Name: Análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiquitylación de CENP-A con etiqueta EYFP (EYFP-CENP-A) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprende a identificar sitios de ubiquitylación en CENP-A con etiqueta EYFP mediante espectrometría de masas. Este método revela modificaciones postraduccionales esenciales para la función del centrómero y la viabilidad celular.

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Agradecemos a Chao-Jun Li en el Model Animal Research Center de la Universidad de Nanjing por el análisis de espectrometría de masas. Agradecemos a Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa y a los investigadores actuales del Model Animal Research Center, Nanjing University y Greehey Children's Cancer Research Institute por su útil discusión, orientación experimental y reactivos. Agradecemos a Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago y Dawn S. Chandler por sus generosos dones de reactivos. Y.N. con el apoyo fue apoyado por el Fondo de Construcción de la Provincia de Jiangsu ''Doble- Primera Clase'', Fondo de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (SBK2019021248), Fondo deSeis Picos de Talento Grande de la Provincia de Jiangsu (TD-SWYY-001), Fondo "Programa de Expertos Cien Talentos" de la Provincia de Jiangsu (SBK2019010048) y National Natural Science Foundation in China (31970665). Este estudio fue apoyado en parte por la subvención NCI R21 CA205659.

<ol><li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li>
<li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li>
<li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li>
<li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment%2C+Maintenance%2C+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li>
<li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+modifications+of+CENP-A%3A+marks+of+distinction%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li>
<li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li>
<li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482(2015).</li>
<li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li>
<li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732(2016).</li>
<li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetratrico+peptide+repeat+interactions%3A+to+TPR+or+not+to+TPR%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li>
<li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li>
<li>Thermofisher, Inc. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses en competencia.

Aquí describimos métodos de análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que el etiquetado EYFP induce la ubiculación en una lisina diferente en la proteína mutante CENP-A K124R8. En nuestros resultados, identificamos con éxito la ubiculación en lisina 306 (K306) en EYFP-CENP-A K124R, que corresponde a la lisina 56 (K56) en CENP-A a través del análisis de espectrometría de masas. El análisis de espectrometría de masas descrito aquí es...

