Name: Síntesis De Aptamer-PEI-g-PEG Nanopartículas De Oro Modificadas Cargadas Con Doxorrubicina Para La Administración De Fármacos Dirigidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprende a sintetizar nanopartículas de oro modificadas con AS1411-g-PEI-g-PEG cargadas con doxorrubicina para terapia dirigida contra cáncer. Este método mejora la entrega selectiva del fármaco y reduce la toxicidad sistémica.

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Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31700840); el Proyecto clave de investigación científica de la provincia de Henan (18B430013, 18A150049). Esta investigación fue apoyada por el Nanhu Scholars Program for Young Scholars de XYNU. A los autores les gustaría agradecer al estudiante de licenciatura Zebo Qu de la Facultad de Ciencias de la Vida en XYNU por sus útiles trabajos. A los autores les gustaría agradecer al Centro de Análisis y Pruebas de XYNU por el uso de sus equipos.

PRECAUCIÓN: Asegúrese de consultar todas las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) relevantes antes de usar todos los productos químicos. Varios de los productos químicos utilizados para preparar copolímeros y nanopartículas son agudamente tóxicos. Las nanopartículas también tienen peligros potenciales. Asegúrese de usar todas las prácticas de seguridad y el equipo de protección personal apropiados, incluidos guantes, bata de laboratorio, capuchas, pantalones largos y zapatos de punta cerrada.
1. Síntesis de doble carboxilo polietilenglicol (CT-PEG)33
<ol><li>Añadir 1,46 g (14,6 mmol) de anhídrido succínico (SA) y 209 mg (1,71 mmol) de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) a un matraz inferior redondo de 100 ml.</li>
	<li>Añadir 15 ml de tetrahidrofurán anhidro (THF) al matraz utilizado en el paso 1.1 y colocar un tapón de vidrio. Mantenga el matraz a 0 °C durante 30 min.</li>
	<li>Añadir 4,28 g (4,28 mmol) de polietilenglicol (PEG) y 1,8 mL (12,8 mmol) de trietilamina (TEA) a un nuevo matraz.</li>
	<li>Añadir 15 ml de THF anhidro al matraz utilizado en el paso 1.3 y colocar un tapón de vidrio. Transferir la solución lentamente al matraz utilizado en el paso 1.2, utilizando una jeringa bajo atmósfera nitrogenada.</li>
	<li>Revuelva la solución a 0 °C durante 2 h y, a continuación, continúe la reacción a temperatura ambiente (RT) durante la noche.</li>
	<li>Con un evaporador rotatorio (40 °C, 0,1 MPa), concentre la solución de reacción y retire el disolvente THF.</li>
	<li>En RT, disuelva la solución de reacción a partir de la etapa 1,6 en 15 mL de 1,325 g/mL de diclorometano (DCM), a continuación, añadir 15 mL de éter dietílico frío (Et2O) para obtener el producto de precipitación (polietilenglicol diácido). Retire el disolvente mediante papel de filtro. NOTA: El paso de precipitación se puede repetir 3x.</li>
	<li>Secar los precipitados al vacío a RT durante 48 h.</li>
</ol>2. Síntesis del copolímero PEI-g-PEG
<ol><li>Añadir 305,47 mg de CT-PEG de los pasos 1,8 y 5 mL de dimetil sulfóxido (DMSO) a un matraz y remover en RT para asegurarse de que CT-PEG se disuelve completamente en DMSO.</li>
	<li>Disolver 49,46 mg de clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) en 5 mL de DMSO, después añadir la solución al matraz utilizado en el paso 2.1 y remover durante 30 min en RT.</li>
	<li>Disolver 29,69 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) en 5 mL de DMSO y añadir la solución al matraz utilizado en el paso 2.1. Continuar agitando en RT durante 3 h.</li>
	<li>Disolver 28,6 μL de polietilenoimina (PEI) en 10 mL de DMSO y añadir la solución gota a gota al matraz utilizado en el paso 2.1. Revuelva durante 3 días, al menos.</li>
	<li>Transferir la solución reaccionada del paso 2.4 a una bolsa de diálisis (corte de peso molecular de 1.000 [MWCO]). Coloque la bolsa de diálisis en un castor de 1 L con 500 mL de agua ultrapura como dializador. Cambiar el agua ultrapura cada 12 h durante 3 días.</li>
	<li>Transfiera la solución en el paso 2.5 a otra bolsa de diálisis (10.000 MWCO). Coloque la bolsa de diálisis en un castor de 1 L con 500 mL de agua ultrapura como dializador. Cambiar el agua ultrapura cada 12 h durante 3 días.</li>
	<li>Concentre la solución del paso 2.6 utilizando un evaporador rotativo (40 °C, 0.1 MPa) y liofile la muestra para obtener el polvo PEI-g-PEG.</li>
</ol>3. Síntesis de PEI-g-PEG@AuNPs
<ol><li>Disolver 5 mg de PEI-g-PEG preparado (paso 2.7) en 5 ml de agua ultrapura en un matraz nuevo y colocar con un tapón de vidrio.</li>
	<li>Añadir 100 mL de solución HAuCl4 de 0,3 mM al matraz y remover la solución durante 3 h al RT. NOTA: El color de la solución debe cambiar inmediatamente de amarillo a naranja.</li>
	<li>Añadir 1 mL de 1 mg/mL de naBH4 de solución al matraz y remover la solución durante 3 h al RT. NOTA: La solución de reacción debe girar instantáneamente burdeos.</li>
	<li>Dializar el producto de reacción utilizando una bolsa de diálisis (1.000 MWCO) durante 3 días como se describe en el paso 2.5 para obtener la solución pei-g-PEG@AuNPs.</li>
</ol>4. Síntesis de DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
<ol><li>Añadir 1 mL de solución DOX de 2,2 mg/ml y 20 mL de solución pei-g-PEG@AuNPs a un matraz nuevo y colocarlo con un tapón de vidrio.</li>
