Name: Generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunosuización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Aprende a generar organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas usando biorreactores de un solo uso. Este método escalable permite estudiar el desarrollo cerebral y evaluar fármacos terapéuticos.

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Esta obra fue apoyada por la Fundación Para la Ciudad y la Tecnología (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 a través del Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Proyecto N. 007317, PD/BD/105773/2014 a T.P.S y PD/BD/128376/2017 a D.E.S.N.), proyectos cofinanciados por FEDER (POR Lisboa 2020—Programación Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 32020) y FCT a través de la subvención PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 y CEREBEX Generación de Organoides Cerebelosos para Ataxia Research subvención LISBOA-01-0145-FEDER-029298. La financiación también se recibió del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea, en virtud del Acuerdo de Subvención número 739572—El Centro de Descubrimientos de Medicina Regenerativa y de Precisión H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

1. Aprobación y mantenimiento de iPSC humanos en cultivo monocapa
<ol><li>Preparación de placas<ol>
<li>Descongelar la matriz de membrana del sótano (ver Tabla de Materiales)a 4oC y preparar alícuotas de 60 l. Congele las alícuotas a -20 oC.</li>
		<li>Para cubrir los pozos de una placa de 6 pozos, descongele una alícuota de la matriz de membrana del sótano sobre hielo. Una vez descongelado añadir 60 s a 6 ml de DMEM-F12. Resuspend suavemente pipeteando arriba y abajo.</li>
		<li>Añadir 1 ml de solución de matriz de membrana sótano diluida a cada pozo de una placa de 6 pozos e incubar en RT durante al menos 1 h antes de pasar o almacenar a 4 oC durante un máximo de 1 semana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transmisión de colonias iPSC con EDTA<ol>
<li>Mantener los iPSC en cultivo monocapa en 6 placas de pozo en la incubadora a 37oC, 95% de humedad y 5% co2. NOTA: En este protocolo, se utilizaron tres líneas iPSC humanas distintas: F002.1A.1321, línea iPSC episómico humana (iPSC6.2)22y iPS-DF6-9-9T.B obtenida comercialmente (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Antes de la venta, incubar las placas almacenadas (paso 1.1) a temperatura ambiente (RT) durante 15 min y preparar el medio mTesR1 (Tabla 1).</li>
		<li>Aspirar la solución de la placa con una pipeta serológica y añadir inmediatamente 0,5 ml de medio mTeSR1 a cada pozo.</li>
		<li>Aspirar el medio gastado del pozo que contiene iPSC y lavar una vez usando 1 mL de EDTA de 0,5 mM por poc.</li>
		<li>Añadir 1 ml de EDTA de 0,5 mM a cada pozo e incubar a RT durante 5 min.</li>
		<li>Aspirar EDTA y retirar las células de los pozos añadiendo suavemente mTeSR1 medio y pipeteando las colonias utilizando una micropipeta P1000. Recoger las células en un tubo cónico. NOTA: No pipetee las celdas hacia arriba y hacia abajo más de 3x.</li>
		<li>Añadir 1 ml de suspensión celular (diluida 1:4) a cada pozo para que cada pozo contenga 1,5 ml de medio después de añadir la suspensión celular. Devolver las células a la incubadora a 5% de CO2,37 oC.</li>
		<li>Reemplazar el medio gastado diario y el paso cada 3 días cuando se logra una confluencia del 75% al 80%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Siembra de iPSC humanos en el biorreactor
<ol><li>Incubar iPSCs cultivados como monocapas en mTeSR1 complementado con 10 m de inhibidor de ROCK Y-27632 (ROCKi). Añadir 1 ml de medio suplementado a cada pozo de una placa de cultivo de tejido de 6 pozos e incubar durante 1 h a 37 oC, 95% de humedad y 5% de CO2. NOTA: ROCKi se utiliza para proteger los iPSC disociados de la apoptosis23.</li>
	<li>Después de 1 h de incubación, aspirar el medio gastado de cada pocómo y lavar 1x con 1 ml de 1× PBS por pozo.</li>
	<li>Añadir 1 ml del medio de desprendimiento celular (ver Tabla de Materiales)a cada pozo de una placa de 6 pozos e incubar a 37oC durante 7 min hasta que las células se desprenden fácilmente de los pozos con un suave temblor.</li>