En la mayoría de los eucariotas, los microtúbulos del husillo deben adherirse a una sola región de cada cromosoma, llamado centromere. El kinetochore es un complejo de proteínas que se encuentran en el centromere. Estudiar el momento de los movimientos de la proteína centromere y kinetochore y la estructura de los quinetocoros y centromeres es importante para entender la inestabilidad cromosómica (CIN) y la progresión del cáncer. Las preguntas clave son cómo se determina la ubicación cromosómica y la función de un centromere (es decir, identidad centromere) y cómo participan en la segregación cromosómica precisa. En la mayoría de las especies, la presencia de un nucleosoma especial que contiene una proteína específica similar a la histona llamada CENP-A define la identidad centromere. Por lo tanto, se propone que el CENP-A sea el indicador no ADN (marca epigenética) de la identidad centromere. Es importante dilucidar el mecanismo de cómo CENP-A define la identidad centromere en los seres humanos.
La proteína de reconocimiento de unión Holliday (HJURP) es el chaperon específico de CENP-A que deposita CENP-A en nucleosomas centroméricos1,,2,,3. Hemos informado previamente que la ligasa CUL4A-RBX1-COPS8 E3 es necesaria para la ubiculación CENP-A en la lisina 124 (K124) y la localización de centromere4. Además, nuestros resultados mostraron que el reclutamiento de centromere de CENP-A recién sintetizado requiere una ubicuidad preexistente CENP-A5. Por lo tanto, se proporcionó un modelo que sugiere que la ubicuidad CENP-A se hereda a través de la dimerización entre divisiones celulares.
En contraste con nuestros hallazgos y los de Yu et al., los resultados negativos sobre el CENP-A y su localización centromérica se publicaron recientemente6. El artículo afirmaba que las modificaciones CENP-A en la lisina 124 (K124) son prescindibles para el establecimiento, mantenimiento y función a largo plazo de los centromeres humanos, basándose en sus resultados negativos que demuestran que la mutación de K124R no afectó a la localización del centromere CENP-A ni la viabilidad celular6. Sin embargo, hay suficiente margen para el debate en sus resultados y conclusiones, y ya hemos descrito qué problema podría haber en su publicación anterior7. Se debe prestar atención a que fusionaron proteínas con CENP-A, que tienen pesos moleculares mucho mayores que el tamaño de CENP-A endógeno: por ejemplo, fusionaron la proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP) de 30 kDa a 16 kDa CENP-A y analizaron la proteína de fusión EYFP-CENP-A K124R en su sistema RPE-1 CENP-A-/F knockout. No se espera que la ubiquitina K124 se una directamente al HJURP sobre la base de las predicciones estructurales4,sin embargo, se prevé que la adición de monoubiquitina tenga un impacto en la conformación proteica de CENP-A. La proteína de la conformación CENP-A puede ser cambiada por la presencia de una gran proteína de fusión, y este cambio conformacional puede enmascarar los cambios estructurales causados por la pérdida de ubiculación. Sugerimos que la fusión de proteína de gran tamaño induce la ubiculación a una lisina distinta de la K124 en el mutante EYFP-CENP-A K124R y esta ubiculación en otro sitio inhibe/enmascara el fenotipo mutante único original K124R. La evidencia de que la ubicuidad ocurre en diferentes lisina en la proteína mutante CENP-A K124R con una proteína de etiqueta grande (EYFP) fue reportada en nuestra publicación anterior8. Se encontró que el etiquetado EYFP induce la ubiquitinación de otro sitio de lisina de EYFP-CENP-A K124R y que el mutante EYFP-CENP-A K124R se une a HJURP. Como resultado, esta ubiculación en otro sitio inhibe/enmascara el fenotipo mutante único K124R original, y tanto los mutantes EYFP-CENP-A WT como K124R mostraron localización de centromere (usamos y comparamos pBabe-EYFP-CENP-A WT y mutante K124R, junto con el control pBabe-EYFP.). Los resultados demostraron que los mutantes CENP-A K124R con etiqueta de bandera o sin etiquetar son letales, pero pueden ser rescatados por una fusión monoubiquitina, lo que sugiere que la ubicuidad CENP-A es indispensable para la viabilidad celular.
En los últimos años, muchos estudios han desarrollado diferentes ensayos para identificar las modificaciones posttranslacionales (PTM) de la proteína CENP-A y otras proteínas centromere-kinetochore tanto in vivo como in vitro9,,10,,11. Análogos a los PTM de las proteínas histonas que son un mecanismo importante que regula la función de la cromatina, los PTM de los componentes centroméricos de cromatina también participan en un mecanismo esencial para regular la estructura general y la función de los centromeros. La mayoría de los sitios CENP-A PTM son específicos de los nucleosomas que contienen CENP-A, aunque algunos de ellos se conservan en la histona H3, lo que sugiere que la modificación de estos residuos contribuye a la función específica del centromere. Las PTM de CENP-A, incluyendo la fosforilación, la acetilación, la metilación y la ubicuidad, se notificaron previamente9, lo que sugiere que CENP-A está sujeta a una variedad de TPM y sus matrices combinatorias en su dominio amino terminus y C-terminus histone-fold. La importancia de las modificaciones CENP-A en múltiples funciones fue revelada por muchos grupos, incluyendo el nuestro. Estas funciones implican la deposición CENP-A en los centromeres, la estabilidad proteica y el reclutamiento de la CCAN (red asociada al centromere constitutivo)9. Sin embargo, los estudios y hallazgos limitados de las PTM CENP-A se preforman cuando se realizan comparaciones con una de las histonas canónicas que regulan directa o indirectamente su función. Los informes técnicos centrados en la metodología para identificar estos PTM CENP-A también son limitados.
Debido a que se requiere la ubicuidad CENP-A para la deposición CENP-A en el centromere12,heredada a través de la dimerización entre la división celular5,e indispensable para la viabilidad celular8, el método para identificar la ubiculación CENP-A sería esencial en el futuro para estudiar la actividad funcional, el posicionamiento y la estructura del centromere. Por lo tanto, aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que el etiquetado EYFP induce la ubiculación en una lisina diferente en la proteína mutante CENP-A K124R8. También se presentan protocolos de otros ensayos y análisis de control (análisis de inmunofluorescencia, ensayo de crecimiento de colonias y ensayo de ubicuidad in vivo) para discutir el resultado del análisis de espectrometría de masas importante correctamente.

