Un ensayo de electroquimioluminiscencia 7-plex de alto rendimiento que detecta simultáneamente la diabetes tipo 1 y múltiples enfermedades autoinmunes
29 de mayo de 2020
Modelamos un ensayo ECL multiplexado simple que combina 7 ensayos de autoanticuerpos. El ensayo es capaz de detectar DT1 y muchas otras enfermedades autoinmunes, simultáneamente, incluida la enfermedad celíaca, la enfermedad tiroidea autoinmune y el síndrome poliglandular autoinmune 1.
El ensayo de electroquimioluminiscencia puede detectar simultáneamente la diabetes tipo 1 y otras enfermedades autoinmunes relevantes, como la crioenfermedad autoinmune, la enfermedad celíaca y el síndrome poliglandular autoinmune-1. El ensayo ECR, mucho más complejo, combina hasta 10 ensayos múltiples de anticuerpos en un solo pocillo, lo que da como resultado un alto rendimiento, menos bibliotecas y un ensayo menos costoso que requiere un volumen menos amplio. La demostración del procedimiento será Xiaofan Jia, una publicación de mi laboratorio.
Para preparar una solución de antígeno acoplado a un enlazador mixto, primero seleccione la concentración óptima para cada antígeno, según el ensayo de tablero de ajedrez, y diluya el antígeno marcado con biotina y rutenio hasta la concentración de trabajo racional. Para unir diferentes enlazadores a cada uno de los antígenos biotinilados de forma única, en un ensayo de 96 pocillos, se mezclaron 240 microlitros de un enlazador conjugado con STREPTAVIDIN apropiado con 4 microlitros de las proteínas biotiniladas de interés. A continuación, añade 156 microlitros de 1%BSA por tubo e incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Al final de la incubación, agregue 160 microlitros de solución de parada a cada tubo e incube los tubos a temperatura ambiente durante 30 minutos adicionales. Al final de la incubación, extraiga 400 microlitros de antígeno acoplado al enlazador de cada tubo y extraiga las siete suspensiones de antígeno en un solo tubo. A continuación, añada 1,2 mililitros de solución de parada y 4 microlitros de GAD65, TPO, tTg, ThG, interferón-alfa de proinsulina y antígeno IA-2 marcados con Ru sulfo NHS a la mezcla.
Antes de incubar muestras de suero con la mezcla de antígenos marcada, agregue 15 microlitros de suero por pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos y mezcle 18 microlitros de ácido ácido 0,5 molar con cada pocillo de suero para una incubación de 45 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, agregue 35 microlitros de antígeno y 13 microlitros de un tampón Tris molar por pocillo de una nueva placa de PCR de 96 pocillos. Al final de la incubación, transfiera inmediatamente 25 microlitros del suero tratado con ácido a cada pocillo de la placa de antígenos.
Cubra la placa con lámina de techo PCR y coloque la placa en un agitador a baja velocidad a temperatura ambiente durante una hora. Al final de la incubación, coloque la placa a 4 grados centígrados durante 18 a 24 horas. Saque el plato del refrigerador y deje que alcance la temperatura ambiente.
A continuación, añada 150 microlitros de tampón A bloqueador al 3% a cada pocillo. Cuando se hayan tratado todos los pocillos, cubra la placa con papel de aluminio para el techo y coloque la placa en un refrigerador a 4 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, voltee la placa al revés y lave las muestras tres veces con 150 microlitros de PBS-T por pocillo, por lavado.
Golpee la placa hasta que no quede ningún tampón en ninguno de los pozos. Agregue 30 microlitros de antígeno sérico incubado a cada pocillo. Cuando se hayan agregado todas las incubaciones, cubra la placa con papel de aluminio y coloque la placa en un agitador a baja velocidad durante una hora, a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, retire las incubadoras agitando y lave los pocillos tres veces con 150 microlitros de PBS-T por pocillo, como se ha demostrado. Después del último lavado, agregue 150 microlitros de tampón de lectura a cada pocillo y lea la placa en un lector de placas, en cuentas por segundo. En este análisis de una gran cohorte de muestras de 1026 pacientes con diabetes tipo 1 recién diagnosticados, se compararon los niveles de autoanticuerpos de un ensayo de electroluminiscencia de más de siete con los niveles de cada ensayo de electroluminiscencia único establecido y de cada ensayo de unión a radio estándar y ELISA correspondientes.
Las especificidades del ensayo fueron idénticas en los percentiles 99 para todos los ensayos de autoanticuerpos, excepto para los autoanticuerpos tiroideos, para los que se utilizó el percentil 95. Se encontró un pequeño número de muestras discordantes para cada uno de los siete autoanticuerpos alrededor del límite de los puntos de corte para cada ensayo. Aquí se pueden observar los datos correspondientes a 1022 controles sanos para cada ensayo.
Lo más importante que hay que recordar es encontrar un enlazador diferente para cada uno de los antígenos biotinilados de forma única, y mezclar cada antígeno con las propiedades para proporcionar el enlazador conjugado. Esta técnica de ensayo permitirá a los investigadores planificar el cribado de múltiples enfermedades autoinmunes simultáneamente en poblaciones a gran escala y permitirá a las clínicas cribar fácilmente múltiples enfermedades relevantes con diabetes tipo 1.
Descripción general
Este estudio presenta un ensayo multiplexado de electroquimioluminiscencia (ECL) que permite la detección simultánea de diabetes tipo 1 y diversas enfermedades autoinmunes. El ensayo combina múltiples pruebas de autoanticuerpos en un solo pocillo, mejorando la eficiencia y reduciendo los costos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Autoinmunidad
- Diagnóstico
- Ensayos de electroquimioluminiscencia
Antecedentes
- La diabetes tipo 1 (T1D) a menudo se asocia con otras enfermedades autoinmunes.
