Name: Medición de la absorción de glucosa estimulada por insulina y contracción en músculo esquelético maduro aislado e incubado de ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Aprende a medir la absorción de glucosa estimulada por insulina y contracción en músculo esquelético aislado de ratones. Este método ex vivo permite evaluar con precisión el metabolismo glucídico muscular.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Consejo Danés para la Investigación Independiente - Ciencias Médicas (FSS8020-00288B) y la Fundación Novo Nordisk (NNF160C0023046). Este trabajo también fue apoyado por una beca de investigación a Rasmus Kjøbsted de la Academia Danesa de Diabetes, que está financiada por la Fundación Novo Nordisk, número de subvención NNF17SA0031406. Los autores desean agradecer a Karina Olsen, Betina Bolmgren e Irene Bech Nielsen (Departamento de Nutrición, Ejercicio y Deportes, Facultad de Ciencias, Universidad de Copenhague) por su hábil asistencia técnica.

Los autores no tienen nada que revelar

La regulación intacta de la absorción de glucosa en el músculo esquelético es importante para preservar la salud general1. Por lo tanto, la investigación de la absorción de glucosa muscular a menudo sirve como una lectura primaria al evaluar varias intervenciones que alteran la salud. Aquí describimos un método ex vivo para medir la absorción de glucosa en el músculo sóleo y EDL aislado e incubado de ratones en respuesta a la insulina y las contracciones inducidas eléctricamente. El método es rápi...

El músculo esquelético posee la capacidad de extraer grandes cantidades de glucosa del espacio extracelular en respuesta a la insulina y el ejercicio. Esto ayuda a mantener la homeostasis de glucosa en todo el cuerpo y asegura el suministro de glucosa durante los momentos de alta demanda de energía. Dado que se ha demostrado que la regulación intacta de la absorción de glucosa del músculo esquelético es importante para la salud general y el rendimiento físico 1,2, las mediciones de la absorción de glucosa muscular durante diversas afecciones han recibido mucha atención. En humanos y animales, la pinza hiperinsulinémica-euglucémica se ha utilizado como la técnica estándar de oro para evaluar la sensibilidad a la insulina in vivo 3,4. A diferencia de los hallazgos obtenidos de una prueba de tolerancia oral a la glucosa, la técnica de pinza hiperinsulinémica-euglucémica no requiere una función gastrointestinal intacta o la secreción de insulina del páncreas y, por lo tanto, permite comparar las respuestas a la insulina entre sujetos que exhiben variaciones en la función gastrointestinal y / o pancreática. Las mediciones de la absorción de glucosa muscular in vivo durante el ejercicio en humanos se han realizado con frecuencia desde la década de 19605. Primero mediante el uso de técnicas de equilibrio arteriovenoso6 y más tarde mediante el uso de imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET) en combinación con un análogo de glucosa emisora de positrones, por ejemplo, 18F-fluoro-desoxi-glucosa7. En roedores, la absorción de glucosa muscular estimulada por el ejercicio in vivo se realiza típicamente mediante el uso de análogos de glucosa marcados con isótopos radiactivos o estables 8,9,10.
Un método complementario a las mediciones de la captación de glucosa muscular in vivo, es aislar e incubar músculos pequeños de roedores y posteriormente medir la absorción de glucosa utilizando análogos de glucosa marcados con isótopos radiactivos o estables 11,12,13. Este método permite una cuantificación precisa y confiable de las tasas de absorción de glucosa en el músculo esquelético maduro y se puede realizar en presencia de varias concentraciones de insulina y durante la contracción provocada por la estimulación eléctrica. Más importante aún, las mediciones de la absorción de glucosa en el músculo esquelético aislado e incubado son relevantes cuando se investiga el fenotipo metabólico muscular de ratones que se han sometido a diversas intervenciones (por ejemplo, nutrición, actividad física, infección, terapéutica). El modelo de músculo esquelético aislado es también una herramienta adecuada para las pruebas de compuestos farmacológicos que pueden afectar la absorción de glucosa per se y/o modificar la sensibilidad a la insulina12,14. De esta manera, la eficacia de los compuestos diseñados para regular el metabolismo de la glucosa muscular puede ser probada y evaluada en un entorno altamente controlado antes de las pruebas in vivo posteriores en modelos animales preclínicos.
Bajo algunas condiciones, la viabilidad metabólica puede plantear un desafío en el sistema modelo de músculo esquelético aislado e incubado. De hecho, la falta de un sistema circulatorio en los músculos incubados implica que la entrega de sustratos (por ejemplo, oxígeno y nutrientes) depende completamente de la difusión simple entre las fibras musculares y el entorno circundante. Con respecto a esto, es de importancia que los músculos incubados sean pequeños y delgados y, por lo tanto, representen menos barrera para la difusión de oxígeno durante la incubación15. Especialmente durante incubaciones prolongadas durante varias horas, se pueden desarrollar estados hipóxicos debido al suministro insuficiente de oxígeno que resulta en el agotamiento de la energía muscular15. Aunque varios marcadores de viabilidad metabólica en el músculo de rata incubado se han reportado previamente junto con la identificación de variables importantes que ayudan a mantener la viabilidad muscular dela rata 15, todavía se justifica una evaluación exhaustiva de la viabilidad metabólica en pequeños músculos de ratones incubados. Por lo tanto, en la actualidad, el contenido de glucógeno se ha utilizado principalmente como marcador de viabilidad metabólica en el músculo esquelético de ratón incubado16,17.
Aquí describimos un protocolo detallado para medir la absorción de glucosa basal, estimulada por la insulina y la contracción en el músculo sóleo y EDL aislado e incubado de ratones utilizando [3H]2-desoxi-D-glucosa y [14C]manitol como marcador extracelular. En el presente estudio, la absorción de glucosa se midió durante un período de 10 minutos y el método se presenta con el uso de concentraciones de insulina submáxima y máximamente efectivas, así como un protocolo de contracción único. Sin embargo, los protocolos descritos en este documento pueden modificarse fácilmente con respecto al tiempo de incubación, la dosis de insulina y el protocolo de estimulación eléctrica. Además, proporcionamos una caracterización exhaustiva de varios marcadores de viabilidad metabólica en el sóleo incubado y el músculo de ratón EDL. Los resultados indican que la suplementación con glucosa al tampón de incubación es esencial para preservar la viabilidad metabólica del músculo incubado durante 1 hora.