	<li>Disolver 0,727 mg de EDC en 1 mL de agua ultrapura y añadir la solución de EDC al matraz utilizado en el paso 4.1.</li>
	<li>Disolver 0,437 mg de NHS en 1 mL de agua ultrapura. Añadir la solución NHS al matraz y remover en RT durante 1 h.</li>
	<li>Dializar el producto de reacción utilizando una bolsa de diálisis (1.000 MWCO) durante 3 días como se describe en el paso 2.5 para obtener la solución DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.</li>
</ol>5. Síntesis de AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
<ol><li>Añadir 20 ml de solución DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs y 4OD de AS1411 (OD = densidad óptica; 1OD ≈ 33 μg) a un nuevo matraz.</li>
	<li>Disolver 28,76 mg de EDC en 1 mL de agua ultrapura y añadir la solución de EDC al matraz utilizado en el paso 5.1.</li>
	<li>Disolver 17,27 mg de NHS en 1 mL de agua ultrapura. Añadir la solución NHS al matraz utilizado en el paso 5.1 y remover la reacción durante 1 h al RT.</li>
	<li>Dializar el producto de reacción mediante el uso de una bolsa de diálisis (1.000 MWCO) durante 3 días como se describe en el paso 2.5 para obtener AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.</li>
</ol>6. Caracterización de la muestra
<ol><li>Disolver el polímero CT-PEG (paso 1.8) y el copolímero PEI-g-PEG (paso 2.7) en cloroformo-d en tubos de resonancia magnética nuclear (RMN), respectivamente. Analice las muestras utilizando un espectrómetro de RMN de 600 MHz equipado con un imán superconductor de 14,09 T y una sonda de alta resolución de gradiente Z de banda ancha de 5,0 mm a 600 MHz para confirmar la estructura química34.</li>
	<li>Dispersar AuNPs, DOX y AS1411, y preparar PEI-g-PEG@AuNPs (paso 3.4), DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (paso 4.4) y AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs (paso 5.4), respectivamente en agua ultrapura. Luego, transfiera a las cubetas y registre los espectros ultravioleta-visibles (UV-vis) usando un espectrofotómetro UV-vis.</li>
	<li>Conecte un adhesivo de doble cara (~ 2 mm x 2 mm) al papel de aluminio y sumerja la solución de muestra (PEI-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs y AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs) en toda la cinta de manera uniforme. Analice las muestras utilizando un analizador de espectroscopia de fotoelectrones de rayos X.</li>
	<li>Dispersar pei-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs y AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs, respectivamente en agua ultrapura. Luego, transfiera a las cubetas y evalúe la distribución del tamaño utilizando la dispersión dinámica de luz.</li>
	<li>Dispersar pei-g-PEG@AuNPs, DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs y AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en agua ultrapura (una gota de muestra por 5 mL de agua ultrapura para cada muestra). Sonicar durante 2 h. Sumerja la rejilla de cobre en soluciones de muestra y séquelas bajo una lámpara infrarroja. Caracterizar la morfología utilizando un microscopio electrónico de transmisión.</li>
	<li>Inyecte 1 mg de AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs en un casete de diálisis MWCO de 20 kDa, luego coloque 80 mL de solución salina tamponada con fosfato con albúmina sérica bovina (BSA) al 5%. Revuelva a 37 °C.</li>
	<li>En los puntos de tiempo predeterminados, recoja las alícuotas de 100 μL y reemplácelas con PBS fresco. Utilice un espectrofotómetro UV-vis para medir la intensidad de fluorescencia DOX de las alícuotas.</li>
</ol>7. Ensayo CCK-8 de nanopartículas AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs
<ol><li>Cultivar células A549 en el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con suero bovino fetal al 10%, 100 U/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina bajo una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO2 a 37 °C. Reemplace el medio de cultivo cada 2 días. Utilice las células en el paso 5 para los análisis de la proliferación de célula y de la citotoxicidad para evaluar cuantitativo la citotoxicidad de las nanopartículas preparadas de AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs.</li>
	<li>Añadir 100 μL de solución de nanopartículas en cada pozo que contenga 1 mL de medio celular. Después de cultivar durante 24 h y 48 h, retire el medio de cultivo de las placas de cultivo celular, luego agregue 300 μL de medios de cultivo frescos y 30 μL de soluciones de kit de conteo celular-8 (CCK-8) inmediatamente a cada pozo. Incubar durante 4 h en una incubadora de CO2 a 37 °C.</li>
	<li>Transfiera 200 μL de soluciones de reacción del paso 7.2 a una placa de 96 pozos. Lea la densidad óptica (OD) de cada pozo a 570 nm con un lector de microplacas.</li>
	<li>Observar la morfología de las células a las 24 h y 48 h bajo un microscopio.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El espectro de RMN 1H(Figura 2)confirma la síntesis exitosa del copolímero CT-PEG y del copolímero PEI-g-PEG. Los pesos moleculares de PEG y PEI fueron de 1.000 y 1.200, respectivamente. Además, se utilizó el sistema catalítico EDC/NHS para sintetizar el copolímero PEI-g-PEG mediante reacciones de amida. Cabe señalar que si los pesos moleculares de PEG y PEI cambiaron para sintetizar el copolímero PEI-g-PEG, entonces el tiempo de reacción y el sistema catalítico deben ser reevalua...

