto a los 2 meses de edad contiene aproximadamente un 2% de progenitores miogénicos4. Además, los progenitores miogénicos generalmente no se adhieren a las placas sin recubrimiento; por lo tanto, se pierden durante el subcultivo18,19,20. Las células miogénicas requieren un medio diferente (F10) suplementado con un 20% de FBS y factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF)18. En el DMEM completo, los fibroblastos medianos tienen una tasa de proliferación más alta que las células miogénicas, lo que resulta en la eliminación de estas células contaminantes antes del primer paso.</li>
	<li>Enjuague las células P0 con PBS cuando estén al 100% confluentes más 1 día. Añadir 1 mL de solución de tripsinización e incubar a 37 °C, 5% CO 2, 3% O2 para separar las células. Detenga la actividad enzimática utilizando 10 ml de DMEM completo.</li>
	<li>Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a RT y resuspender el pellet en 20 mL de DMEM completo y sembrar en una placa de 15 cm (pasaje 1 o P1). Las células crecen hasta una confluencia del 80%-90% y pueden expandirse hasta el pasaje 3. NOTA: Dependiendo de los experimentos posteriores, se pueden utilizar el pasaje 1, el pasaje 2 (P2) o el pasaje 3 (P3).</li>
</ol>4. Siembra de células y recolección de medio acondicionado
<ol><li>Lavar los fibroblastos (P1, P2 o P3) con 10 mL de PBS, añadir 2,5 mL de solución de tripsinización a las células e incubar a 37 °C, 5% CO 2, 3% O2. Detenga la actividad enzimática mediante el uso de 10 ml de DMEM completo. NOTA: Después del pasaje 4, las células primarias se descartan y no deben usarse para más experimentos, ya que cambian de características.</li>
	<li>Recoger las células y centrifugar a 300 x g a RT durante 10 min.</li>
	<li>Resuspendió el gránulo celular en 10 mL de medio libre de exosomas y contó las células.</li>
	<li>Siembre las células a 1,5-2,0 x 106 células por plato (15 cm) e incube a 37 °C, 5% CO 2, 3% O2.</li>
	<li>Recoja el medio acondicionado entre 16 y 24 h en tubos de 50 ml sobre hielo. NOTA: Si las células no son confluentes en un 80%, se puede agregar nuevamente medio libre exosomal fresco y recolectar después de un período adicional de 16 a 24 h. Las dos colecciones se pueden combinar para su posterior procesamiento.</li>
</ol>5. Purificación de exosomas mediante diferencial y ultracentrifugación
NOTA: Todos los pasos se realizan a 4 °C o con hielo. Equilibre el tubo con un tubo lleno de agua cuando sea necesario.
<ol><li>Centrifugar el medio acondicionado a 300 x g durante 10 min para eliminar las células vivas y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mL.</li>
	<li>Eliminar las células muertas por centrifugación a 2.000 x g durante 10 min y transferir el sobrenadante a un tubo de polipropileno de 38,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante a 10.000 x g durante 30 min para la eliminación de orgánulos, cuerpos apoptóticos y fragmentos de membrana. Transfiera el sobrenadante a un tubo ultra claro de 38,5 ml.</li>
	<li>Ultracentrifugar el sobrenadante a 100.000 x g durante 1,5 h para granular los exosomas.</li>
	<li>Deseche cuidadosamente el sobrenadante, dejando aproximadamente 1 ml de medio acondicionado, y lave el gránulo de exosomas en un volumen total de 30 ml de PBS helado.</li>
	<li>Centrifugar a 100.000 x g durante 1,5 h y desechar cuidadosamente el sobrenadante pipeteando, teniendo cuidado de no alterar el gránulo exosomal.</li>