	<li>Pipetear el medio de desprendimiento de la célula hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta P1000 hasta que las células se desasociquen y se disocian en células individuales. Añadir 2 ml de medio de cultivo celular completo a cada pozo para inactivar la digestión enzimática y pipetear las células suavemente en un tubo cónico estéril.</li>
	<li>Centrifugar a 210 × g durante 3 min y retire el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el pellet celular en un medio de cultivo (es decir, mTeSR1 complementado con 10 m de ROCKi) y contar los iPSC con un hemocicómetro utilizando tinte azul tripano.</li>
	<li>Semilla 15 × 106 células individuales en el biorreactor (volumen máximo de 100 ml) con 60 ml de mTeSR1 complementado con 10 m de ROCKi a una densidad de células final de 250.000 células/ml.</li>
	<li>Inserte el recipiente que contiene los iPSC en la unidad base universal colocada en la incubadora a 37oC, 95% de humedad y 5% de CO2. NOTA: La agitación del biorreactor se mantiene durante 24 horas ajustando el control universal de la unidad base a 27 rpm para promover la agregación iPSC.</li>
</ol>3. Diferenciación y maduración de los agregados humanos derivados del iPSC en organoides cerebelosos
<ol><li>Defina el día de la siembra de una sola celda como el día 0.</li>
	<li>El día 1, recoja 1 ml de la muestra de agregados iPSC utilizando una pipeta serológica. Mantener el biorreactor bajo agitación como antes colocando la unidad base universal con el biorreactor que contiene los agregados en un flujo estéril antes de recoger la muestra. Placa la suspensión celular en una placa de 24 pozos de fijación ultrabajo. Compruebe que se forman agregados derivados de iPSC.</li>
	<li>Adquiera imágenes con un microscopio óptico utilizando un aumento total de 40x o 100x para medir el diámetro agregado.</li>
	<li>Mida el área de los agregados en cada imagen utilizando el software FIJI.<ol>
<li>Seleccione "Analizar ? Establecer medidas" en la barra de menú y haga clic en "Area" y "OK".</li>
		<li>Seleccione "Archivo ? Abra" en la barra de menús para abrir un archivo de imagen almacenado. Seleccione la herramienta de selección de líneas presentada en la barra de herramientas y cree una línea recta sobre la barra de escala presentada en la imagen. Seleccione "Analizar ? Ajuste la escala" en la barra de menús.</li>
		<li>En "Distancia conocida",añade la extensión de la barra de escala de la imagen en m. Defina la"Unidad de longitud"como m. Haga clic en "Global" para mantener la configuración y "OK". Seleccione Selección ovalada en la barra de herramientas.</li>
		<li>Para cada agregado, defina el área con la herramienta ovalada. Seleccione "Analizar ? Medir". Calcular su diámetro en función del área medida, teniendo en cuenta que los agregados son aproximadamente esféricos <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61143/61143equ01.jpg"> con A como área del agregado.</li>
	</ol></li>
	<li>Cuando el diámetro medio de los agregados sea de 100 m, sustituya el 80% del medio gastado por mTeSR1 fresco sin ROCKi. Cuando los agregados alcancen 200–250 m de diámetro, reemplace todo el medio gastado con gfCDM (Tabla 1), dejando que los organoides se asienten en la parte inferior del biorreactor. NOTA: Si el diámetro medio del agregado supera los 350 m, no inicie el protocolo de diferenciación. Repita la siembra de celdas individuales. Por lo general, el agregado tarda alrededor de 1 día en alcanzar un diámetro medio de 100 m.</li>
	<li>Inserte el biorreactor que contiene los agregados en la unidad base universal colocada en la incubadora a 37oC, 95% de humedad y 5% co2.</li>
	<li>Disminuya la agitación del biorreactor a 25 rpm.</li>
	<li>En el día 2, repita los pasos 3.2, 3.3 y 3.4 para evaluar el diámetro agregado. Añadir 30 l de FGF2 (concentración final, 50 ng/mL) y 60 l de SB431542 (concentración final, 10 oM) a 60 ml del medio de diferenciación de gfCDM(Tabla 1). Sustituya todo el medio gastado del biorreactor por el gfCDM suplementado. Repita el paso 3.6. NOTA: SB431542 es crucial para inhibir la diferenciación mesendodérmica, induciendo la diferenciación neuronal24. FGF2 se utiliza para promover la caudalización del tejido neuroepitelial25.</li>