<table><tbody><tr><td>Equpimentos/Herramientas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml de tubos de baja unión a proteínas</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>022431064 Para análisis de espectrometría de masas</td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 10 cm</td><td>BIOFIL/JET, China</td><td>700224</td><td>placa de cultivo de tejidos de 10 cm (Yohei lab, PN63)</td></tr><tr><td>6 Pocillos de cultivo celular</td><td>Fisher/Corning Incorporated</td><td>07-200-83</td><td>Cultivo de 6 pocillos placa</td></tr><tr><td>CentriVap</td><td>LABCONCO-Concentrador</td> <td>de</td> <td>vacío de sobremesa para péptidos secos al vacío para análisis de espectrometría de masas</td></tr><tr><td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &mu; m</td><td>Eksigent Technologies</td><td>805-00120 Columna de</td><td>cromatografía líquida (RPLC) para análisis de espectrometría de masas</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x lente de inmersión en aceite</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td><td>100X lente de inmersión</td></tr> en <tr><td>aceite HCX PL APO 63x lente de inmersión en aceite</td><td>Leica LEICA</td><td>HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td><td>63X Lente de inmersión en aceite</td></tr><tr><td>Immobilon-FL PVDF membrana de transferencia</td><td>EMD Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Para Western blot</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia motorizado Leica DM IRE2</td><td></td> <td>Microscopio de fluorescencia motorizado</td><td>Leica</td></tr> <tr><td>EL6000 Fuente de luz compacta</td><td>Leica</td><td></td><td>Fuente de luz externa para excitación fluorescente</td></tr><tr><td>Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>Cover glass (22 mm x 22 mm)</td></tr><tr><td>Modelo V16-2 Aparato de electroforesis en gel de poliacrilamida</td><td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td><td>31071010</td><td>Aparato de electroforesis en gel I para aplicar un gel SDS-PAGE</td></tr><tr><td>nanoLC.2D</td><td>más grande Eksigent</td> <td>Technologies-sistema de</td> <td>cromatografía líquida para análisis de espectrometría de masas</td></tr><tr><td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>NP0335BOX Los geles de proteínas Bis-Tris 4%-12% disponibles comercialmente para el análisis</td></tr> <tr><td>de espectrometría de masasMicroscopio de barrido láser confocal Olympus FLUOVIEW FV3000</td> <td>Microscopio de barrido láser Olympus-Confocal (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ descargas/#!dlOpen=%23detail847250519)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD ORCA-R2 Degital</td><td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td><td>Cámara CCD</td></tr><tr><td>PAP</td><td>Pen Sitio de unión</td><td>AD100.1</td><td>Para una barrera repelente al agua en la tinción inmunofluorescente</td></tr><tr><td>TEJIDO PLACAS DE CULTIVO 10 CM</td><td>VWR</td><td>25382-166 Placa de cultivo de</td><td>tejidos de 10 cm</td></tr><tr><td>Electroforesis vertical para funcionamiento en gel (tamaño grande)</td><td>Junyi, China</td><td>JY-SCZ6 +</td> <td>Aparato de electroforesis de gel II para aplicar gel SDS-PAGE más grande (Yohei lab, PE23)</td></tr><tr><td>VWR Micro Slides, Frosted</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>Micro portaobjetos</td></tr><tr><td><fuerte>Anticuerpos primarios</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CENP-A</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>Anticuerpo monoclonal de ratón</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CENP-B</td><td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>Anticuerpo monoclonal de ratón</td></tr><tr><td>anti-GAPDH</td><td>ABCAM</td><td>ab37168</td><td>Anticuerpo policlonal de conejo</td></tr><tr><td>anti-GAPDH</td><td>Invitrogen</td><td>PA1987</td><td>Anticuerpo</td></tr> <tr><td>policlonal de conejoanticuerpo anti-GFP</td><td>ANTI #76 (anticuerpo casero)</td><td></td><td>Anticuerpo policlonal de conejo</td></tr><tr><td>anti-HA (3F10)</td><td>Roche</td><td>11815016001</td><td>Rat anticuerpo monoclonal</td></tr><tr><td>anti-HJURP</td><td>Proteintech Group</td><td>15283&ndash; 1-AP</td><td>Anticuerpo policlonal de conejo</td></tr><tr><td>anti-Ubiquitina</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-317A-1</td><td>Anticuerpo policlonal</td></tr> <tr><td>de conejo<reactivos fuertes></fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de proteínas Bio-Rad Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>Reactivo de ensayo de proteínas comercial I para la medición de la concentración de proteínas (compatible con SDS al 0,1%)</td><td></td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>Sonicator</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics sonicador Microtip Step, sólido, roscado 9,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33995-325</td><td>Bocina disruptora para sonicación</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics sonicador Microtip Tapered 6,5 mm</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>33996-185</td><td>Micropunta para tampón de sonicación</td></tr><tr><td>A1</td><td>-</td><td>-</td><td>20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 50 mM de NaCl; 0,5% Nonidet P-40; 0,5% desoxicolato; 0,5% SDS; 1 mM de EDTA; reactivo inhibidor de proteasa completo sin EDTA</td></tr><tr><td>Cóctel completo de inhibidores de proteasa