Siendo el principal problema de salud pública en todo el mundo, el cáncer se caracteriza ampliamente por tener una baja tasa de curación, alta tasa de recurrencia y alta tasa de mortalidad1,2. Los métodos anticancerígenos convencionales actuales incluyen cirugía, quimioterapia y radioterapia3,entre los cuales la quimioterapia es el tratamiento primario para los pacientes con cáncer en la clínica4. Los fármacos contra el cáncer utilizados clínicamente incluyen principalmente paclitaxel (PTX)5 y doxorrubicina (DOX)6,7. Dox, un fármaco antineoplásico, se ha aplicado ampliamente en la quimioterapia clínica, debido a las ventajas de la citotoxicidad del cáncer y la inhibición de la proliferación de células cancerosas8,9. Sin embargo, el DOX causa cardiotoxicidad10,11,y la corta vida media del DOX restringe su aplicación en la clínica12. Por lo tanto, los portadores degradables de la droga son necesarios cargar DOX y subquently liberar de una manera controlada a un área apuntada.
Las nanopartículas se han utilizado ampliamente en sistemas de administración de fármacos dirigidos y tienen varias ventajas en el tratamiento del cáncer (es decir, una relación superficie-volumen considerable, tamaño pequeño, capacidad para encapsular varios fármacos y química de superficie sintonizable, etc.) 13,14,15. En particular, las nanopartículas de oro (AuNPs) se han utilizado ampliamente en aplicaciones biológicas y biomédicas, como la terapia fototérmica contra el cáncer16,17. Las propiedades únicas de los AuNPs, como la síntesis fácil y la funcionalización general de la superficie, tienen excelentes perspectivas en el campo clínico de la terapia contra el cáncer18. Además, los AuNPs se han utilizado para identificar estrategias de administración de fármacos, diagnosticar tumores y superar la resistencia en muchos estudios19,20.
No obstante, los AuNPs necesitan ser adaptados más a fondo para superar resistencia a los medicamentos vía el alto lanzamiento local en las lesiones del tumor con la permeación y la retención aumentadas (EPR), tales como las propiedades de la blanco y de la accesibilidad. Los AuNPs funcionalizados con polímeros han exhibido ventajas únicas, como la mejora de la solubilidad en agua de los fármacos hidrofóbicos contra el cáncer y el tiempo de circulación prolongado21,22. Se han utilizado varios polímeros biocompatibles para recubrimientos de AuNP, como el polietilenglicol (PEG), la polietilenimina (PEI), el ácido hialurónico, la heparina y la goma xantana. Entonces la estabilidad, así como la carga útil, de AuNPs se mejora bien23. Específicamente, pei es un polímero altamente ramificado que se compone de muchas unidades de repetición de aminas primarias, secundarias y terciarias24. PEI tiene una excelente solubilidad, baja viscosidad y un alto grado de funcionalidad, que es adecuado para el recubrimiento en AuNPs.
Por otro lado, los fármacos anticancerígenos deben ser entregados a las células cancerosas directamente con una mejor eficiencia de carga, y con menor toxicidad para el tratamiento de tumores metastásicos primarios y avanzados25. Los ligandos dirigidos tienen un gran potencial para los sistemas de administración dirigidos a fármacos contra el cáncer26. Su selectividad para la unión a moléculas diana confiere especificidad a los fármacos contra el cáncer y aumenta el enriquecimiento de fármacos en tejidos enfermos27. Más ligandos incluyen anticuerpos, polipéptidos y moléculas pequeñas. En comparación con otros ligandos, los aptámeros de ácidos nucleicos se pueden sintetizar in vitro y son fáciles de modificar. AS1411 es un oligonucleótido fosfodiester de 26 pb no modificado que forma una estructura dimérica estable de G-tetrámero para unirse específicamente a un receptor de proteína nuclear objetivo sobreexpresado en las células cancerosas28,29,30. AS1411 inhibe la proliferación de muchas células cancerosas pero no afecta el crecimiento de células sanas31,32. Como resultado, AS1411 se ha utilizado para fabricar un sistema ideal de administración de fármacos dirigidos.
En este estudio, un copolímero PEI-g-PEG se sintetiza a través de una reacción de amida, a continuación, se fabrican nanopartículas de oro recubiertas de copolímero PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs). Además, DOX y AS1411 están vinculados secuencialmente a la PEG@AuNPs PEI-g preparada, como se muestra en la Figura 1. Este protocolo detallado está destinado a ayudar a los investigadores a evitar muchos de los escollos comunes asociados con la fabricación de nuevos PEI-g-PEG@AuNPs cargados con DOX y AS1411.