	<li>Vuelva a suspender el gránulo en PBS helado (~25 μL por plato de 15 cm) y mida la concentración de proteínas utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA y un lector de microplacas a 562 nm. NOTA: La concentración de proteína se mide mediante una dilución 1:2 con Triton-X100 al 0,1% endH2O. El rendimiento de exosomas de una placa de 15 cm (20 mL de medio acondicionado) de fibroblastos primarios al 80% de confluencia es de ~3-4 μg.</li>
</ol>6. Caracterización de exosomas por gradiente de densidad de sacarosa
<ol><li>Cargue el gradiente de sacarosa en un tubo ultraclaro de 13 ml pipeteando (de abajo hacia arriba) lo siguiente: 1,5 ml de soluciones de sacarosa de 2,0 M, 2,5 ml de 1,3 m, 2,5 ml de 1,16 m, 2,0 ml de 0,8 m y 2,0 ml de soluciones de sacarosa de 0,5 M.</li>
	<li>Mezclar 30-100 μg de exosomas con una solución de sacarosa 0,25 M y ajustar el volumen a 1 mL.</li>
	<li>Cargue cuidadosamente los exosomas en la parte superior de los gradientes y ultracentrifugar las muestras durante 2,5 h a 100.000 x g y 4 °C.</li>
	<li>Retire los tubos de la ultracentrífuga y colóquelos en hielo y recoja fracciones de 1,0 ml a partir de la parte superior del gradiente. Transfiéralos a tubos de 1,7 ml en hielo.</li>
	<li>Agregue 110 μL de TCA al 100% a cada tubo, mezcle bien e incube durante 10 minutos a RT.</li>
	<li>Centrifugar durante 10 min a 10.000 x g y RT y desechar con cuidado el sobrenadante.</li>
	<li>Vuelva a suspender el gránulo en 500 μL de etanol al 80% preenfriado y deje lavar las muestras durante 10 min a -20 °C.</li>
	<li>Centrifugar durante 10 min a 10.000 x g y 4 °C y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Seque el gránulo durante 10-15 minutos a RT y vuelva a suspender el gránulo en PBS para experimentos in vitro. Mida la concentración de proteínas con el kit de ensayo de proteínas BCA o vuelva a suspender el gránulo directamente en 14,5 μl de dH2O, 5 μl de tampón Laemmli 4x y 0,5 μl de DTT 1 M para análisis de Western blot.</li>
</ol>7. Detección de exosomas mediante análisis de Western blot
<ol><li>Mezcle de 5 a 10 μg de exosomas del paso 5.7 con 5 μl de tampón Laemmli 4x y 0,5 μl de DTT de 1 M y, a continuación, ajuste el volumen final a 20 μl con dH2O. Caliente todas las muestras, incluidas las del paso 6.9, durante 5 min a 98 °C.</li>
	<li>Cargue las muestras en un gel sin manchas TGX al 10% y cargue las escaleras de proteínas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. NOTA: Elija el porcentaje del gel según el peso molecular de la proteína de interés.</li>
	<li>Ejecute el gel a 100 V durante ~ 1 h en el tampón de funcionamiento hasta que el tinte de carga esté en el fondo del gel. NOTA: El tiempo de funcionamiento puede variar según el equipo utilizado o el tipo y porcentaje de gel.</li>
	<li>Imagínate el gel. Las imágenes de los geles sin tinción se utilizan como control de carga para inmunoblots.</li>
	<li>Transferir el gel con una membrana de PVDF durante 1,5 h a 80 V o toda la noche a 30 V a 4 °C.</li>
	<li>Bloquear las membranas en tampón de bloqueo durante 1 h en RT.</li>
	<li>Incubar las membranas para anticuerpos específicos (Tabla 2) en tampón de anticuerpos durante la noche a 4 °C con agitación.</li>
	<li>Lavar las membranas en tampón de lavado e incubar las membranas con los anticuerpos secundarios apropiados (Tabla 2) durante 1 h a RT con agitación.</li>
	<li>Lave las membranas en un tampón de lavado y obtenga imágenes de las membranas utilizando una solución de revelado y un generador de imágenes basado en cámara. Alternativamente, use una película de rayos X para revelar las membranas.</li>
</ol>