sin EDTA</td><td>Roche</td><td>11-873-580-001</td><td>Reactivo inhibidor de proteasa completo sin EDTA para tampón A1</td></tr><tr><td>Coomassie azul brillante R-250</td><td>BBI Ciencias de la vida</td><td>CAS 6104-59-2 Solución azul de</td><td>Coomassie para análisis de espectrometría de masas</td></tr><tr><td>Solución de violeta cristalino (2,3% violeta cristalino, 0,1% oxilato de amonio, 20% etanol)</td><td>SigmaI-Aldrich</td><td>HT90132-1L</td><td>Para la tinción de colonias</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>Para la tinción nuclear</td></tr><tr><td>DMEM: F12 Medio</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>DMEM: F12 Medio</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, certificado, calor inactivado, de origen estadounidense</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (suero fetal bovino)</td></tr><tr><td>DMEM con alto contenido de glucosa (Dulbecco' Águila modificada' s medio)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>DMEM de alta glucosa</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Reactivo de transfección I para transfección química</td></tr><tr><td>Lipofectamin 3000, solución P3000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>L3000</td><td>Reactivo de transfección II para transfección química</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td>Fijación Leche</td></tr><tr><td>en polvo descremada (sustituto aprobado de la leche en polvo de clavel)</td><td>Fisher Scientific NC9255871</td><td>(Pedido Nº 190915; Lote # 90629)</td><td>Leche descremada descremada</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>Medio sérico reducido</td></tr><tr><td>p-fenilendiamina</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>Para el medio de montaje</td></tr><tr><td>Penicilina, estreptomicina; Líquido</td><td>Fisher/Gibco</td><td>15-140</td><td>Penicilina-estreptomicina</td></tr><tr><td>Poli-L-lisina SOLUCIÓN</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P 8920</td><td>Poly-L-Lisina, 0,1% p/v, en agua</td></tr><tr><td>Polietileneimina [PEI]; 1,0 mg/ml</td><td>Polysciences</td><td>23966&ndash; 2</td><td>Reactivo de transfección III para la transfección química</td></tr><tr><td>Férulas de proteína A sefarosa CL-4B</td><td>GE Healthcare/Amersham</td><td>17-0963-03</td><td>Proteínas A perlas de sefarosa CL-4B para ensayos de ubiquitilación in vivo utilizando pQCXIP-EYFP-CENP-A</td></tr><tr><td>Restore tampón de decapado de Western Blot</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI21059</td><td>tampón de decapado de Western Blot I</td></tr><tr><td>Tripsina de grado de secuenciación</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>Para el análisis de espectrometría de masas</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Sustrato de máxima sensibilidad</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>Sustrato quimioluminiscente mejorado (ECL) ultrasensible</td></tr><tr><td>Agua destilada ultrapura</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>Agua estéril de grado de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Tampón de decapante Western Blot II ((50 mM Tris-HCl, pH 6,85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoetanol)</td><td>-</td><td>-</td><td>Tampón de eliminación de Western Blot II</td></tr><<tr><td>fuerte>Anticuerpos secundarios</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos (anticuerpo secundario purificado por afinidad)</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquisition FV31S-SW software</td><td>Olympus-Sofware</td><td></td> <td>C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ descargas/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>Análisis FV31S-DT software</td><td>Olympus</td><td>-</td><td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ descargas/#!dlOpen=%23detail847250519)</td></tr><tr><td>cellSens Dimension software Ver. 1. 18</td><td></td> <td>Olympus-Sofware</td> <td>C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td></tr><tr><td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td><td>LI-COR Biosciences-Software</td><td></td> <td>D</td></tr><tr><td>Generador de imágenes moleculares Versadoc MP4000 System</td><td>Bio-Rad</td><td>-</td><td>Generador de imágenes de quimioluminiscencia para la detección de inmunoblot</td></tr><tr><td>Odyssey CLx Sistema de imágenes infrarrojas</td><td>LI-COR Biosciences-Sistema</td><td></td> <td>de imágenes infrarrojas para la detección de inmunoblot</td></tr><tr><td>OpenCFU saftware</td><td>-</td><td>-</td><td>Para el recuento de colonias (http://opencfu.sourceforge.net/)</td></tr><tr><td>Openlab versión 5.5.2. Software de imagen científica</td><td>Improvision/PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>A</td></tr><tr><td>ProteinPilot Software versión 4.5</td><td>AB SCIEX-Software</td><td></td> <td>F para el análisis de espectrometría de masas</td></tr><tr><td>Cantidad Un software de análisis 1-D</td><td>Bio-Rad-Software</td><td></td> <td>E</td></tr><tr><td>TripleTOF 5600+ System</td><td>AB SCIEX-Instrumento</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de espectrometría de masasVolocity versión 6.3 Software de análisis de imágenes 3D (Volocity Acquisition)</td><td>PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>B1</td></tr><tr><td>Volocity versión 6.3 Software de análisis de imágenes 3D (Cuantificación de volocity)</td><td>PerkinElmer-Software</td><td></td> <td>B2</td></tr></tbody></table>

análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiquitylación de cenp-a con etiqueta eyfp (eyfp-cenp-a)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

El estudio de la estructura y la dinámica de los quinetocoros y centromeres es importante para entender la inestabilidad cromosómica (CIN) y la progresión del cáncer. La forma en que se determina la ubicación cromosómica y la función de un centromere (es decir, identidad centromere) y participan en la segregación cromosómica precisa es una cuestión fundamental. Se propone que CENP-A sea el indicador no ADN (marca epigenética) de la identidad centromere, y se requiere la ubicuación CENP-A para la deposición CENP-A en el centromere, heredada a través de dimerización entre la división celular, e indispensable para la viabilidad celular.
Aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que la ubicuidad en una lisina diferente se induce debido al etiquetado EYFP en la proteína mutante CENP-A K124R. Se identificó con éxito la ubiquilación de lisina 306 (K306) en EYFP-CENP-A K124R, que corresponde a la lisina 56 (K56) en el ANálisis de espectrometría de masas CENP-A. Una advertencia se discute en el uso de GFP/EYFP o el etiquetado de proteína de alto peso molecular como herramienta para analizar la función de una proteína. También se discute el límite técnico actual para la detección de bandas ubiquitidas, la identificación de la ubiculación específica del sitio y la visualización de la ubicuidad en células vivas o una sola célula específica durante todo el ciclo celular.
El método de análisis de espectrometría de masas presentado aquí se puede aplicar a la proteína humana CENP-A con diferentes etiquetas y otras proteínas centromere-kinetochore. Estos métodos combinatorios que consisten en varios ensayos/análisis podrían recomendarse a los investigadores que estén interesados en identificar funciones funcionales de ubiculación.