<table><tbody><tr><td>4-Dimetilaminopiridina</td><td>Macklin</td><td>D807273</td><td></td></tr><tr><td>A549 celda</td><td></td><td>ATCC CCL-185TM</td><td></td></tr><tr><td>AS1411</td><td>BBI Life Sciences Corporation</td><td></td><td>5'-d (TTTGGTGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT) FL-AS1411 (marcado con fluoróforos AS1411)</td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano anhidro (THF)</td><td>SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de recuento de células-8 ( CCK-8)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>96992-500TESTS-F</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Medicina tradicional china</td><td>80047318</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico (Et2O)</td><td>SinoPharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Macklin</td><td></td><td>D806645</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medio (DMEM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de doxorrubicina</td><td>Rhawn</td><td>R017518</td><td></td></tr><tr><td>absoluto de éter</td><td>Medicina tradicional china</td><td>80059618</td><td></td></tr><tr><td>Emisión de campo Microscopio electrónico de transmisión</td><td>FEI Empresa FEI Tecnai</td><td>G2 F 20</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de oro (III) trihidrato Rhawn</td><td></td><td>R016035</td><td></td></tr><tr><td>Láser Instrumento de tamaño de partícula Malvern</td><td>Instruments Ltd</td><td>ZetasizerNanoZS/ Masterszer3000E</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 190</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida</td><td>Macklin</td><td>N808856</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroxisuccinimida</td><td>Macklin</td><td>H6231</td><td></td></tr><tr><td>Software de RMN</td><td>Delta 5.2.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de resonancia magnética nuclear</td><td>JEOL</td><td>JNM-ECZ600R/S3</td><td></td></tr><tr><td>Origin 8.5</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900929-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilenglicol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81188</td><td>BioUltra, promedio Mn ~ 1000</td></tr><tr><td>Solución de poli (etileneimina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>482595</td><td>promedio Mn ~ 1200, 50 % en peso en H2O</td></tr><tr><td>Borohidruro de sodio, polvo</td><td>Acros</td><td>C18930</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>85886-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido succínico</td><td>Medicina tradicional china</td><td>30171826</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano</td><td>Medicina tradicional china</td><td>40058161</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Medicina tradicional china</td><td>80134318</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro UV/VIS/NIR</td><td>Lambda950</td><td>Lambda950</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de fotoelectrones de rayos X</td><td>Thermo&ensp; Fisher&ensp; Científico</td><td>K-ALPHA 0.5EV</td><td></td></tr></tbody></table>

