Infección De Larvas De Pez Cebra Con Esporas De Aspergillus Para El Análisis De Las Interacciones Huésped-Patógeno

Este protocolo demuestra un modelo de infección por larvas de pez cebra aspergillus, que podemos utilizar para investigar las respuestas inmunitarias innatas a este hongo. La principal ventaja del modelo de larvas de pez cebra es que podemos visualizar las interacciones entre las células inmunitarias y los patógenos y la progresión de la infección dentro de un animal huésped vivo a lo largo de una infección de varios días. Los hallazgos de este modelo pueden ser aplicables al descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas para tratar la aspergilosis invasiva en pacientes inmunocomprometidos.

La microinyección de esporas en larvas de pez cebra es una técnica difícil que requiere una práctica considerable antes de que se puedan lograr resultados consistentes y reproducibles. Para realizar microinyecciones, utilice la configuración suministrada con un inyector de presión, una unidad de presión de aspiración, un interruptor de pie, un soporte de micropipeta, un micromanipulador y un soporte y una placa magnéticos. Todo conectado a una fuente de aire comprimido.

Abra la válvula de aire comprimido. Y enciende el microinyector. Ajuste la presión a aproximadamente 25 psi, el refuerzo a 60 milisegundos y la unidad de presión de vacío a 1 psi.

Utilice una punta de pipeta de microcargador para cargar la aguja de microinyección con tres a cinco microlitros de PBS o suspensión de esporas con rojo de fenol. A continuación, monte la aguja en el micromanipulador. El Aspergillus fumigatus es un patógeno oportunista de los humanos.

Existe el riesgo de punción cutánea con la aguja cargada. La aguja debe estar muy bien sujeta al microinyector, y los investigadores siempre deben usar guantes y prestar mucha atención a los movimientos de sus manos alrededor de la aguja para evitar perforaciones. Coloque el micromanipulador de modo que el extremo de la aguja sea visible bajo el microscopio estereoscópico con el aumento más bajo.

Acérquese a un aumento de 4x, manteniendo la aguja a la vista. Luego, use pinzas afiladas para cortar el extremo de la aguja. Presione el pedal de inyección para visualizar el tamaño de la gota.

Y sigue recortando la aguja hasta que salgan unos tres nanolitros de suspensión de esporas. Cuando esté listo, mueva el micromanipulador y la aguja fuera del camino para evitar golpear accidentalmente la aguja mientras coloca las larvas en la placa de inyección. Vierta la tricaína E3 de la placa de inyección.

Y transfiera alrededor de 24 larvas anestesiadas de dos días de edad a la placa con la menor cantidad de E3 posible. Luego, organice las larvas de acuerdo con la dirección en la que miran, colocando todas las larvas mirando hacia la derecha en una fila y todas mirando hacia la izquierda en una fila debajo. Con el microscopio ajustado al aumento más bajo, lleve el micromanipulador hacia atrás, de modo que la aguja quede cerca de las larvas en un ángulo de 30 a 60 grados.

Acérquese al aumento más alto. Y use perillas de ajuste fino para ajustar aún más la posición de la aguja. Inyecte la suspensión de esporas en el líquido junto a las larvas para verificar que salgan de la aguja entre 30 y 70 esporas.

A continuación, mueva la placa de modo que la aguja quede directamente encima y cerca de las primeras larvas. Empezando por las larvas que están mirando hacia la aguja. Inserte la aguja a través del tejido alrededor de la vesícula ótica y perfore a través del ventrículo del cerebro posterior, moviendo la placa según sea necesario para obtener la orientación correcta de la larva.

Verifica visualmente que el extremo de la aguja esté en el centro del ventrículo posterior del cerebro. A continuación, presione el pedal para inyectar las esporas y retraiga suavemente la aguja. Después de inyectar todas las larvas en ambas filas, vuelva a mover la aguja para apartarlas.

Y acérquese a un aumento más bajo. El tinte rojo fenol aún debe ser visible en el cerebro posterior de cada larva. Deseche las larvas con inyecciones infructuosas y transfiera las larvas restantes a una placa de Petri lavándolas de la placa con E3 fresco. Enjuague la larva dos veces con E3 y asegúrese de que se recupere de la anestesia.

Inmediatamente después de la inyección, transfiera ocho de las larvas a tubos individuales de 1,7 mililitros y eutanasiarlas. Prepare 1 mL de PBS con ampicilina y kanamicina. Retire la mayor cantidad de líquido posible de los tubos con las larvas.