	<li>En el día 5, repita los pasos 3.2, 3.3, 3.4 y 3.8. NOTA: El tamaño agregado debe aumentar durante el protocolo de diferenciación. Sin embargo, el diámetro sólo es crítico cuando comienza la diferenciación, ya que este parámetro podría influir en la eficacia de la diferenciación.</li>
	<li>En el día 7, repita los pasos 3.2, 3.3 y 3.4. Diluir FGF2 y SB431542 a 2/3: Añadir 20 s de FGF2 y 40 l de SB431542 a 60 mL de medio de diferenciación de gfCDM. Sustituya todo el medio gastado del biorreactor por un gfCDM suplementado. Repita el paso 3.6 y aumente la agitación del biorreactor a 30 rpm.</li>
	<li>En el día 14, repita los pasos 3.2, 3.3 y 3.4. Añadir 60 l de FGF19 (concentración final, 100 ng/mL) a 60 ml del medio de diferenciación de gfCDM. Sustituya todos los medios gastados del biorreactor por gfCDM complementados con FGF19. Repita el paso 3.6. NOTA: FGF19 se utiliza para promover la polarización de las estructuras de lasbras de la mitad del hindbra26.</li>
	<li>En el día 18, repita los pasos 3.2, 3.3, 3.4 y 3.11.</li>
	<li>En el día 21, repita los pasos 3.2, 3.3 y 3.4. Sustituya todo el medio gastado del biorreactor por un medio neurobasal completo(Tabla 1). Repita el paso 3.6. NOTA: El medio neurobasal es un medio basal utilizado para mantener la población celular neuronal dentro del organoide7.</li>
	<li>En el día 28, repita los pasos 3.2, 3.3 y 3.4. Añadir 180 l de SDF1 (concentración final, 300 ng/ml) a 60 ml de medio neurobasal completo. Sustituya todo el medio gastado del biorreactor por un medio neurobasal completo complementado con SDF1. Repita el paso 3.6. NOTA: SDF1 se utiliza para facilitar la organización de capas de celdas distintas27.</li>
	<li>En el día 35, repita los pasos 3.2, 3.3 y 3.4. Sustituya todo el medio gastado del biorreactor por el medio completo de BrainPhys(Tabla 1). Repita el paso 3.6. NOTA: BrainPhys es un medio neuronal que soporta neuronas sinápticamente activas28.</li>
	<li>Reemplace 1/3 del volumen total cada 3 días con un medio completo de BrainPhys hasta el día 90 de diferenciación.</li>
</ol>4. Preparación de organoides para criocesión e inmunohistoquímica
<ol><li>Colección de organoides para inmunosumante<ol>
<li>Recoger 1 ml de muestra de medio que contenga organoides con una pipeta serológica del biorreactor a un tubo cónico de 15 ml. NOTA: Los organoides deben recogerse en diferentes momentos para evaluar la eficacia de la diferenciación, incluidos los días 7, 14, 21, 35, 56, 70, 80 y 90.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y lávelo una vez con 1 ml de 1× PBS. NOTA: No centrifugar los organoides. Deje que los organoides se asienten en la parte inferior del tubo por gravedad.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y agregue 1 ml de 4% de paraformaldehído (PFA). Incubar a 4oC durante 30 min. Quite el PFA gastado y agregue 1 mL de 1× PBS.</li>
		<li>Conservar los organoides en 1 ml de 1× PBS a 4 oC hasta su procesamiento para criocisiones. NOTA: Almacene los organoides en 1x PBS durante no más de 1 semana después de la fijación.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de organoides para la criocesión<ol>
<li>Retire el sobrenadante de los organoides almacenados. Añadir 1 ml de sacarosa al 15% (p/v, diluida en 1× PBS), mezclar bien por remolinos suaves e incubar durante la noche a 4oC.</li>
		<li>Preparar una solución de 15% de sacarosa/7,5% de gelatina(Tabla 2) y mantener a 37oC durante la preparación para evitar que la gelatina se solidifique.</li>
		<li>Retire la solución de sacarosa al 15%, añada 1 ml de sacarosa al 15% /7,5% de gelatina a los organoides, y mezcle rápidamente mediante un suave remolino. Incubar a 37oC durante 1 h.</li>
		<li>Añadir 15% de sacarosa/7,5% de solución de gelatina a un recipiente de plástico hasta la mitad de su volumen. Espere a la solidificación en RT.</li>
		<li>Después de una incubación de 1 h, coloque cuidadosamente una gota de sacarosa/gelatina que contenga los organoides en la gelatina solidificada con una pipeta Pasteur. Dejar solidificar en RT durante unos 15 min. Asegúrese de evitar la formación de burbujas.</li>
		<li>Coloque 15% de sacarosa/7,5% de gelatina encima de los organoides hasta que el recipiente esté lleno. Espere a que se complete la solidificación en RT.</li>