síntesis de aptamer-pei-g-peg nanopartículas de oro modificadas cargadas con doxorrubicina para la administración de fármacos dirigidos

Synthesis of Aptamer-PEI-g-PEG Modified Gold Nanoparticles Loaded with Doxorubicin for Targeted Drug Delivery

Debido a la resistencia a los medicamentos y a la toxicidad en células sanas, el uso del doxorubicin (DOX) se ha limitado en terapia clínica del cáncer. Este protocolo describe el diseño de poli(etilenimina) injertado con polietilenglicol (PEI-g-PEG) copolímero funcionalizado nanopartículas de oro (AuNPs) con aptámero cargado (AS1411) y DOX a través de reacciones de amida. AS1411 se une específicamente con los receptores de nucleolina dirigidos en las células cancerosas para que DOX se dirija a las células cancerosas en lugar de las células sanas. Primero, la CLAVIJA es carboxylated, después injertada a PEI ramificado para obtener un copolímero de PEI-g-PEG, que es confirmado por el análisis de 1H NMR. A continuación, se sintetizan nanopartículas de oro recubiertas de copolímero PEI-g-PEG (PEI-g-PEG@AuNPs), y DOX y AS1411 se unen covalentemente a AuNPs gradualmente a través de reacciones de amida. El diámetro del AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs preparado es de ~39,9 nm, con un potencial zeta de -29,3 mV, lo que indica que las nanopartículas son estables en agua y medio celular. Los ensayos de citotoxicidad celular muestran que los AuNPs cargados de DOX de nuevo diseño son capaces de matar las células cancerosas (A549). Esta síntesis demuestra la delicada disposición de los copolímeros PEI-g-PEG, aptámeros y DOX en AuNPs que se logran mediante reacciones secuenciales de amida. Tales AuNPs funcionalizados aptamer-PEI-g-PEG proporcionan una plataforma prometedora para la entrega de la droga apuntada en terapia del cáncer.

1 Se utilizó la espectroscopia de RMN H para confirmar la síntesis exitosa de polímero CT-PEG y copolímeros PEI-g-PEG(Figura 2). La Figura 2a muestra que la señal de protones de metileno a δ = 3,61 ppm y la señal de protones carboxilos a δ = 2,57 ppm confirman la síntesis exitosa de polímeros CT-PEG. La Figura 2b muestra que la señal de protones de metileno de PEG a δ = 2,6 ppm y la señal de pro...

En este protocolo, las nanopartículas de oro modificadas con doxorrubicina AS1411-g-PEI-g-PEG se sintetizan a través de reacciones de amida de tres pasos. Luego, la doxorrubicina se carga y se administra a las células cancerosas diana para el tratamiento del cáncer.