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</ol>

Ninguno de los autores tiene conflictos de intereses que declarar.

Un paso crítico para el aislamiento exitoso de los exosomas de los medios de cultivo, como se describe en este protocolo, es el establecimiento y mantenimiento adecuados de cultivos primarios de fibroblastos de ratón a partir de músculo esquelético adulto. Estos cultivos deben mantenerse a un nivel bajo de oxígeno para garantizar condiciones similares a las fisiológicas (el nivel de O2 en el músculo esquelético es de ~2,5%)15. Los fibroblastos primarios cambiarán de características cuan...

Los exosomas son vesículas extracelulares heterogéneas que varían en tamaño de 30 a 150 nm. Se han establecido actores clave en los procesos fisiológicos y patológicos, dada su distribución ubicua en tejidos y órganos 1,2. Los exosomas transportan una carga compleja de proteínas, lípidos, tipos de ADN y tipos de ARN, que varían según el tipo de células de las que se derivan 1,2,3. Los exosomas están enriquecidos en proteínas que tienen diferentes funciones (es decir, las tetraspaninas, incluidas CD9 y CD63) son responsables de los eventos de fusión. Por ejemplo, las proteínas de choque térmico HSP70 y HSP90 están involucradas en la unión y presentación de antígenos. Además, Alix, Tsg101 y flotillina participan en la biogénesis y liberación de exosomas y son ampliamente utilizados como marcadores de estas nanovesículas 2,3,4.
Los exosomas también contienen una variedad de ARN (es decir, microARN, ARN largos no codificantes, ARN ribosómicos) que pueden transferirse a las células receptoras, donde influyenen la señalización posterior. Al estar encerrada por una sola unidad de membrana, la bioactividad de los exosomas depende no solo de la carga de proteínas y ácidos nucleicos, sino también de los componentes lipídicos de la membrana limitante. Las membranas exosómicas están enriquecidas en fosfatidilserina, ácido fosfatídico, colesterol, esfingomielina, ácido araquidónico y otros ácidos grasos, todos los cuales pueden influir en la estabilidad de los exosomas y la topología de la membrana 2,3. Como resultado de la disposición de la carga y los lípidos, los exosomas inician vías de señalización en las células receptoras y participan en el mantenimiento de la fisiología tisular normal 1,2,4,5. Bajo ciertas condiciones patológicas (es decir, neurodegeneración, fibrosis y cáncer), se ha demostrado que desencadenan y propagan estímulos patológicos 4,6,7,8,9,10,11.
Debido a su capacidad para propagar señales a sitios vecinos o distantes, los exosomas se han convertido en biomarcadores valiosos para el diagnóstico o pronóstico de enfermedades. Además, los exosomas se han utilizado experimentalmente como vehículos de compuestos terapéuticos 2,12. La posible aplicación de estas nanovesículas en la clínica hace que el método de aislamiento sea cada vez más importante para lograr el máximo rendimiento, pureza y reproducibilidad. Se han desarrollado e implementado diferentes técnicas para el aislamiento de exosomas. En general, los exosomas se pueden aislar de medios de cultivo celular acondicionados o fluidos corporales mediante centrifugación diferencial, cromatografía de exclusión por tamaño y captura inmunitaria (utilizando kits disponibles comercialmente). Cada enfoque tiene ventajas y desventajas únicas que se han discutido anteriormente 1,2,13,14.
El protocolo descrito se centra en 1) el aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios del músculo gastrocnemio de ratón adulto y 2) la purificación y caracterización de los exosomas liberados en el medio de cultivo por estas células. Actualmente se carece de un protocolo bien establecido para el aislamiento de exosomas de fibroblastos primarios para estudios funcionales. Los fibroblastos primarios no secretan grandes cantidades de exosomas, lo que dificulta el proceso de aislamiento y purificación. Este protocolo describe la purificación de grandes cantidades de exosomas puros a partir de grandes volúmenes de cultivo, manteniendo su integridad morfológica y actividad funcional. Los exosomas purificados obtenidos a partir de medio acondicionado se han utilizado con éxito en experimentos de captación in vitro para inducir vías de señalización específicas en las células receptoras. También se han utilizado para análisis proteómicos comparativos de cargas exosomales de múltiples muestras biológicas4.