<table><tbody><tr><td>[14C]D-manitol</td><td>Productos químicos radiomarcados americanos, Inc.</td><td>ARC 0127</td><td></td></tr><tr><td>[3H]2-desoxi-D-glucosa&nbsp;</td><td>Productos químicos radiomarcados de Estados Unidos, Inc.</td><td>ART 0103A</td><td></td></tr><tr><td>2-Desoxi-D-glucosa</td><td>Sigma</td><td>D8375</td><td></td></tr><tr><td>4-0 USP sutura quirúrgica de nailon no estéril</td><td>Harvard Apparatus</td><td>51-7698</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina/HRP (conjugado)</td><td>DAKO</td><td>P0397</td><td>Se utiliza para detectar el</td></tr><tr><td>anticuerpo Akt2</td> de la proteína ACC <td>Señalización celular</td><td>3063</td><td></td></tr><tr><td>AMPK&alpha; 2 anticuerpo</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-19131</td><td></td></tr><tr><td>aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>benzamidina</td><td>Sigma</td><td>B6505</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1020831000</td><td></td></tr><tr><td>Kit de calibración (fuerza)</td><td>Danish Myo Technology A/S</td><td>300041</td><td></td></tr><tr><td>Quimioluminiscencia</td><td>Millipore</td><td>WBLUF0500</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Merck</td><td>1084180100</td><td></td></tr><tr><td>D-Manitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>Programa de recolección de datos</td> Software <td>LabVIEW de National Instruments versión 7.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálisis</td><td>Visking</td><td>DTV.12000.09 Tamaño No.9</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagen digital</td><td>BioRad</td><td>ChemiDoc MP</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma EDS</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Estimulador de impulsos eléctricos</td><td>Digitimer</td><td>D330 MultiStim System</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7637</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Novo Nordisk</td><td>Actrapid, 100 IE/mL</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck 1049361000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>104873025</td><td></td></tr><tr><td>leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck</td><td>1058860500</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de miógrafo de tiras musculares</td><td>Danish Myo Technology A/S</td><td>Modelo 820MS</td><td></td></tr><tr><td>Na-Ortovanadato</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Na-pirofosfato</td><td>Sigma</td><td>221368</td><td></td></tr><tr><td>Na-piruvato</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>106041000</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>S1504</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>VWR</td><td>27778260</td><td></td></tr><tr><td>pACC Ser212 anticuerpo</td><td>Señalización celular</td><td>3661</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo pAkt Thr308</td><td>Señalización celular</td><td>9275</td><td></td></tr><tr><td>pAMPK Thr172 anticuerpo</td><td>Señalización celular</td><td>2531</td><td></td></tr><tr><td>fenilmetilsulfonililfluoruro</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Electrodos de platino</td><td>Danés Tecnología Myo A/S</td><td>300145</td><td></td></tr><tr><td>pTBC1D4 Ser588 anticuerpo</td><td>Señalización celular</td><td>8730</td><td></td></tr><tr><td>Contador de centelleo</td><td>Perkin Elmer</td><td>Tri-Carb-2910TR</td><td></td></tr><tr><td>Fluido de centelleo&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>6013329</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis estadístico</td><td>Systat</td><td>SigmaPlot versión 14</td><td></td></tr><tr><td>TBC1D4 anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab189890</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Agua ultrapura</td><td>Merck</td><td>Milli-Q Referencia A+ System</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de la absorción de glucosa estimulada por insulina y contracción en músculo esquelético maduro aislado e incubado de ratones