		<li>Después de la solidificación, incubar 20 min a 4oC.</li>
		<li>Cortar la gelatina en un cubo que contiene los organoides en el centro y fijar el cubo de gelatina en un pedazo de cartón con una gota de O.C.T. compuesto.</li>
		<li>Colocar 250 ml de isopentano en una taza de 500 ml y llenar un recipiente apropiado con nitrógeno líquido. Usando fórceps y guantes gruesos, coloque cuidadosamente la copa que contiene isopentano en la superficie de nitrógeno líquido y enfríe el isopentano a -80 oC.</li>
		<li>Cuando se alcance -80 oC, coloque el cubo de gelatina en la taza que contiene isopentano hasta que se congele, manteniendo la temperatura a -80 oC. Dependiendo del tamaño del cubo, puede tardar de 1 a 2 minutos. NOTA: Evite temperaturas por debajo de -80 oC o tiempo de congelación excesivo, ya que podría causar agrietamiento del cubo.</li>
		<li>Cuando esté congelado, almacene rápidamente el cubo de gelatina a -80 oC y guárdelo hasta que se crioce.</li>
	</ol></li>
	<li>Criosectación de organoides<ol>
<li>Encienda el criostato y defina las temperaturas tanto de la muestra (OT) como de la criocámara (CT) a -25 oC.</li>
		<li>Cuando ambas temperaturas se estabilicen, fije el cubo de gelatina que contiene los organoides en la muestra utilizando el compuesto O.C.T.</li>
		<li>Defina el espesor de la sección a 12 m.</li>
		<li>Cortar el cubo y recoger 3-4 rodajas en diapositivas de microscopio de adhesión (ver Tabla de materiales).</li>
		<li>Conservar a -20oC hasta su uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Inmunostaining of organoids slices<ol>
<li>Coloque las diapositivas del microscopio que contienen secciones organoides en un frasco de copling con 50 ml de PBS preadprimido 1x, sosteniendo hasta 10 diapositivas de espaldas. NOTA: Todas las secciones organoides deben sumergirse con líquido.</li>
		<li>Incubar durante 45 min a 37oC para desgelatinizar los portaobjetos.</li>
		<li>Lavar 1x con 50 ml de 1× PBS durante 5 minutos en RT: Transfiera las diapositivas a un frasco de acazgas que contenga 1× PBS fresco.</li>
		<li>Transfiera los portaobjetos a un frasco de copling que contenga 50 ml de glicina recién preparada(Tabla 2)e incubar durante 10 minutos en RT.</li>
		<li>Transfiera las diapositivas a un frasco de acapulado que contenga 50 ml de tritón al 0,1% (Tabla 2) y permeabilizar durante 10 minutos en RT.</li>
		<li>Lavar con 1× PBS durante 5 min 2x.</li>
		<li>Prepare el plato de inmunosu mancha con papel de 3 mm empapado en 1× PBS. Seque los portaobjetos con un pañuelo alrededor de las rodajas y colóquelas en papel de 3 mm. Con una pipeta Pasteur, cubra toda la superficie de las diapositivas con solución de bloqueo (Tabla 2) con 0,5 ml por diapositiva. Incubar durante 30 min en RT.</li>
		<li>Retire el exceso de solución de bloqueo y seque los portaobjetos con un pañuelo alrededor de las rodajas. Colocar 50 l del anticuerpo primario (Tabla 3) diluido en solución de bloqueo sobre las secciones y cubrir con los cubreobjetos. Coloque las rodajas en un plato de inmunosuchado previamente preparado. Incubar durante la noche a 4oC.</li>
		<li>Transfiera los portaobjetos a un frasco de copling con 50 ml de TBST (Tabla 2), deje caer los cubreobjetos y lave con TBST durante 5 min 3x.</li>
		<li>Colocar 50 l del anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo sobre las secciones y cubrir con los cubreobjetos. Coloque las rodajas en el plato de inmunostaining previamente preparado. Incubar durante 30 minutos en RT, protegido de la luz.</li>
		<li>Transfiera los portaobjetos a un frasco de copling de nuevo y lave con 50 ml de TBST durante 5 min 3x.</li>
		<li>Seque los portaobjetos con un pañuelo alrededor de las rodajas y coloque las rodajas en un plato de inmunostaining previamente preparado. Añadir 0,5 ml de solución DAPI sobre toda la superficie de los portaobjetos con una pipeta Pasteur. Incubar durante 5 min en RT.</li>
		<li>Repita el paso 4.4.9.</li>
		<li>Seque cuidadosamente los portaobjetos con un pañuelo. Agregue 50 sl de medio de montaje gota a gota a lo largo de la diapositiva y luego baje cuidadosamente un cubreobjetos en cada diapositiva, doblando ligeramente para evitar burbujas.</li>
	</ol></li>
</ol>