El mutante EYFP-CENP-A K124 muestra ubiculación, interacción con HJURP y ningún defecto en la localización de centromere ni la letalidad celular. Aquí se re-constituyó el sistema reportado por Fachinetti et al. (2017)6: en células humanas diploides (RPE-1) que transportaban un interrumpido y un ''floxed'' CENP-A alelo (CENP-A-/F), EYFP-CENP-A se expresó desde el vector retrovirus pBabe-EYFP. En este sistema, la expresión de CENP-A endógeno del alelo <e...

La ubicuidad CENP-A es un requisito importante para la deposición CENP-A en el centromere, heredada a través de la dimerización entre la división celular, e indispensable para la viabilidad celular. Aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación de la proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) etiquetada por EYFP.

Análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiquitylación de CENP-A con etiqueta EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Este método permite identificar la ubiculación de la proteína CENP-A etiquetada por EYFP. También se puede aplicar a la proteína humana CENP-A con diferentes pruebas y otras proteínas. La principal ventaja de esto es que se puede utilizar para identificar EYFP CENP-A K124R sitios ubicuos con significado biológico crucial.Podría ampliarse para investigar las modificaciones post-traduccionales de una amplia gama de proteínas funcionales. Comience preparando las proteínas A cuentas unidas con anticuerpos anti-GFP. Lavar 25 microlitros de proteína A perlas por reacción de inmunoprecipitación con tampón A1 al menos tres veces para eliminar el etanol.A continuación, haga una solución de 50% de cordón con el búfer A1. Añadir dos microlitros de anticuerpos anti-GFP a las perlas. A continuación, agregue el búfer A1 a 20 veces el volumen neto del cordón. Realice una rotación de extremo a extremo a cuatro grados centígrados durante cuatro a 18 horas.La duración óptima de la rotación debe determinarse empíricamente en función de la eficiencia de la inmunoprecipitación. Después de la rotación, centrifugar las perlas a 100 veces g durante un minuto y retire el sobrenadante no enlazado. Añadir buffer A1 para hacer una solución del 50% de perlas y utilizar 25 microlitros de esta solución para cada reacción de inmunoprecipitación.Para realizar la inmunoprecipitación, licenciar las células en el tampón A1 a través de sonicación y congelación/descongelación. Mida las concentraciones de proteínas y normalice las cantidades de proteínas entre las diferentes muestras de IP. A continuación, retire el 5% de la muestra de cada tubo para que se ejecute en la página SDS.Mezclar el resto del anate con 25 microlitros de proteína A cuentas unidas a anticuerpos anti-GFP y realizar rotación de extremo a extremo a cuatro grados Celsius durante cuatro a 18 horas. Después de la eliminación de las células en el tampón A y la realización de la inmunoprecipitación como se ha descrito anteriormente, mantenga el 10% de los inmunoprecipitantes totales para confirmar la ubiculación EYFP CENP-A y para determinar con precisión la posición de EYFP CENP-A ubiquitida. Utilice el otro 90% para el análisis de espectrometría de masas.Ejecute la muestra de espectrometría de masas en un gel proteico 4-12%Bis-Tris disponible comercialmente. A continuación, realice la tinción azul de Coomassie e exprima la región de gel de 50-70 kilodalton para el análisis de espectrometría de masas. Corta cada rebanada de gel en trozos pequeños y colólas en un tubo de unión baja a proteínas de 0,5 mililitros.Lavar las piezas de gel con 100 microlitros de 50% acetonitrilo en bicarbonato de amonio de 25 milimolares. Vórtices durante 10-15 minutos. Luego gírelos hacia abajo y deseche el sobrenadante.Después del último lavado, seque las piezas de gel con un concentrador de vacío de sobremesa durante 30 minutos. Añadir 10 microlitros de 10 nanogramos por microlitros de grado de secuenciación de microlitros grado trippsina y dejar que las piezas de gel se rehidraten durante cinco minutos. A continuación, añadir 25 bicarbonato de amonio milimolar, lo suficiente para cubrir las piezas de gel y digerir a 37 grados Centígrados durante la noche.Al día siguiente, transfiera el sobrenadante digerido a un tubo siliconizado limpio de 0,65 mililitros y agregue 50%acetonitrilo y 5% solución de ácido fórmico. Vórtice la muestra durante 10 minutos. A continuación, gire hacia abajo y