Un modelo epitelial bronquial de interfaz aire-líquido para la exposición realista y repetida por inhalación a partículas en el aire para pruebas de toxicidad
13 de mayo de 2020
Descrito es el método de cultivo celular y exposición de un modelo bronquial in vitro para la exposición realista y repetida a partículas para pruebas de toxicidad.
Este protocolo describe cómo cultivar y exponer células epiteliales bronquiales humanas a través del aire. Este es un modelo más realista para estudiar la exposición del pulmón a las partículas inhaladas. Las células pulmonares se preparan con estos métodos, para parecerse al entorno real en el pulmón. Las células producirán moco, formarán una barrera hermética y permanecerán viables durante varias semanas. Este método se puede utilizar para estudiar los efectos tóxicos de las partículas en el aire. También se puede utilizar para estudiar enfermedades infecciosas de las vías respiratorias y fármacos tomados por inhalación. Cuando intente este protocolo por primera vez, tenga en cuenta que generar un ágil requiere el conocimiento de un especialista. También requiere un equipo dedicado a la medición. Comience diluyendo las células en un medio de cultivo celular precalentado o CCM, hasta una concentración de 500.000 células por mililitro para insertos de 6 pocillos. Y 250.000 células por mililitro para insertos de 12 pocillos. Coloque una placa de cultivo celular con insertos en condiciones asépticas y llene el lado lateral basal con CCM precalentado. Después de mezclar la suspensión celular, pipetee la parte superior de la membrana en el inserto de cultivo celular. Cubra la placa e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Cultivar las células en condiciones sumergidas durante siete días, para permitir que alcancen la confluencia, cambiando el MCP cada dos o tres días. Para medir la resistencia eléctrica transepitelial, utilice un voltohmímetro epitelial cargado, complementado con un juego de electrodos de palillo. Limpie los electrodos con etanol al 70%. Coloque el electrodo más largo en el medio de cultivo externo, hasta que toque el fondo de la placa. Y el electrodo más corto en el medio, sin tocar la membrana. Comience a recopilar mediciones en el inserto vacío sin celdas. Espere hasta que la medición se estabilice y anote la resistencia en ohmios. Esta medida es la resistencia de la membrana del inserto sin ninguna celda o resistencia en blanco. Repita la medición para cada plaquita y reste la resistencia de la pieza en bruto para obtener la resistencia real, y multiplíquela por el área de superficie de la plaquita. Retire el medio del lado apical de los insertos y agregue CCM precalentado al lado basolateral del pocillo. El medio debe tocar la membrana desde la parte inferior, pero no debe filtrarse a la parte superior del inserto. Cultive las células en la interfaz aire-líquido de la incubadora, a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante siete días. Cambiar el medio basolateral cada dos o tres días. Poco antes de la exposición a las partículas, prepare una suspensión de nanopartículas al 1%. Humedecer previamente los NP con etanol al 96%. Añada agua pura hasta una concentración final del 1% de NPs. Coloque el vial en un vaso de precipitados sobre hielo. Sonicar la suspensión durante 16 minutos, agregar un revuelto a la botella con la dispersión, luego conectar la botella a una bomba peristáltica a través de un pequeño tubo y ajustar el flujo a 25 mililitros por hora. Un día antes de la exposición, encienda la estación de exposición automática o AES y deje que el gabinete alcance una temperatura de 37
Descripción general
Este estudio se centra en el desarrollo de un modelo bronquial in vitro para simular la exposición repetida por inhalación a partículas en suspensión en el aire, con fines de pruebas de toxicidad. Las células epiteliales bronquiales humanas cultivadas muestran una viabilidad prolongada y una producción realista de moco, lo que hace que el modelo sea adecuado para estudios toxicológicos e investigaciones sobre enfermedades infecciosas.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Toxicología
- Biología respiratoria
- Modelos in vitro
Antecedentes
- La necesidad de modelos realistas de exposición pulmonar
- Importancia del estudio de partículas inhaladas
- Aplicaciones en la investigación de enfermedades infecciosas y en la administración de fármacos
Métodos Utilizados
- Técnicas de cultivo celular para células epiteliales bronquiales humanas
- Condiciones de cultivo en interfase aire-líquido
- Medición de la resistencia eléctrica transepitelial
Resultados principales
- Las células forman una barrera estrecha y producen moco
- La viabilidad se mantiene durante varias semanas bajo condiciones controladas
- El método está validado para su uso en evaluaciones toxicológicas
Conclusiones
- El modelo desarrollado imita eficazmente la exposición pulmonar a partículas inhaladas
- Implicaciones significativas para las pruebas de toxicidad y la investigación respiratoria
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los modelos realistas in vitro del epitelio bronquial son fundamentales para las pruebas predictivas de toxicidad por inhalación y la investigación sobre la administración de fármacos por vía respiratoria. El sistema de interfase aire-líquido (ALI) con células Calu-3 permite estudios de exposición repetida y de baja dosis que imitan estrechamente las condiciones de las vías respiratorias humanas, lo que favorece una mayor confianza en la traslación clínica durante la evaluación temprana de compuestos. Este enfoque responde a la necesidad de modelos fisiológicamente relevantes y reproducibles en las etapas de desarrollo biofarmacéutico respiratorio.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite reducir los riesgos mecanicistas de los efectos de compuestos inhalados sobre el epitelio de las vías respiratorias.
- Apoya la validación funcional del blanco al mantener uniones estrechas y la producción de moco durante períodos prolongados.
- Facilita una evaluación predictiva confiable de la toxicidad respiratoria y los estudios de seguridad.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona un sistema validado y reproducible para la medición cuantitativa de la integridad de la barrera epitelial.
- Permite la estandarización de ensayos para exposiciones repetidas a partículas de baja concentración.
- Posibilita la evaluación confiable de los efectos de compuestos aéreos bajo condiciones de flujo continuo.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos de vías respiratorias relevantes para enfermedades en estudios traslacionales de biomarcadores.
- Asegura la continuidad desde el descubrimiento in vitro hasta los flujos de trabajo preclínicos de toxicología por inhalación.
- Reduce el riesgo de descarte en fases avanzadas mediante la modelización de escenarios de exposición realistas.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Este modelo bronquial ALI se integra en la continuación descubrimiento-a-préclínico para terapéuticas respiratorias y toxicología de inhalación.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la función de barrera de las vías respiratorias y la toxicidad de partículas.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles de la resistencia transepitelial y la viabilidad.
- Análisis: Permite el monitoreo continuo de la concentración de exposición y la dosis administrada.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con estudios preclínicos de inhalación mediante puntos finales relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada adaptable para diversos estudios con partículas en el aire y fármacos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en las pruebas de toxicidad respiratoria.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad de los protocolos de exposición repetida.
- Valor estratégico: Perfecciona las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital en el desarrollo de carteras respiratorias.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de compuestos y formulaciones inhalados.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular en interfaz aire-líquido y medición de barrera epitelial.
- Necesita instrumentación dedicada para exposición de flujo continuo y monitoreo de resistencia.
- Exige estandarización entre equipos para protocolos de exposición y análisis de datos.
- Adaptable a diversos tipos y concentraciones de partículas en el aire dentro de las limitaciones del modelo.
- Depende del mantenimiento de la viabilidad celular y la integridad de las uniones estrechas durante períodos prolongados de cultivo.