Síntesis De Aptamer-PEI-g-PEG Nanopartículas De Oro Modificadas Cargadas Con Doxorrubicina Para La Administración De Fármacos Dirigidos

Due to drug resistance and toxicity in healthy cells, use of doxorubicin (DOX) has been limited in clinical cancer therapy. This protocol describes the ...

Debido a la resistencia y toxicidad de los medicamentos, el uso de doxorrubicina es limitado en la clínica. Este protocolo proporciona un portador degradable para mantener la liberación de este agente terapéutico. La ventaja de este método es que el portador sintetizado se puede utilizar para administrar el fármaco directamente a las células cancerosas, induciendo la muerte celular solo en las células cancerosas.Para la síntesis de CT-PEG, primero agregue 1,46 gramos de anhídrido succínico y 209 miligramos de 4-dimetilaminopiridina a un matraz de fondo redondo de 100 mililitros. A continuación, añada 15 mililitros de tetrahidrofurano anhidro al matraz y coloque un tapón de vidrio en el matraz, antes de incubar la reacción durante 30 minutos a cero grados centígrados. Durante la incubación, añadir 4,208 gramos de PEG, 1,8 mililitros de trietilamina y 15 mililitros de tetrahidrofurano anhidro a un matraz nuevo y cerrar el matraz con un tapón de vidrio.Al final de la incubación, use una jeringa bajo atmósfera de nitrógeno para transferir lentamente la segunda solución al primer matraz. Revuelva la nueva solución durante dos horas a cero grados centígrados, antes de continuar la reacción a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, utilice un evaporador rotativo a 40 grados centígrados y 0,1 megapascales para concentrar la solución de reacción y eliminar el disolvente de tetrahidrofurano.Después de una hora, disuelva la solución de reacción en 15 mililitros de 1.325 gramos por mililitro de diclorometano a temperatura ambiente, antes de agregar 15 mililitros de éter dietílico frío para obtener el producto de precipitación de diácido PEG. A continuación, retire el disolvente con papel de filtro y seque el precipitado al vacío durante 48 horas a temperatura ambiente. Para la síntesis de copolímeros PEI-g-PEG, agregue 305,47 miligramos de precipitado CT-PEG y cinco mililitros de DMSO a un matraz nuevo y agite la reacción a temperatura ambiente hasta que el CT-PEG se disuelva por completo.A continuación, disuelva 49,46 miligramos de EDC en cinco mililitros de DMSO y añada la solución al matraz. Agite la reacción durante 30 minutos a temperatura ambiente, antes de disolver 29,69 miligramos de N-hidroxisuccinimida y cinco mililitros de DMSO y agregar la solución resultante al matraz. Continúe revolviendo la reacción durante tres horas a temperatura ambiente.Cerca del final de la incubación, disuelva 28,6 microlitros de PEI en 10 mililitros de DMSO y agregue la solución gota a gota al matraz. Revuelva la reacción a temperatura ambiente durante al menos tres días. Al final de la incubación, transfiera la solución reaccionada a una bolsa de diálisis con un límite de 1000 pesos moleculares y coloque la bolsa en un vaso de precipitados de un litro que contenga 500 mililitros de agua ultrapura como dializado.Al final de la diálisis, transfiera la solución a una bolsa de diálisis con un límite de 10.000 pesos moleculares y coloque la bolsa en un vaso de precipitados de un litro con 500 mililitros de agua ultrapura como dializado. Al final de la segunda diálisis, utilice un evaporador rotativo a 40 grados centígrados y 0,1 megapascales para concentrar la solución y liofilizar la muestra para obtener el polvo de PEI-g-PEG. Para el recubrimiento de nanopartículas de oro con el producto PEI-g-PEG, disuelva cinco miligramos del PEI-g-PEG preparado en cinco mililitros de agua ultrapura en un matraz nuevo y coloque el matraz con un tapón de vidrio.Añada 100 mililitros de solución de cloruro áurico de 0,3 milimolares al matraz y agite la solución durante tres horas a temperatura ambiente. Los colores deben cambiar inmediatamente de amarillo claro a amarillo oscuro. Al final de la incubación, agregue un mililitro de un