transfiera el sobrenadante a un tubo de extracción.Concentre la muestra de nuevo en dos microlitros. A continuación, agregue ocho microlitros de 3%acetonitrilo y 2%solución de ácido fórmico. Vórtice durante 15 minutos y gírtelo a 16.000 veces g durante 30 minutos.Realice la adquisición de datos MS con LC-MS/MS utilizando un sistema de cromatografía líquida junto con un instrumento de espectrometría de masas. Inyectar ocho microlitros de la muestra en una columna de cromatografía líquida de fase inversa y separar los péptidos con un gradiente de 2-80% de disolvente B en 60 minutos después de las instrucciones del manuscrito. Recopile datos de espectrometría de masas utilizando el modo de adquisición dependiente de datos.Abra el software comercial para analizar los datos de espectrometría de masas en el escritorio. Para iniciar una nueva búsqueda, haga clic en el botón LC del menú superior. A continuación, haga clic en el botón Agregar para cargar los archivos de datos sin procesar de MS originales.Seleccione el ID de proteína humana en el método paragon como método de búsqueda de base de datos y busque los archivos de datos sin procesar de MS originales en la base de datos UniProt homo sapiens. Seleccione la trippsina como enzima de digestión y establezca el resto de los parámetros de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Introduzca el nombre de archivo de los resultados y haga clic en el botón Guardar como situado a la derecha del menú.A continuación, seleccione una carpeta para almacenar los resultados de la búsqueda y haga clic en el botón Guardar. Haga clic en el botón de proceso para iniciar la búsqueda. Una vez finalizada la búsqueda, los datos con el nombre de búsqueda introducido se almacenarán automáticamente en la carpeta seleccionada.Para obtener los espectros de MS/MS de cualquier péptido específico, abra los resultados de búsqueda en el software F.A continuación, haga clic en la proteína en la lista de proteínas en el menú superior y haga clic en el péptido en el menú central. El MS/MS de este péptido aparecerá en la parte inferior del menú. Para exportar y guardar los espectros de MS/MS, copie los espectros y péguelos en un formato de archivo adecuado.Las construcciones genéticas de EYFP CENP-A tipo salvaje o mutante K124R que rescata la pérdida de CENP-A endógeno se expresaron de forma estable cuando se realizó la integración retroviral. La expresión de CENP-A endógeno no se detectó siete días después de la inducción de Cre recombinase. Se encontró que tanto el tipo salvaje EYFP CENP-A como la expresión de proteína K124R estaban en un nivel similar a la proteína CENP-A endógena inicial.Tanto los mutantes EYFP CENP-A como los mutantes K124R mostraron localización de centromere a los siete días después de la interrupción de la expresión restante de CENP-A endógeno. El tipo salvaje EYFP CENP-A y el mutante K124R mostraron ubiquitylation e interacción con HJURP a diferencia del caso para el tipo salvaje CENP-A marcado o sin etiquetar y el mutante K124R. La viabilidad celular se evaluó realizando el ensayo de crecimiento de la colonia 14 días después de la interrupción del alelo cenp-A endógeno restante.Tanto los mutantes EYFP CENP-A como los mutantes K124R mostraron un número similar de colonias rescatadas 14 días después de la interrupción del alelo cenp-A endógeno restante. La espectrometría de masas IP reveló la ubiculación a la lisina 306 en EYFP CENP-A K124R en células CENP-A menos F. En conjunto, estos resultados sugirieron que la fusión de proteína de gran tamaño induce la ubiculación a una lisina distinta de K124R en CENP-A que inhibe el fenotipo mutante único K124R original.Al intentar este protocolo, utilice los geles de proteína 4%12%Bis-Tris disponibles comercialmente para ejecutar las muestras de espectrometría de masas. Añadir la tripina adecuada a las piezas de gel y rehidratarlas hasta que todas las enzimas hayan sido absorbidas. En realidad, se requiere una técnica de etiquetado o sondeo de menor peso molecular para visualizar la ubiculación e investigar la señalización de la ubicuación de proteínas temporales espaciales a niveles y a niveles completos del organismo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un nuevo método que implica el análisis cuantitativo de FRET (transferencia de energía por resonancia de Förster) señales se describe para el estudio de la cinética de enzimas.