<table><tbody><tr><td>Platos de 10 cm</td><td>Midwest Scientific, TPP</td><td>TP93100</td><td></td></tr><tr><td>platos de 15 cm</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP93150</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina Fracción V</td><td>Roche</td><td>10735094001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5430R con rotores FA-35-6-30/ FA-45-48-11 Sistema de</td> imagen <td>Eppendorf</td><td>022620659/5427754008</td><td></td></tr><tr><td>Chemidoc MP</td><td>BioRad</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa P</td><td>Sigma, Roche</td><td>11 213 857 001</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>cOmplete cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Millipore/Sigma, Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Criterion Blotter con electrodos de placa</td><td>BioRad</td><td></td><td></td>1704070</tr><tr><td>Criterion TGX gel proteico sin tinción</td><td>BioRad</td><td>5678034</td><td>10% 18 pocillos, midi-gel</td></tr><tr><td>Criterion célula de electroforesis vertical (midi)</td><td>BioRad</td><td>NC0165100</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II</td><td>Sigma, Roche</td><td>04 942 078 001</td><td>proteasa neutra, grado II</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma/Millipore, Roche</td><td>10708984001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modificación Águilas Medianas</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Etanol a prueba de 200</td><td>Pharmco by Greenfield Global</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL tubos de centrífuga cónicos</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Fluostar Omega lector de microplacas multimodo</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX suplemento</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P Membranas de transferencia</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli tampón de muestra (4x)</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Solución de acetato de magnesio</td><td>Sigma</td><td>63052-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo desnatada</td><td>LabScientific</td><td>M-0842</td><td></td></tr><tr><td>O2/CO2 incubadora</td><td>Sanyo</td><td>MC0-18M</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td>10.000 U/ml</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga premium</td><td>Fisher Scientific, Midwest Scientific</td><td>AVSC1510</td><td>1,7 mL</td></tr><tr><td>Bisturíes desechables</td> <td>protegidosFisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de funcionamiento</td><td>BioRad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Sistema de filtración al vacío estéril de liberación rápida-GP</td><td>Millipore S2GPU05RE</td><td></td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Filtro de células estériles (70 mm)</td><td>Fisher Scientific, marca Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal west Femto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34096</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno de pared delgada</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de transferencia</td><td>BioRad</td><td>16110734</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético</td><td>Sigma</td><td>91228-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>BioRad</td><td>1610719</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100 solución</td><td>Sigma</td><td>93443-100mL</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>12604-013</td><td>Rojo sin fenol</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioRad</td><td>#1610781</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga Optima XPM</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99842</td><td></td></tr><tr><td>Tubo ultra claro (14x89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Tubos ultratransparentes (25x89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua Isotemp 220</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS220</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Los exosomas son pequeñas vesículas extracelulares liberadas por prácticamente todas las células y secretadas en todos los fluidos biológicos. Se han desarrollado muchos métodos para el aislamiento de estas vesículas, incluida la ultracentrifugación, la ultrafiltración y la cromatografía de exclusión por tamaño. Sin embargo, no todos son adecuados para la purificación y caracterización de exosomas a gran escala. A continuación se describe un protocolo para establecer cultivos de fibroblastos primarios aislados de músculos esqueléticos de ratones adultos, seguido de la purificación y caracterización de exosomas de los medios de cultivo de estas células. El método se basa en el uso de pasos secuenciales de centrifugación seguidos de gradientes de densidad de sacarosa. A continuación, se valida la pureza de las preparaciones exosomales mediante análisis de Western blot utilizando una batería de marcadores canónicos (es decir, Alix, CD9 y CD81). El protocolo describe cómo aislar y concentrar exosomas bioactivos para microscopía electrónica, espectrometría de masas y experimentos de captación para estudios funcionales. Puede ampliarse o reducirse fácilmente y adaptarse para el aislamiento de exosomas de diferentes tipos de células, tejidos y fluidos biológicos.

Este protocolo es adecuado para la purificación de exosomas a partir de grandes volúmenes de medio acondicionado de una manera rentable. El procedimiento es altamente reproducible y consistente. La Figura 1 muestra la imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de exosomas purificados del medio de cultivo de fibroblastos primarios de ratón. La Figura 2 muestra el patrón de expresión proteica de los marcadores exosomales canónicos y la ausencia de cont...

Este protocolo ilustra 1) el aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios del músculo gastrocnemio de ratón adulto, así como 2) la purificación y caracterización de exosomas utilizando un método de ultracentrifugación diferencial combinado con gradientes de densidad de sacarosa seguidos de análisis de Western blot.

Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

La ventaja de utilizar la centrifugación diferencial para este protocolo es que es fácilmente escalable hasta litros y, por lo tanto, es ideal para aislar exosomas de fibroblastos primarios. Los exosomas purificados se pueden obtener a partir de diferentes tipos de células y tejidos aislados de varios modelos de enfermedades. Los exosomas se pueden utilizar como biomarcadores de diagnóstico.Para demostrarlo será Diantha van de Vlekkert, científica del Laboratorio d'Azzo Para empezar, pesar los músculos del ratón y luego transferirlos a un plato de 10 centímetros. Trabajando bajo una capucha de bioseguridad, pica los músculos con bisturíes para producir una pasta fina. Transfiera la pasta muscular finamente picada a un tubo de 50 mililitros y agregue la solución de digestión usando 3,5 veces el volumen por miligramo de tejido.Incubar durante 45 minutos a 37 grados centígrados. Para ayudar a la disociación completa, mezcle bien la suspensión con una pipeta de 5 mililitros cada 10 minutos. Para inactivar la solución de digestión, agregue 20 mililitros de DMEM Complete a la suspensión celular.Pipetear a través de un colador de células de nailon de 70 micrómetros colocado en un tubo de 50 mililitros y, a continuación, lavar el filtro de células con 5 mililitros adicionales de DMEM Complete. Centrifugar la suspensión celular a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de DMEM Complete.Siembre las células en un plato de 10 centímetros, luego coloque el plato en la incubadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 3% de oxígeno. Los cultivos de fibroblastos del músculo esquelético deben mantenerse a un nivel bajo de oxígeno para garantizar las condiciones fisiológicas de luz. El nivel de oxígeno en el músculo esquelético es de aproximadamente 2.5%Después de que las células alcancen el 100% de confluencia, cultive durante un día adicional, luego enjuáguelas con PBS y agregue un mililitro de solución de tripsinización.Después de incubar las células durante 10 minutos, detenga la tripsinización agregando 10 mililitros de DMEM Complete. Transfiera la suspensión de celdas a un tubo de 50 mililitros y luego centrifugue las celdas a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 20 mililitros de DMEM completo y siembre las células en un plato de 15 centímetros.Recoja el medio acondicionado de los fibroblastos cultivados en un tubo de 15 mililitros. Centrifugar el medio acondicionado a 300 g durante 10 minutos para peletizar las células vivas. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mililitros y granule las células muertas centrifugando el tubo a 2.000 g durante 10 minutos.A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo de polipropileno de 38,5 mililitros y centrifugue el tubo a 10.000 g durante 30 minutos para eliminar orgánulos, cuerpos apoptóticos y fragmentos de membrana. Para granular los exosomas, transfiera el sobrenadante a un tubo ultratransparente de 38,5 mililitros y ultracentrífugo a 100.000 g durante 1,5 horas. Deseche con cuidado el sobrenadante, dejando aproximadamente un mililitro de medio acondicionado.Lave el pellet de exosoma y vuelva a suspenderlo en hasta 30 mililitros de PBS helado. Centrifugar los exosomas de nuevo a 100.000 g durante 1,5 horas. Para completar la purificación, retire el sobrenadante mediante pipeteo, teniendo cuidado de no alterar la bolita exosomal.El escalón de los gránulos de exosomas puede estar suelto y desprenderse fácilmente. Por lo tanto, la eliminación del sobrenadante PBS debe realizarse con mucho cuidado con la ayuda de una pipeta de 200 microlitros. Vuelva a suspender el pellet en PBS helado usando 25 microlitros por plato de 15 centímetros de fibroblastos.Por último, mida la concentración de proteínas con el kit de ensayo de proteínas BCA y un lector de microplacas a 562 nanómetros. Este protocolo es un método altamente reproducible y consistente para purificar exosomas. La microscopía electrónica de transmisión muestra los tamaños relativamente uniformes de estos exosomas.El inmunoblot de los lisados de exosomas muestra un patrón canónico de expresión de proteínas y la ausencia de contaminantes proteicos LDH y calnexina. Los exosomas se separaron mediante un gradiente de densidad de sacarosa y las fracciones individuales se sondearon en un western blot con anticuerpos contra Alix, CD9 y CD81. Los exosomas se sedimentaron consistentemente en las fracciones tres a seis.Los exosomas bioactivos aislados y concentrados se pueden utilizar para análisis de microscopía electrónica y espectrometría de masas, así como para experimentos de absorción in vitro e in vivo para estudios funcionales. Este protocolo es adecuado para el aislamiento de exosomas de células de baja secreción y se puede aplicar para explorar la participación de exosomas en enfermedades fibróticas humanas.

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Investigación

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Biology

Biología

Aislamiento y cultivo de fibras musculares es el estándar de...

Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

Los principales tipos de células adherentes derivadas del músculo humano son las células miogénicas y los fibroblastos. Aquí, las poblaciones celulares se enriquecen mediante la clasificación de células activadas magnéticamente basadas en el antígeno CD56. El posterior inmunomarcaje con anticuerpos específicos y el uso de técnicas de análisis de imagen permiten cuantificar las características citoplasmáticas y nucleares de las células individuales.

Aislamiento y Caracterización cuantitativa inmunocitoquímica de células miogénicas Primarias y fibroblastos de músculo esquelético humano

Presentamos técnicas para aislar, cultivar, caracterizar y diferenciar las células progenitoras musculares primarias humanas (hMPC) obtenidas del tejido de biopsia muscular esquelética.  los hMPC obtenidos y caracterizados a través de estos métodos se pueden utilizar para abordar posteriormente cuestiones de investigación relacionadas con la miogénesis humana y la regeneración muscular esquelética.

Aislamiento, cultivo, caracterización y diferenciación de células progenitoras musculares humanas del procedimiento de biopsia muscular esquelética

La obtención de una población pura de fibroblastos es crucial para estudiar su papel en la reparación de heridas y fibrosis. Aquí se describe un método detallado para aislar fibroblastos y miofibroblastos de corazones de ratón no lesionados y lesionados seguidos de la caracterización de su pureza y funcionalidad por inmunofluorescencia, RTPCR, clasificación celular asistida por fluorescencia, y contracción del gel de colágeno.

Aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos

Aquí, proponemos un método para obtener eficientemente fibras musculares individuales en etapas de desarrollo postnatal tempranas a partir del modelo de ratón lamin 8-11 mutante homocigoto, un modelo muy severo para la distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EDMD).

Aislamiento de miofiber único y cultura de un modelo murino de distrofia muscular de Emery-Dreifuss en el desarrollo post-Natal temprano

Este protocolo describe el aislamiento de células madre musculares y progenitores fibroadipogénicos de músculos esqueléticos individuales en ratones. El protocolo incluye la disección de un solo músculo, el aislamiento de células madre mediante clasificación de células activadas por fluorescencia, la evaluación de la pureza mediante tinción de inmunofluorescencia y la medición cuantitativa de la entrada en fase S mediante un ensayo de incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina.

Aislamiento de poblaciones de células madre quiescentes de músculos esqueléticos individuales

Este protocolo tiene como objetivo aislar y purificar vesículas extracelulares intersticiales del músculo esquelético (SkM-EVs) de tejidos musculares de roedores mediante desprendimiento mecánico, disociación enzimática, filtración y ultracentrifugación diferencial. Demuestra consistencia y confiabilidad. Los SkM-EV aislados proporcionan información sobre la homeostasis muscular y las enfermedades, con posibles aplicaciones como biomarcadores de diagnóstico o vehículos terapéuticos.

Aislamiento enzimático de vesículas extracelulares intersticiales del músculo esquelético

Este protocolo proporciona un método estandarizado para aislar y enriquecer mioblastos primarios del músculo óseo de ratón adulto y neonatal mediante disociación tisular, filtración secuencial, pre-placado y condiciones definidas de cultivo, permitiendo el establecimiento y mantenimiento de cultivos de mioblastos derivados de células satélite para aplicaciones experimentales posteriores.

Aislamiento de células satélite del músculo esquelético para estudios in vitro de miogénesis

Este protocolo describe el aislamiento de fibras musculares individuales intactas del sóleo oxidativo y el establecimiento de cultivos de mioblast altamente purificados derivados de estas fibras. El procedimiento optimizado proporciona de forma fiable aproximadamente 300–500 miofibras intactas por ratón, permitiendo análisis moleculares y celulares posteriores.

Ensayo de aislamiento de fibra única para la evaluación del comportamiento oxidativo de miofibras

Este protocolo describe el aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y la médula ósea mediante digestión enzimática y cromatografía de exclusión de tamaño, permitiendo la recuperación reproducible de fracciones enriquecidas con vesículas de tejidos estructuralmente complejos y de bajo rendimiento para análisis molecular posteriores.

Aislamiento de pequeñas vesículas extracelulares del músculo esquelético murino y médula ósea mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Aprende a aislar y caracterizar exosomas de fibroblastos primarios del músculo esquelético de ratón mediante ultracentrifugación diferencial y gradientes de sacarosa. Este método reproducible permite obtener biomarcadores diagnósticos para estudiar enfermedades fibroticas.

Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético

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