miligramo por mililitro de solución de borohidruro de sodio al matraz.El color debe cambiar inmediatamente de amarillo oscuro a amarillo dorado y remover la solución durante tres horas más a temperatura ambiente. A continuación, dialice el producto de reacción con una bolsa de diálisis de corte de 1000 pesos moleculares durante tres días, como se ha demostrado para obtener la solución de nanopartículas de oro recubierta de PEI-g-PEG. Para el injerto de doxorrubicina en las nanopartículas de oro recubiertas de PEI-g-PEG.Añada un mililitro de 2,2 miligramos por mililitro de solución de doxorrubicina y 20 mililitros de la solución de nanopartículas de oro recubierta de PEI-g-PEG a un matraz nuevo y coloque el matraz con un tapón de vidrio. A continuación, disuelva 0,727 miligramos de EDC en un mililitro de agua ultrapura y añada la solución de EDC al matraz. Disuelva 0,437 miligramos de N-hidroxisuccinimida en un mililitro de agua ultrapura y agregue la solución de N-hidroxisuccinimida al matraz para una incubación de una hora con agitación a temperatura ambiente.Al final de la incubación, dialice el producto de la reacción en una bolsa de diálisis de corte de 1000 pesos moleculares durante tres días, como se demostró para obtener la solución de nanopartículas de oro recubierta de doxorrubicina g-PEI-g-PEG. Para el injerto del aptámero AS1411 en el DOX-g-PEI-g-PEG. Agregue 20 mililitros de la solución de nanopartículas de oro recubierta con doxorrubicina DOX-g-PEI-g-PEG a una concentración de aproximadamente cuatro densidades ópticas de AS1411.Disuelva 28,76 miligramos de EDC en un mililitro de agua ultrapura y agregue la solución de EDC al matraz. Disuelva 17,27 miligramos de N-hidroxisuccinimida en un mililitro de agua ultrapura y agregue la solución de N-hidroxisuccinimida al matraz para una incubación de una hora con agitación a temperatura ambiente. A continuación, dialice el producto de la reacción en una bolsa de diálisis de corte de 1000 pesos moleculares durante tres días, como se ha demostrado para obtener nanopartículas de oro recubiertas de AS1411-g-Doxorrubicina-g-PEI-g-PEG.La espectroscopia de RMN de protones se puede utilizar para confirmar la síntesis exitosa de polímeros CT-PEG y copolímeros PIE-g-PEG. La espectroscopia ultravioleta se puede llevar a cabo para determinar la funcionalización exitosa y la carga gradual del copolímero preparado en nanopartículas de oro. La espectroscopia de fotoelectrones de rayos X se puede utilizar para investigar el enlace químico del copolímero en las nanopartículas de oro.La dispersión dinámica de la luz se puede realizar para determinar la distribución del tamaño de las nanopartículas preparadas. En este análisis, la microscopía electrónica de transmisión reveló nanopartículas no agrupadas con una morfología uniforme. El análisis de viabilidad celular reveló una disminución en el número de células A549 con el tiempo y en respuesta al aumento de las concentraciones de nanopartículas.Sin embargo, en comparación con el grupo de doxorrubicina libre, el número de células aumentó, lo que indica una menor toxicidad. Además, el análisis del perfil de liberación de doxorrubicina revela que la liberación sostenida de doxorrubicina de nanopartículas funcionalizadas causó una disminución en las células A549. La preparación del copolímero PEI-g-PEG y los pasos de injerto AS1411 son importantes para el éxito de la implementación del procedimiento.El mismo portador de fármaco se puede lograr injertando AS1411 antes de injertar fármacos, pero la eficiencia de la carga del fármaco disminuirá.

synthesis-aptamer-pei-g-peg-modified-gold-nanoparticles-loaded-with

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Síntesis De Aptamer-PEI-g-PEG Nanopartículas De Oro Modificadas Cargadas Con Doxorrubicina Para La Administración De Fármacos Dirigidos (Video) | JoVE Journal

Síntesis De Aptamer-PEI-g-PEG Nanopartículas De Oro Modificadas Cargadas Con Doxorrubicina Para La Administración De Fármacos Dirigidos

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