Cuantitativo FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster) Análisis para SENP1 Proteasa Determinación Kinetics

Este manuscrito describe la detección de sumoylation y ubiquitinación de proteínas del cinetocoro, Ndc10 y Ndc80, en la levadura Saccharomyces cerevisiae en ciernes.

Proteína técnica de purificación que permite la detección de Sumoylation y Ubiquitination de levadura en ciernes cinetocoro Proteínas Ndc10 y Ndc80

Aquí reportamos protocolos para detectar proteínas endógenas y exógenas de centrómero-cinetocoro en células humanas y cuantificar estos niveles de proteínas en centrómeros-cinetocoros mediante tinción inmunofluorescente indirecta mediante el uso de fijación (fijación de paraformaldehído, acetona o metanol).

Las proteínas Análisis de inmunofluorescencia de endógenos y exógenos Centrómero-cinetocoro

Investigando múltiples, modificaciones post-traduccionales endógenas para una proteína de la blanco pueden ser extremadamente difíciles. Técnicas descritas aquí utilizan un sistema de buffer y filtro de lisis optimizado desarrollado con metas específicas de PTM, matrices de afinidad para detectar las modificaciones de fosforilación de tirosina, acetilación, ubiquitinación y sumoilación 2/3 para un objetivo proteína mediante un sistema único y aerodinámico.

Utilizando un sistema de enriquecimiento integral inmunoprecipitación para identificar un perfil endógeno modificación poste-de translación de proteínas blanco

Quinasa dependiente de ciclina 1 (Cdk1) está activado en la fase G2 del ciclo celular y regula muchas vías celulares. Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de quinasa en vitro con Cdk1, que permite la identificación de sitios de fosforilación de Cdk1 específicos para establecer dianas celulares de esta quinasa importante.

Identificación de quinasa dependiente de ciclina 1 sitios específicos de fosforilación por una quinasa In Vitro ensayo

Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

Este protocolo tiene como objetivo establecer proteomes específicos de ubiquitina (Ub) y ubiquitinas (Ubls) con el fin de identificar alteraciones de este tipo de modificaciones post-traduccionales (PtM), asociadas a una condición específica como un tratamiento o un fenotipo.

Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas

Este método describe la evaluación de los cambios globales en la topología de la cadena de ubiquitina. La evaluación se realiza mediante la aplicación de un enfoque proteómico específico basado en espectrometría de masas.

Análisis de la cadena de ubiquitina por monitoreo paralelo de reacciones

Proporcionamos un protocolo detallado para un ensayo de ubiquitilación de un sustrato específico y una ubiquitina ligasa E3 en células de mamíferos. Se utilizaron líneas celulares HEK293T para la sobreexpresión de proteínas, el sustrato poliubiquitilado se purificó a partir de lisados celulares por inmunoprecipitación y se resolvió en SDS-PAGE. Se utilizó immunoblotting para visualizar esta modificación post-traduccional.

Evaluación de la ubiquitilación del sustrato por E3 Ubiquitina-ligasa en lisados de células de mamíferos

Aquí, presentamos un protocolo para permitir la captura e identificación de interacciones proteína-proteína específicas de la enfermedad de células y tejidos nativos utilizando sondas químicas y espectrometría de masas. Los conjuntos de datos de interacción resultantes se analizan a través de una plataforma web dedicada para revelar disfunciones dinámicas de la red y alteraciones de la vía relacionadas con la enfermedad.

Mapeo de interacciones proteína-proteína disfuncionales en la enfermedad

Aprende a identificar sitios de ubiquitylación en CENP-A con etiqueta EYFP mediante espectrometría de masas. Este método revela modificaciones postraduccionales esenciales para la función del centrómero y la viabilidad celular.

Análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiquitylación de CENP-A con etiqueta EYFP (EYFP-CENP-A)

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