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Los autores YH y SJ son empleados de PBS Biotech. El autor BL es CEO y cofundador de PBS Biotech, Inc. Estos autores colaboradores participaron en el desarrollo de los biorreactores utilizados en el manuscrito. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de la revista sobre el intercambio de datos y materiales. Todos los demás autores no declaran ningún conflicto de intereses.

La necesidad de grandes números de células, así como condiciones de cultivo definidas para generar tipos celulares específicos para la detección de fármacos y aplicaciones de medicina regenerativa ha estado impulsando el desarrollo de sistemas de cultivo escalables. En los últimos años, varios grupos han reportado la generación escalable de progenitores neuronales y neuronas funcionales32,33,34, proporcionando avances significat...

La aparición de células madre pluripotentes humanas (PSC) representa una excelente herramienta para la medicina regenerativa y el modelado de enfermedades, ya que estas células se pueden diferenciar en la mayoría de los linajes celulares del cuerpo humano1,,2. Desde su descubrimiento, la diferenciación de PSC utilizando diversos enfoques se ha informado para modelar diferentes enfermedades, incluyendo trastornos neurodegenerativos3,,4,5,6.
Recientemente, ha habido informes de culturas 3D derivadas de PSC que se asemejan a estructuras cerebrales humanas; estos se llaman organoides cerebrales3,7,8. La generación de estas estructuras a partir de PSC saludables y específicos para el paciente proporciona una valiosa oportunidad para modelar el desarrollo humano y los trastornos del neurodesarrollo. Sin embargo, los métodos utilizados para generar estas estructuras cerebrales bien organizadas son difíciles de aplicar para su producción a gran escala. Para producir estructuras lo suficientemente grandes como para recapitular la morfogénesis tisular sin necrosis dentro de los organoides, los protocolos se basan en el compromiso neuronal inicial en condiciones estáticas, seguido de encapsulación en hidrogeles y cultivo posterior en sistemas dinámicos3. Sin embargo, estos enfoques pueden limitar la posible ampliación de la producción de organoides. A pesar de que se han hecho esfuerzos para dirigir la diferenciación de PSC a regiones específicas del sistema nervioso central, incluyendo las neuronas cortical, estriado, de cerebro medio y de la médula espinal9,,10,11,12, la generación de regiones cerebrales específicas en condiciones dinámicas sigue siendo un desafío. En particular, la generación de neuronas cerebelosas maduras en estructuras 3D aún no se ha descrito. Muguruma et al. fueron pioneros en la generación de condiciones de cultivo que recapitulan el desarrollo cerebelo temprano13 y recientemente informaron de un protocolo que permite que las células madre embrionarias humanas generen una estructura polarizada que recuerda al primer trimestre cerebelo7. Sin embargo, la maduración de las neuronas cerebelosas en los estudios notificados requiere la disociación de los organoides, la clasificación de los progenitores cerebelosos, y la cocultura con células alimentadoras en un sistema de cultivo monocapa7,14,15,16. Por lo tanto, la generación reproducible de los organoides cerebelosos deseados para el modelado de enfermedades en condiciones definidas sigue siendo un desafío asociado con el cultivo y la variabilidad de la fuente del alimentador.
Este protocolo presenta condiciones óptimas de cultivo para la expansión 3D y la diferenciación eficiente de las PSC humanas en neuronas cerebelosas utilizando biorreactores de rueda vertical de un solo uso (ver Tabla de Materiales para especificaciones), en adelante llamados biorreactores. Los biorreactores están equipados con un gran impulsor vertical, que en combinación con un fondo en forma de U, proporcionan una distribución de cizallamiento más homogénea dentro del recipiente, permitiendo una mezcla suave y uniforme y la suspensión de partículas con velocidades de agitación reducidas17. Con este sistema, se pueden obtener agregados celulares controlados por forma y tamaño, lo que es importante para una diferenciación más homogénea y eficiente. Además, un mayor número de organoides derivados de iPSC se pueden generar de una manera menos laboriosa.
La característica principal de los organoides, que son estructuras multicelulares 3D generalmente formadas a partir de células madre, es la auto-organización de diferentes tipos celulares que forma formas específicas como las observadas en la morfogénesis humana18,,19,,20. Por lo tanto, la morfología organoide es un criterio importante a evaluar durante el proceso de diferenciación. La criosectación de organoides y la inmunostaining de rodajas organoides con un conjunto específico de anticuerpos permiten la visualización espacial de marcadores moleculares para analizar la proliferación celular, la diferenciación, la identidad de la población celular y la apoptosis. Con este protocolo, mediante la inmunodetermación de criocciones organoides, un compromiso neuronal eficiente inicial se observa por el día7 de diferenciación. Durante la diferenciación, se observan varias poblaciones celulares con identidad cerebelosa. Después de 35 días en este sistema dinámico, el neuroepithelium cerebeloso se organiza a lo largo de un eje apicobasal, con una capa apical de progenitores proliferantes y neuronas postmitoticas ubicadas basalmente. Durante el proceso de maduración, de los días 35-90 de diferenciación, se pueden observar distintos tipos de neuronas cerebelosas, incluyendo células de Purkinje (Calbindin+), células de gránulos (PAX6+/MAP2+), células Golgi (Neurogranin+), células de cepillo unipolar (TBR2+), y neuroleins de proyección de núcleos cerebelosos profundos (TBR1+). Además, se observa una cantidad no insignificante de muerte celular en los organoides cerebelosos generados después de 90 días en el cultivo.
En este sistema, los organoides humanos derivados de iPSC maduran en diferentes neuronas cerebelosas y sobreviven hasta 3 meses sin necesidad de disociación y cocultura alimentadora, proporcionando una fuente de neuronas cerebelosas humanas para el modelado de enfermedades.

