Aislamiento simultáneo y cultura de los miocitos atriales, los miocitos ventriculares y los no miocitos de un corazón de ratón adulto

Hola, soy Chris Glembotski. Soy profesor de medicina en la Facultad de Medicina de la Universidad de Arizona en Phoenix. Y soy el director del Centro Cardiovascular Traslacional, también ubicado aquí en Phoenix.

Me gustaría presentarles hoy a dos personas que van a demostrar nuestra nueva técnica, el Dr. Erik Blackwood, mi becario postdoctoral senior y profesor en formación, y la investigadora asociada senior, la señorita Alina Bilal. Los protocolos actuales de aislamiento de miocitos cardíacos limitan la cantidad y la viabilidad de las células en cultivo, lo que crea un impasse experimental para avanzar en nuestra comprensión de la fisiología y la fisiopatología cardíacas. Este protocolo tiene como objetivo no solo acelerar el proceso de aislamiento de células cardíacas murinas adultas, sino también aumentar el rendimiento celular y la viabilidad de las células cardíacas auriculares y ventriculares simultáneamente de un solo corazón de ratón.

Esta técnica tiene profundas implicaciones para el descubrimiento terapéutico y para que enfermedades como la fibrilación auricular puedan caracterizarse mejor a nivel específico de tipo celular, lo que permite la identificación de dianas terapéuticas. Recomendamos que las personas sin experiencia microquirúrgica previa practiquen ampliamente los pasos de explantación y canulación de aorta ascendente antes de intentar el protocolo de aislamiento completo. Comience usando tijeras para hacer una incisión en la piel de la línea media para abrir rápidamente el pecho de un ratón C57 negro 6J anestesiado de 10 semanas de edad desde la mitad del abdomen hasta la mandíbula.

Entrar en el peritoneo y despejar el diafragma mediante disección roma. Corte la caja torácica con incisiones a lo largo de la pared torácica en la cara lateral de ambos lados y corte las conexiones fibrosas entre el corazón y la pared torácica. Después de la extracción completa de la caja torácica, use pinzas pequeñas y tijeras para levantar suavemente el corazón por el ápice exponiendo la cara posterior del corazón.

Para explantar el corazón, se disecciona inmediatamente la parte inferior de la arteria innominada en la aorta ascendente e inmediatamente se coloca el corazón en un medio de perfusión cardíaco helado. Diseccione rápidamente el tejido restante para exponer la aorta ascendente y use pinzas y tijeras de microdisección para limpiar el área que rodea la aorta del exceso de tejido. Use pinzas de punta fina para colocar la aorta limpia dos milímetros sobre una cánula de perfusión y asegure la cánula con una sutura de seda 5-0.

Enjuague el corazón canulado con medio de perfusión cardíaca a un flujo de tres mililitros por minuto durante cuatro minutos antes de cambiar a tampón de digestión durante 15 a 17,5 minutos. Durante los minutos finales de la perfusión, recoja ocho mililitros del flujo del tampón de digestión y transfiera el corazón de la cánula a una placa de cultivo de plástico de 60 milímetros, luego retire el exceso de tejido y sumerja el corazón en 2,5 mililitros del tampón de digestión. Para el aislamiento de las células auriculares, diseccione las aurículas lejos del corazón y coloque las aurículas en una placa de cultivo de plástico de 30 milímetros que contenga 750 microlitros de tampón de digestión.

Con unas tijeras quirúrgicas de punta fina, triture y separe las aurículas antes de diseccionar el tejido con pinzas finas sin agitar ni separar las fibras musculares. Con una punta de pipeta de transferencia estéril, continúe mezclando y disociando suavemente el tejido durante 15 minutos. Cada cinco minutos, observe la disociación de los miocitos auriculares bajo el objetivo 10X de un microscopio de campo claro.

A medida que el tejido se digiere más, continúe mezclando y disociando suavemente el tejido con una punta de pipeta de transferencia estéril con un tamaño de poro más pequeño antes de transferir la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga estéril de dos mililitros. Enjuague la placa de 30 milímetros con 750 microlitros de tampón de detención de miocitos de 37 grados centígrados uno y combine el tampón con la suspensión celular. Deje que los miocitos auriculares se sedimenten por gravedad y agitación suave durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Cuando se haya formado un gránulo visible, centrifugar la suspensión celular y transferir el sobrenadante que no contiene miocitos a un tubo cónico de polipropileno de 15 mililitros sin alterar el gránulo de miocitos auriculares. Centrifugar la fracción no miocitaria y resuspender el pellet no miocitario en 10 mililitros de DMEM suplementado con suero de ternera fetal al 10%. Después del recuento, coloque las células no miocitarias a la densidad experimental adecuada para el análisis posterior, luego vuelva a suspender la pastilla de miocitos auriculares aislada a la concentración experimental adecuada para la siembra en placas de cultivo recubiertas de laminina.

