Un método cuantitativo de detección de microARN en el riñón de un modelo de ratón con lesión renal isquémica

La expresión alterada de microARN en LRA puede ser útil para biomarcadores y terapia. Este protocolo es sencillo y consigue resultados constantes entre laboratorios. La IRI del riñón representa uno de los principales factores de riesgo para la LRA. La cuantificación de los microARN alterados por IRI conduce a un diagnóstico. Los microARN purificados de la muestra de riñón se aplican a otro sistema. Controle cuidadosamente la hipotermia, la hidratación intestinal y la profundidad de la anestesia durante todo el procedimiento. Esto se debe a que hay muchas técnicas manuales a las que acostumbrarse.

[Narrador] Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, coloque el ratón anestesiado sobre una almohadilla quirúrgica caliente en posición supina. Después de hacer una incisión abdominal en la línea media, use un hisopo de algodón humedecido con PBS para empujar suavemente el intestino hacia el lado izquierdo de la cavidad abdominal adicional para exponer el riñón y el uréter derechos y use fórceps en ángulo para levantar el uréter derecho. Lite el uréter en dos lugares con suturas trenzadas de seda 4-0, dejando lazos más largos para la sutura que está más cerca del riñón, y corte entre las suturas. Sosteniendo con cuidado la sutura restante, diseccione sin rodeos el tejido conectivo y la grasa a lo largo del riñón e identifique un vaso sanguíneo que no sean las arterias o venas renales que suministran sangre al riñón derecho. Ligar el vaso y, cuando el riñón derecho se haya desprendido lo suficiente, ligar la vena y la arteria renal. Con un hisopo de algodón humedecido con PBS, empuje suavemente el intestino hacia el lado derecho de la cavidad abdominal adicional para exponer el riñón izquierdo y cubra el intestino con un paño humedecido. Después de preparar el riñón izquierdo como se ha demostrado, pinzar la arteria y la vena renal a un centímetro del riñón para inducir la isquemia renal izquierda. Una isquemia exitosa puede confirmarse visualmente mediante un oscurecimiento gradual y uniforme del tejido renal. Cuando se confirme la isquemia, devuelva el tejido intestinal a la cavidad abdominal, teniendo cuidado de evitar la torsión intestinal, y cierre y cubra temporalmente la piel abdominal. Después de 25 a 45 minutos, retire la pinza y confirme que la reconversión del flujo sanguíneo y el color del riñón mejoran. Después de confirmar que el intestino no está torcido, instilar PBS intraperitoneal y cerrar el músculo abdominal y la piel en dos capas usando suturas de nailon 4-0. 24 horas después de la inducción de la lesión isquémica, vuelva a abrir la incisión de la línea media y use una aguja de calibre 27 para recolectar la sangre de la vena cava inferior. Haga una incisión en la línea media en la pared torácica e inserte una aguja de calibre 23 en el ventrículo izquierdo. Después de confirmar el reflujo en la aguja, haga una incisión en el lóbulo derecho del hígado e inyecte 20 mililitros de PBS. El hígado cambiará de rojo a rosa, confirmando que se ha drenado suficiente sangre. Use fórceps y tijeras para extirpar el riñón izquierdo y lave el tejido extirpado en un plato de PBS. Luego use las pinzas para quitar la fascia renal sin secar el riñón y córtelo por la mitad a lo largo de la línea media vertical. Para la purificación de microARN, coloque 30 miligramos de la muestra de riñón congelada en un homogeneizador de vidrio que contenga 700 microlitros de reactivo de lisis a base de fenilguanidina en hielo y gire lenta y repetidamente el mortero para homogeneizar completamente la muestra. Cuando el tejido se haya disociado por completo, transfiera el lisado homogeneizado al sistema de trituración de biopolímeros en una columna de centrifugación de microcentrífuga en un tubo de recolección de dos mililitros y recoja la muestra al fondo del tubo por centrifugación. Transfiera el lisado a un nuevo tubo de microcentrífuga que contenga 140 microlitros de cloroformo y mezcle el tubo por inversión durante 15 segundos con la tapa bien apretada. Después de una incubación de dos a tres minutos a temperatura ambiente, sedimente la muestra por centrifugación y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga que contenga 1,5 veces el volumen de etanol al 100% sin alterar el sedimento. Mezcle la muestra durante cinco segundos mediante vórtice antes de transferir 700 microlitros de la muestra a una columna de centrifugación basada en membrana de sílice en un tubo de recolección de dos mililitros. Después de una breve centrifugación, deseche el flujo continuo y lave la muestra dos veces con 500 microlitros de tampón de lavado 2 en una nueva columna de centrifugación basada en membrana de sílice por lavado para eliminar cualquier rastro de sal. Después del segundo lavado, centrifugar de nuevo la columna de centrifugación basada en membrana de sílice y, después de desechar el flujo, transferir la columna a un nuevo tubo de recogida de 1,5 mililitros. Agregue 25 microlitros de agua libre de ARNasa a la columna e incube la muestra durante cinco minutos a temperatura ambiente antes de volver a centrifugar la muestra. Luego transfiera la eluita que contiene microARN de 25 microlitros a un nuevo tubo de microcentrífuga. En este estudio, se investigaron siete microARN que se expresaban en humanos que estaban regulados al alza en los riñones de ratones con lesión renal aguda. Se encontró que los niveles de seis de los microARN aumentaron significativamente en los riñones de ratones con lesión por isquemia por reperfusión en comparación con los de ratones simulados que utilizaron PCR cuantitativa en tiempo real, como se demostró. Los niveles séricos de nitrógeno ureico y creatinina en sangre y la necrosis tubular aguda también se regularon significativamente al alza.

Los biomarcadores para el diagnóstico de IRI y el tratamiento específico de la LRA aún no están claros. Espero que la investigación de microARN avance y contribuya al diagnóstico y tratamiento de la LRA.