Activación optogenética de vías aferentes en cortes cerebrales y modulación de respuestas por anestésicos volátiles

Este protocolo se puede utilizar para investigar si los anestésicos volátiles alteran algunas sinopsis más que otras, para determinar si sus efectos son de tipo celular o específicos de la vía, y para determinar qué efectos ocurren a nivel poblacional. La principal ventaja de esta técnica es la especificidad con la que podemos evaluar los efectos de los anestésicos volátiles. Podemos dirigirnos a vías específicas y tipos de células en la actividad poblacional de ensayos simultáneos.

Comience preparando el bloque de tejido para seccionarlo. Levanta suavemente el cerebro de la cavidad del cráneo y colócalo sobre el papel de filtro. Haz un corte a lo largo del plano sagital del cerebro paralelo a la línea media y coloca el bloque de tejido en este plano sagital.

Guíe el papel de filtro sobre la plantilla de bloqueo y alinee el cerebro con el contorno de la plantilla subyacente. Haga un corte paralelo en el plano coronal como lo indican las líneas de la plantilla, agregando una pequeña gota de CSF para cortar para mantener el papel de filtro húmedo si es necesario. Coloque el bloque de tejido en rodajas de cuatro grados centígrados y aplique una pequeña cantidad de pegamento a la etapa de muestra helada.

Levante el bloque de pañuelo de papel del CSF para cortar y absorba el exceso de solución con una esquina de una toalla absorbente. Pegue el plano coronal posterior del bloque de tejido a la etapa del espécimen con la superficie dorsal del cerebro frente a la hoja de zafiro. Recoja cortes de cerebro coronal de 500 micrómetros de grosor y colóquelos en una malla de nailon en corte de 34 grados Celsius aCSF.

Deje que el recipiente alcance la temperatura ambiente. Para preparar bolsas experimentales de aCSF con isoflurano disuelto, agregue 600 mililitros de aCSF experimental y 600 mililitros de mezcla de gas 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono a una bolsa vacía de gas politetrafluoroetileno. Etiquete este control de bolsa.

Agregue 300 mililitros de aCSF experimental a otra bolsa de gas politetrafluoroetileno y etiquete esta bolsa con isoflurano. Proceda a preparar la bolsa de isoflurano de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Configure los protocolos de simulación de luz asignando aleatoriamente formas de onda a cada perfil.

Cada perfil con su forma de onda asignada corresponde a un pulso de disparo de una entrada TTL digital o una prueba. Cuando haya terminado, guarde la secuencia de perfiles. Para colocar la sonda multicanal en el portaobjetos de tejido cerebral ex vivo, perfunde aCSF experimental burbujeado a tres a seis mililitros por minuto y transfiere el corte de cerebro que contiene el área de interés a la rejilla de malla en la cámara de perfusión del microscopio.

Ancla la rebanada de cerebro con un arpa de platino. Gire la rejilla de malla de modo que la línea de contactos de electrodos en el extremo distal de la sonda multicanal sea aproximadamente perpendicular a la superficie de la cáscara. Bajo una iluminación de campo amplio y un control fino del micromanipulador, baje la sonda multicanal hacia la superficie de la rebanada.

Acople el cubo de filtro apropiado para la visualización de la proteína reportera fluorescente expresada en los terminales axónicos de las aferencias corticales. Si es necesario, gire la rebanada para alinear con mayor precisión la sonda con la superficie de la cáscara. Coloque la sonda justo por encima del plano del corte a 200 micrómetros de la posición final del objetivo a lo largo del eje x, dejando al menos un canal fuera del área de tejido que se está registrando.

Inserte lentamente la sonda en la rebanada a lo largo de su eje longitudinal. Para minimizar el daño al tejido, solo avance la sonda hasta la medida en que las puntas afiladas sean visibles justo debajo de la superficie del tejido. Cambie la fuente experimental de aCSF a una solución de control en bolsa e identifique la celda marcada con fluorescencia para el registro de pinza de parche dirigido.

Restrinja la apertura al diámetro más pequeño y active el objetivo de inmersión en agua de alta potencia, teniendo cuidado de evitar el contacto entre la sonda multicanal y la lente del objetivo. Enfoca el tejido. Centre la luz sobre un área de tejido adyacente a la sonda multicanal pero que no se superponga.

Conecte el conjunto de filtros adecuado para permitir la obtención de imágenes de las células que expresan el marcador fluorescente dependiente de Cre. Eleve la lente del objetivo para crear un amplio espacio para bajar una pipeta de parche. Cargue una pipeta de parche con solución interna y móntela en el soporte de electrodos.

Utilice una jeringa de un mililitro para aplicar una presión positiva correspondiente a aproximadamente 0,1 mililitros de aire. Baje la pipeta de parche en la solución, enfocando la punta bajo guía visual, y obtenga el registro de toda la célula de la célula objetivo. Los animales utilizados en este protocolo expresaron la proteína reportera fluorescente tdTomato en interneuronas positivas para somatostatina o parvalbúmina.

Estas interneuronas fueron seleccionadas para la sujeción del parche bajo guía visual con el cubo de filtro apropiado activado. Se observaron potenciales postsinápticos en interneuronas en respuesta a un tren de cuatro pulsos de luz de dos milisegundos. También se registraron los potenciales de campo locales.

La densidad de la fuente de corriente y la actividad de unidades múltiples se extrajeron de los potenciales de campo locales. La amplitud de los sumideros de corriente extraídos de la densidad de la fuente de corriente aumentó en función de la intensidad de la luz. Se ajustó a los datos una ecuación logística no lineal de tres parámetros para realizar comparaciones entre rutas.

La amplitud del potencial postsináptico también aumentó con la amplitud del sumidero de corriente. Se midieron las respuestas sinápticas a las entradas talamocorticales y corticocorticales durante las condiciones de control, isoflurano y recuperación. Las respuestas postsinápticas de la somatostatina y los estímulos corticocorticales y los sumideros de corriente evocados se suprimieron en condiciones de isoflurano.

Al preparar las rodajas de cerebro, es primordial mantener la salud del tejido. Es importante mantener el tejido frío durante todo el procedimiento de corte, trabajando rápidamente sin dañar el tejido. Las grabaciones extracelulares multicanal pueden ser posprocesadas de diversas maneras.

Por ejemplo, el filtrado de paso alto de la señal de banda ancha aísla la actividad de aumento de la población, mientras que los cálculos de densidad de fuentes actuales destacan la actividad sináptica. Juntas, estas técnicas nos han permitido explorar los efectos anestésicos en componentes aislados específicos de los circuitos corticales, proporcionando información sobre los mecanismos que subyacen a la pérdida de conciencia in vivo.