Para el aislamiento de células ventriculares, se debe picar el tejido cardíaco ventricular como se acaba de demostrar para la muestra de tejido auricular y transferir la suspensión celular resultante a un tubo cónico de polipropileno de 15 mililitros que contiene 2,5 mililitros de tampón de detención de miocitos de 37 grados Celsius. Enjuague la placa de disección con 2,5 mililitros de tampón de detención de miocitos a 37 grados centígrados y combine el lavado con la suspensión celular. Con una pipeta de transferencia estéril, continúe mezclando y disociando suavemente el tejido durante cuatro minutos.

Al final de la incubación, utilice una alícuota de 10 microlitros de las células para comprobar la presencia de miocitos en forma de bastón. Pase la suspensión celular a través de un filtro de nailon estéril de 100 microlitros a un tubo cónico de polipropileno de 50 mililitros y use dos mililitros del tampón de digestión recolectado previamente para lavar las células restantes del filtro de nailon estéril. Deje que los miocitos ventriculares se sedimenten por gravedad durante seis minutos con una agitación suave hasta que se forme una bolita visible en el fondo del tubo.

Con una punta de pipeta estéril, transfiera el sobrenadante que no contiene miocitos a un tubo cónico de polipropileno de 15 mililitros sin alterar la pastilla de miocitos ventriculares y centrifuga la fracción no miocítica. Vuelva a suspender el pellet de no miocitos en 10 mililitros de DMEM suplementado con un 10% de suero fetal de ternero para el recuento y coloque las células en la concentración adecuada para su análisis posterior, luego vuelva a suspender los miocitos ventriculares aislados en dos mililitros de tampón de detención de miocitos dos para el recuento. Para establecer un paradigma escalonado de reintroducción de calcio, agregue 50 microlitros de cloruro de calcio de 10 milimolares a la suspensión de células de miocitos ventriculares con una mezcla completa para una incubación de cuatro minutos a temperatura ambiente.

Al final de la incubación, agregue 50 microlitros adicionales de cloruro de calcio de 10 milimolares a las células con mezcla para otra incubación de cuatro minutos a temperatura ambiente. A continuación, trate las células con una incubación de cuatro minutos con 100 microlitros de cloruro de calcio de 10 milimolares y una incubación de cuatro minutos con 80 microlitros de cloruro de calcio de 10 milimolares. Después de la última incubación, vuelva a suspender los miocitos ventriculares tratados con calcio en un volumen adecuado de medio de siembra de miocitos ventriculares de acuerdo con el análisis posterior planificado y siembre las células en placas de cultivo recubiertas de laminina.

Después de una hora, reemplace el sobrenadante con medio de mantenimiento de miocitos ventriculares suplementado con 25 micromolares de blebbistatina. La troponina T del músculo cardíaco es un marcador de miocitos cardíacos y se expresa de manera robusta en cultivos de miocitos cardíacos tanto auriculares como ventriculares. Por el contrario, el péptido natriurético auricular y la cadena ligera de miosina dos se expresan de forma robusta y específica en cultivos de miocitos cardíacos auriculares y ventriculares, respectivamente.

Los marcadores de fibroblastos se expresan exclusivamente en cultivos no miocíticos aislados de cámaras auriculares y ventriculares. La inmunotinción de miocitos auriculares y ventriculares de ratón adulto para el marcador de túbulo T dihidropiridina y el receptor de rianodina muestra túbulos T intactos durante todo el aislamiento y el cultivo a largo plazo. El patrón de estrías sarcoméricas se puede utilizar para evaluar la pureza y viabilidad de miocitos cardíacos aislados junto con la morfología en forma de bastón y la tinción nuclear con TO-PRO-3.

Como era de esperar, los miocitos cardíacos ventriculares son grandes, con una longitud promedio de aproximadamente 150 micrómetros, mientras que los miocitos cardíacos auriculares tienen un promedio de aproximadamente 75 micrómetros. Además, tras el análisis de inmunotinción, los miocitos cardíacos auriculares exhiben una expresión robusta de péptido natriurético auricular en un patrón de tinción que es característico de la localización en el retículo endoplásmico y los gránulos secretores. Mientras que los miocitos auriculares secretan péptido natriurético auricular en condiciones basales, la secreción aumenta en respuesta a los secretagogos.

Además, los miocitos cardíacos auriculares secretan péptido natriurético auricular y la cosecreción solo procesa una parte de la hormona desde su estado precursor hasta el péptido producto. Los errores evitables más comunes incluyen no mantener la calma del animal antes del sacrificio, no evacuar las burbujas de aire del sistema de perfusión y que el propio cirujano no mantenga la calma. Después de este procedimiento, se puede realizar cualquier procedimiento experimental común, incluido el ensayo de parámetros electrofisiológicos y de manejo de calcio, inmunocitoquímica, respuesta hipertrófica y estudios de señalización, y estudios simulados de isquemia reperfusión.