- Los ensayos tradicionales pueden requerir múltiples pruebas, lo que aumenta el tiempo y los costos.
- Los ensayos multiplex pueden agilizar el proceso diagnóstico.
- La electroquimioluminiscencia proporciona alta sensibilidad y especificidad.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un ensayo ECL multiplexado para la detección de la diabetes tipo 1 y enfermedades autoinmunitarias relacionadas.
- Comparar el rendimiento del ensayo multiplexado con ensayos individuales establecidos.
- Facilitar el cribado a gran escala en entornos clínicos.
Métodos Utilizados
- Preparación de soluciones de antígenos acoplados con mezcla de enlazadores.
- Incubación de muestras de suero con antígenos marcados.
- Uso de un formato de placa de 96 pocillos para cribado de alto rendimiento.
- Comparación de los niveles de autoanticuerpos en pacientes con diabetes tipo 1 y controles sanos.
Resultados principales
- El ensayo multiplexado demostró una especificidad comparable a la de los ensayos individuales.
- Identificó un pequeño número de muestras discordantes cercanas a los umbrales de corte.
- Proporcionó datos para una cohorte amplia de pacientes recién diagnosticados con diabetes tipo 1.
- Permitió un cribado eficiente de múltiples enfermedades autoinmunes.
Conclusiones
- El ensayo ECL multiplexado es una herramienta viable para cribado simultáneo.
- Este método puede mejorar la eficiencia diagnóstica en la práctica clínica.
- Se recomienda una mayor validación en poblaciones más grandes.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La detección simultánea de múltiples autoanticuerpos en un solo pocillo aborda un cuello de botella crítico en el cribado a gran escala de enfermedades autoinmunitarias, reduciendo la complejidad del ensayo y el consumo de recursos. Este enfoque electroquimioluminiscente multiplexado mejora la confianza predictiva en la identificación temprana de enfermedades al proporcionar lecturas correlacionadas de biomarcadores en diabetes tipo 1 y condiciones autoinmunitarias comórbidas. El ensayo permite la triage de carteras y la desactivación de riesgos mecanicistas en el desarrollo de inmunoterapias, facilitando la estratificación eficiente de pacientes según perfiles de múltiples autoanticuerpos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la correlación de grupos de autoanticuerpos con endotipos de enfermedad en modelos preclínicos.
- Valor operativo: Facilita la reducción de riesgos biológicos mediante la validación funcional de respuestas inmunitarias específicas del antígeno en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Valor predictivo: Mejora la confianza en la selección de dianas al identificar subgrupos de pacientes con firmas convergentes de autoanticuerpos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara paneles estandarizados y cuantitativos de biomarcadores para campañas de cribado posteriores que requieren alta reproducibilidad.
- Valor operativo: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante complejos inmovilizados de antígeno-enlazador que aseguran una unión constante en fase líquida a lo largo de las pocillos.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma para cribado de hasta 10 autoanticuerpos por pocillo, aumentando el rendimiento sin necesidad de reformateo.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad traslacional: Se alinea con sistemas relevantes para la enfermedad al detectar autoanticuerpos vinculados a la progresión clínica en la diabetes tipo 1 y trastornos autoinmunes comórbidos.
- Avance ajustado al riesgo: Apoya las decisiones de continuar o no continuar al identificar pacientes con perfiles de autoanticuerpos de alta penetrancia que predicen autoinmunidad multiorgánica.
- Reducción del riesgo mecanicista: Reduce la ambigüedad en la interpretación de los mecanismos inmunitarios mediante la medición simultánea de autoanticuerpos frente a las vías de las células de los islotes, tiroides, intestino e interferón.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo funciona como un puente entre el descubrimiento y la traslación, permitiendo un fenotipado inmune temprano que orienta las etapas de identificación de compuestos prometedores y validación preclínica mediante perfiles multiplexados de autoanticuerpos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la vinculación de patrones de coexpresión de autoanticuerpos a vías patogénicas en la patogénesis autoinmune.
- Detección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles que permiten comparar las respuestas inmunitarias entre diferentes condiciones de tratamiento o fondos genéticos.
- Análisis: Ofrece lecturas normalizadas de cuentas por segundo que permiten la comparación estadística de los niveles de autoanticuerpos entre cohortes de pacientes y controles.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la validación de paneles de biomarcadores en muestras humanas que reflejan la disregulación inmunitaria asociada a la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de inmunoensayo reutilizable, adaptable a otros paneles de enfermedades autoinmunes o inflamatorias más allá de la configuración inicial de 7 analitos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir los falsos negativos mediante la medición concurrente de autoanticuerpos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y reproducibilidad al eliminar la variabilidad entre pocillos mediante la presentación de antígenos inmovilizados.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al consolidar siete pruebas diagnósticas en un único paso del flujo de trabajo.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos terapéuticos basada en poblaciones de pacientes definidas por biomarcadores.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el diseño de inmunoensayos y en química de enlazadores para la inmovilización de antígenos.
- Depende de un lector de placas capaz de detección mediante electroquimioluminiscencia en formato de 96 pocillos.
- Necesita la estandarización de protocolos de bloqueo y lavado entre diferentes centros para estudios multicéntricos.
- Requiere adaptación de las concentraciones de antígenos al extenderse a nuevos objetivos de autoanticuerpos más allá de los siete originales.
- Limitado por la necesidad de pares enlazador-antígeno optimizados para prevenir la reactividad cruzada en formato multiplex.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:50
Mixed Linker-Coupled Antigen Solution
2:26
Serum Sample Incubation with Labeled Antigen
3:30
Multiplex Plate Preparation
3:57
Serum/Antigen Incubate Transfer
4:58
Results: Representative Autoantibody Level Evaluation
6:03
Conclusion