Luego agregue 90 microlitros del PBS con antibióticos. Homogeneizar las larvas en un TissueLyser a 1800 oscilaciones por minuto, durante seis minutos. Luego, gíralos hacia abajo a 17.000 veces G durante 30 segundos.

Pipetear la suspensión homogeneizada desde cada tubo hasta el centro de una placa GMM etiquetada y extenderla con un esparcidor desechable en forma de L. Teniendo cuidado de evitar esparcirse contra el borde. Incuba las placas boca abajo a 37 grados centígrados durante dos o tres días.

Luego, cuenta el número de colonias formadas. Divida las larvas inyectadas restantes en dos platos de 3,5 milímetros. Uno para el tratamiento de drogas y otro para el control.

Retire la mayor cantidad de líquido posible y agregue E3 con el control del vehículo a un plato. Y E3 con el tratamiento de interés para el otro. Use una pipeta para transferir cada larva a un pocillo en una placa de 96 pocillos.

Y vigilar su supervivencia durante siete días. El día de la toma de imágenes, prepare una placa de Petri de 3,5 milímetros con PTU de 100 micromolares y otra con tricaína E3. Agregue tricaína E3 en las cámaras de un dispositivo E de cuña Z y use una micropipeta P100 para eliminar las burbujas de aire de las cámaras y el canal de restricción.

A continuación, retire todo el exceso de tricaña E3 fuera de las cámaras. Pipetea una larva y transfiérela a la placa con la PTU E3. Luego transfiéralo a la tricaína E3, con la menor cantidad de líquido posible.

Después de 30 segundos, transfiera las larvas anestesiadas a la cámara de carga del dispositivo de herida y atrapamiento. Retire la tricaña E3 de la cámara de herida y suéltela en la cámara de carga para mover la cola de las larvas hacia el canal de restricción. Asegúrese de que la larva esté colocada en su lado lateral, dorsal o dorsolateral para que se pueda obtener una imagen del cerebro posterior con una lente de objetivo invertida.

Después de obtener imágenes de la larva con un microscopio confocal, libere la tricaína E3 en la cámara de herida para empujar la larva desde el canal de restricción hasta la cámara de carga. Recoja la larva y transfiérala de nuevo al plato con tricaína E3. Luego transfiéralo al plato con PTU E3 con la menor cantidad de líquido posible.

Enjuáguelo en PTU y transfiéralo nuevamente a la placa de 48 pocillos. Las esporas de Aspergillus se microinyectaron en el cerebro posterior de las larvas de pez cebra, se monitoreó el resultado de la infección. Se observó muy poca muerte en las larvas de tipo salvaje, con un 80 a 100% de las larvas que sobrevivieron a todo el experimento.

Se observó una disminución significativa de la supervivencia en las larvas inmunosuprimidas. Cuando se cuantificaron las unidades formadoras de colonias a partir de larvas silvestres infectadas, se observó persistencia de las esporas y un aclaramiento lento en el tiempo. El número de esporas que sobrevivieron a uno, dos, tres, cinco y siete días después de la infección se normalizó al número de esporas inyectadas, con el fin de comparar la persistencia y el aclaramiento entre las réplicas.

Cuando se marcaron los macrófagos, se observó típicamente la agrupación de micrófagos en aproximadamente el 50% de las larvas a partir de los dos o tres días posteriores a la infección. El reclutamiento de neutrófilos se retrasó, ocurriendo principalmente después de la germinación de un hongo. Mientras que la carga fúngica persistió durante todo el experimento en la mayoría de las larvas.

Se observó aclaramiento en algunos a los cinco días después de la infección. En otro subconjunto de larvas, se observó diseminación fúngica a áreas fuera del cerebro posterior. El área alrededor de la vesícula ótica es uno de los lugares donde se encontró esta diseminación.

La germinación de los hongos se observó típicamente a los cinco días en el 60% de las larvas. El área del grupo de fagocitos, el reclutamiento de macrófagos y el reclutamiento de neutrófilos variaron con el tiempo en todas las larvas. Algunos con tendencia al alza a lo largo del experimento y otros que se resuelven con el tiempo.

Este procedimiento puede combinarse con la manipulación genética del pez cebra, como con CRISPR, para determinar la necesidad de vías específicas del huésped en una respuesta inmunitaria innata exitosa al aspergillus. Este protocolo ha permitido la visualización de las interacciones de las células inmunitarias innatas del aspergillus en tiempo real, en huéspedes vivos e intactos.