<table><tbody><tr><td>Papel de 3 mm</td><td>WHA3030861</td><td>Merck</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>A6964 - 500 ml</td> Medio <td>de desprendimiento de células</td><td>Sigma</td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-BARHL1</td> Anticuerpos <td>HPA004809</td><td>Atlas Anticuerpo</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Calbindina D-28k</td><td>CB28</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-MAP2</td><td>M4403</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-N-Cadherina</td><td>610921</td><td>BD Transducción Anticuerpo</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NESTIN</td><td>MAB1259-SP</td><td>R& D</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-OLIG2</td><td>MABN50</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-PAX6</td><td>PRB-278P</td><td>Covance</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-SOX2</td><td>MAB2018</td><td>R& D</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-TBR1</td><td>AB2261</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-TBR2</td><td>ab183991</td><td>Anticuerpo Abcam</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TUJ1</td><td>801213</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrina</td><td>T1147</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>BrainPhys Medio neuronal N2-A & Kit SM1</td><td>5793 - 500mL</td><td>Tecnologías</td><td></td>de células madre</tr><tr><td>Concentrado de lípidos químicamente definidos</td><td>11905031</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos 24x60mm</td><td>631-1575</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Cristalización-purificada BSA</td><td>5470</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>10236276001</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Dibutiril cAMP</td><td>SC- 201567B -500mg</td><td>Frilabo</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>32500-035</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>A3840001</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de piel bovina</td><td>G9391</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Tarro de copas de vidrio</td><td>E94</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I</td><td>10566-016</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>MB014001</td><td>Jamón NZYtech</td><td></td></tr><tr><td>' s F12</td><td>21765029</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Línea iPSC episomal humana</td><td>A18945</td><td>ThermoFisher</td><td>iPSC6.2</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>12440046</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>91077C</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>iPS DF6-9-9T. B</td><td></td><td>WiCell</td><td></td></tr><tr><td>Iso-pentano</td><td>PHR1661-2ML</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>L-Ácido ascórbico</td><td>A-92902</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>354230</td><td>Matriz de membrana basal</td><td>de Corning</td></tr><tr><td>Monotioglicerol</td><td>M6154</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>475904</td><td>Millipore</td><td>medio de montaje</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>85850 -500ml</td> Complemento N2 de <td>Stem cell technologies</td><td></td></tr><tr><td>17502048</td><td></td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>12348017</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>158127</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>PBS-0.1 Recipiente de un solo uso</td><td>SKU: IA-0.1-D-001</td><td>PBS Biotech</td><td></td></tr><tr><td>PBS-MINI Unidad base MagDrive</td><td>SKU: IA-UNI-B-501</td><td>PBS Biotech</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante humano BDNF</td><td>450-02</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante humano bFGF/FGF2</td><td>100-18B</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante humano FGF19</td><td>100-32</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante humano GDNF</td><td>450-10</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante humano SDF1</td><td>300-28A</td><td>Peprotech</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibidor Y-27632</td><td>72302</td><td>Tecnologías</td><td></td>de células madre</tr><tr><td>SB431542</td><td>S4317</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>S7903</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Portaobjetos de microscopio</td><td>12372098</td><td>ThermoFisher</td><td>portaobjetos de microscopio de adhesión</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>25608-930</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL 1M</td><td>T3038-1L</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>9002-93-1</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>P1379</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>15575020</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr></tbody></table>

generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunosuización

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

El cerebelo desempeña un papel crítico en el mantenimiento del equilibrio y la coordinación motora, y un defecto funcional en diferentes neuronas cerebelosas puede desencadenar disfunción cerebelosa. La mayor parte del conocimiento actual sobre los fenotipos neuronales relacionados con la enfermedad se basa en los tejidos postmortem, lo que dificulta la comprensión de la progresión y el desarrollo de la enfermedad. Modelos animales y líneas celulares inmortalizadas también se han utilizado como modelos para trastornos neurodegenerativos. Sin embargo, no recapitulan completamente la enfermedad humana. Las células madre pluripotentes inducidas por el ser humano (iPSC) tienen un gran potencial para el modelado de enfermedades y proporcionan una valiosa fuente para enfoques regenerativos. En los últimos años, la generación de organoides cerebrales a partir de iPSC derivados del paciente mejoró las perspectivas de modelado de enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, faltan protocolos que producen un gran número de organoides y un alto rendimiento de neuronas maduras en sistemas de cultivo 3D. El protocolo presentado es un nuevo enfoque para la generación reproducible y escalable de organoides humanos derivados de iPSC en condiciones definidas químicamente utilizando biorreactores escalables de un solo uso, en los que los organoides adquieren identidad cerebelosa. Los organoides generados se caracterizan por la expresión de marcadores específicos tanto a nivel de ARNm como de proteínas. El análisis de grupos específicos de proteínas permite la detección de diferentes poblaciones de células cerebelosas, cuya localización es importante para la evaluación de la estructura organoide. La criocisión organoidea y la inmunostaining de las rodajas organoides se utilizan para evaluar la presencia de poblaciones específicas de células cerebelosas y su organización espacial.

El protocolo se inició promoviendo la agregación celular utilizando los biorreactores 0.1 L (Figura 1A). Se realizó la inoculación de una sola célula de los iPSC, con 250.000 células/ml sembradas en 60 ml de medio con una velocidad de agitación de 27 rpm. Esto se definió como el día 0. Después de 24 h, las células formaron eficientemente agregados en forma de esferoides (día 1, Figura 1B),y la morfología se mantuvo bien hasta el día 5, con un aumento gradual de ...

Este protocolo describe un sistema de cultivo dinámico para producir agregados de tamaño controlado de células madre pluripotentes humanas y estimular aún más la diferenciación en organoides cerebelosos en condiciones definidas químicamente y libres de alimentadores utilizando un biorreactor de un solo uso.

Generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunosuización

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Presentamos por primera vez, un nuevo enfoque para la generación reproducible y escalable, de células IPS derivadas en organoides cerebelosos, y una condición química definida, utilizando biorreactores de un solo uso. Para obtener células para la siembra del biorres reactor, agregue un mililitro de medio de desprendimiento celular, a cada pozo de una placa de seis pozos de iPSC humano. Incubar la placa a 37 grados Celsius durante siete minutos, hasta que el suave temblor separe fácilmente las células del pozo.Usando una micropipeta P 1000, pipetee el medio de desprendimiento de celdas, hacia arriba y hacia abajo, hasta que las células se disociquen en células individuales. A continuación añadir dos mililitros, de medio de cultivo celular completo a cada pozo, esto inactivará la digestión enzimática. A continuación, utilice la pipeta para transferir suavemente las células a un tubo cónico estéril.Centrifugar el tubo a 210 veces la gravedad durante tres minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en un medio de cultivo. Cuente las células usando un hemocicómetro y tripa de colorante azul.Vea el recipiente del biorreactor con el iPSC, a una densidad de 250.000 células por mililitro. Inserte el recipiente del biorreactor, en la Unidad Base Universal, en una incubadora a 37 grados Celsius, 95% de humedad y 5% dióxido de carbono. Para promover la agregación iPSC, establezca la tasa de agitación de la unidad de control base en 27 RPM.En el primer día, siendo el día cero de la siembra del biorreactor, coloque el biorreactor y la unidad base en una campana de flujo estéril, luego use una pipeta serológica, para recoger una muestra de un mililitro, de la suspensión celular. Placa la suspensión celular en un accesorio ultra bajo, placa de 24 pozos. Utilice un microscopio para confirmar que se han formado agregados derivados de iPSC.Si es así, capturar imágenes de los agregados a 40 X o 100 X.Continúe cultivando los iPSC y el biorreactor, hasta que el diámetro medio de los agregados, es de 100 micrómetros, luego reemplace el 80% del medio, con MT01 fresco sin inhibidor de roca. Cuando los agregados, alcancen 200 a 250 micrometros de diámetro, dejen que todos los organoides se asienten, en la parte inferior del biorreactor, luego reemplacen todo el medio gastado, con el medio de diferenciación de gfCDM. Coloque la unidad base y el biorreactor en la incubadora y disminuya la agitación a 25 RPM.Después de retirar el sobrenadante de los organoides almacenados, agregue un mililitro de 15% de sacarosa al pellet, y mezcle bien girando suavemente. Después de incubar los organoides durante la noche, a cuatro grados Centígrados, retire la solución de sacarosa, luego agregue un mililitro de 15%sacarosa, 7.5% gelatina, y mezcle rápidamente arremolinando suavemente. Mientras que los organoides están incubando a 37 grados Celsius llenar un recipiente de plástico a mitad de camino con la solución de 15%sacarosa 7.5%gelatina, y permitir que se solidifique.Después de que los organoides hayan estado incubando durante una hora, utilice una pipeta Pasteur, para colocar una gota de la mezcla de gelatina de sacarosa organoides, encima de la sacarosa solidificada y gelatina. Después de esperar 15 minutos para que la gota se solidifique, llene el resto del recipiente de plástico, con más 15%sacarosa, 7.5% gelatina, permita que se solidifique completamente a temperatura ambiente y luego incubarlo durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Cortar la gelatina en un cubo, con los organoides en el centro, fijar el cubo a un pedazo de cartón, con una gota de compuesto OCT, luego colocado 250 mililitros de Isopentane, en una taza de 500 mililitros, llenar un recipiente apropiado, con nitrógeno líquido.Usando fórceps y guantes gruesos, coloque cuidadosamente la copa de Isopentane, en la superficie del nitrógeno líquido. El isopentano y los nitrógenos líquidos, son reactivos peligrosos. El uso de estos dos reactivos, requieren equipo de protección personal, incluyendo guantes gruesos y una ventilación adecuada.Cuando el Isopentane, se haya enfriado a 80 grados Celsius negativos, coloque el cubo de gelatina en el Isopentane hasta que se congele. Un cubo bien congelado, produce un sonido metálico cuando se toca ligeramente con fórceps, lo que indica que está listo para ser almacenado. Lave los portaobjetos del microscopio que contienen las secciones organoides, con 50 mililitros 1X PBS durante cinco minutos, luego transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin, que contiene 1X PBS fresco.Transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin, que contenga 50 mililitros de glicina recién preparada e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin, que contenga 50 mililitros de 0,1% Tritón, y permeabilizado durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos dos veces con 1X PBS, durante cinco minutos cada vez. Preparar el plato de inmunosuchado, con papel de tres milímetros, empapado en 1X PBS.Seque los portaobjetos con un pañuelo alrededor de las rodajas y colóquelos en el papel de tres milímetros. Con una pipeta Pasteur, cubra cada diapositiva con 0,5 mililitros de solución de bloqueo. Después de incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, retire el exceso de solución de bloqueo y conduzca los portaobjetos con un pañuelo, alrededor de las rodajas.Coloque 50 microlitros de anticuerpo primario diluido, en cada diapositiva y cúbralos con resbalones de cubierta. Encaje los portaobjetos, en el plato de inmunostaining previamente preparado, e incubarlos a cuatro grados centígrados. Después de la incubación durante la noche, transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin, con 50 mililitros de TBST, dejando que la cubierta se caiga, luego lave los portaobjetos tres veces con TBST, durante cinco minutos cada vez.Coloque 50 microlitros, de anticuerpo secundario diluido en cada diapositiva, y cubra con los resbalones de la cubierta. Coloque los portaobjetos, en el plato de inmunosuchado previamente preparado, incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz. Transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin de nuevo y lávelos tres veces con 50 mililitros de TBST, durante cinco minutos cada vez.Usando una pipeta Pasteur, a 0,5 mililitros de solución de ondas, sobre toda la superficie de cada tobogán e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de 24 horas en el biorreactor, los agregados en forma de esferoides de iPSC formaron eficientemente. La morfología estuvo bien mantenida hasta el día cinco, con un aumento gradual de tamaño.Demostrando un alto grado de homogeneidad. Un análisis cuantitativo por microscopía, también reveló una distribución normal, de tamaños agregados por el primer día, y ambas líneas celulares alcanzaron el tamaño agregado óptimo en el segundo día. Después de alcanzar el diámetro agregado deseado, se indujo el compromiso neural, y luego se promovió la generación de diferentes progenitores cerebelosos.Durante la diferenciación de organoides, mostró una epitelización más pronunciada similar a las estructuras similares a los tubos neurales con espacio luminal. Además, la distribución del diámetro organoide, fue homogénea durante el compromiso cerebeloso inicial hasta el día 14. El análisis de inmunofluorescencia apoya que ya se haya logrado un compromiso neuronal eficiente, de los organoides derivados del iPSC, para el séptimo día de diferenciación.La inmunostaining también demostró un compromiso cerebeloso eficiente y una maduración eficiente de los organoides cerebelosos. Además, después de 80 días en el biorreactor, la tinción muerta viva de organoides mostró una alta viabilidad celular, y ninguna evidencia de áreas necróticas. Esta técnica representa una herramienta importante, para el estudio de las vías patológicas, implicada en la degeneración del cerebelo observada en y para evaluar el efecto terapéutico de nuevos fármacos.

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Generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunosuización (Video) | JoVE Journal

Generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunosuización

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