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

El músculo esquelético es un tejido sensible a la insulina y generalmente absorbe la mayor parte de la glucosa que ingresa a la sangre después de una comida. Además, se ha informado que el músculo esquelético puede aumentar la extracción de glucosa de la sangre hasta 50 veces durante el ejercicio en comparación con las condiciones de reposo. El aumento en la absorción de glucosa muscular durante el ejercicio y la estimulación de la insulina depende de la translocación del transportador de glucosa 4 (GLUT4) de los compartimentos intracelulares a la membrana de la superficie de la célula muscular, así como de la fosforilación de la glucosa a glucosa-6-fosfato por la hexoquinasa II. El aislamiento e incubación de músculos de ratón como m. soleus y m. extensor digitorum longus (EDL) es un modelo ex vivo apropiado para estudiar los efectos de la insulina y la contracción inducida eléctricamente (un modelo para el ejercicio) en la absorción de glucosa en el músculo esquelético maduro. Por lo tanto, el modelo ex vivo permite la evaluación de la sensibilidad a la insulina muscular y permite igualar la producción de fuerza muscular durante la contracción, asegurando un reclutamiento uniforme de las fibras musculares durante las mediciones de la absorción de glucosa muscular. Además, el modelo descrito es adecuado para pruebas farmacológicas de compuestos que pueden tener un impacto en la sensibilidad a la insulina muscular o pueden ser de ayuda cuando se trata de delinear la complejidad reguladora de la absorción de glucosa del músculo esquelético.
Aquí describimos y proporcionamos un protocolo detallado sobre cómo medir la absorción de glucosa estimulada por la insulina y la contracción en preparaciones musculares aisladas e incubadas de sóleo y EDL de ratones que utilizan [3H]2-desoxi-D-glucosa y [14C]manitol como marcador extracelular. Esto permite una evaluación precisa de la absorción de glucosa en el músculo esquelético maduro en ausencia de factores de confusión que puedan interferir en el modelo animal intacto. Además, proporcionamos información sobre la viabilidad metabólica del músculo esquelético de ratón incubado, lo que sugiere que el método aplicado posee algunas advertencias bajo ciertas condiciones al estudiar el metabolismo de la energía muscular.

Como se muestra en la Figura 2, las tasas de absorción de glucosa basal fueron similares entre el sóleo aislado y el músculo EDL de ratones hembra. Esto también se ha reportado varias veces antesde 12,13,19,20. La absorción de glucosa aumentó en ~ 0.8 y ~ 0.6 veces alcanzando 12 y 9 μmol / g de proteína / h en el músculo sóleo y EDL...

La regulación intacta de la absorción de glucosa muscular es importante para mantener la homeostasis de glucosa en todo el cuerpo. Este protocolo presenta una evaluación de la absorción de glucosa estimulada por la insulina y la contracción en el músculo esquelético maduro aislado e incubado al delinear el impacto de varias intervenciones fisiológicas en el metabolismo de la glucosa en todo el cuerpo.

Medición de la absorción de glucosa estimulada por insulina y contracción en músculo esquelético maduro aislado e incubado de ratones

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

El modelo ex vivo es un método útil para evaluar el impacto de diversas intervenciones fisiológicas y compuestos farmacológicos y la absorción de glucosa muscular. Esta técnica permite la evaluación precisa de la absorción de glucosa en el músculo esquelético aislado del ratón en ausencia de factores de confusión que puedan interferir en un modelo animal intacto. Antes de comenzar un experimento, encienda el sistema integrado de biografía de tiras musculares y caliente las cámaras a 30 grados centígrados.Abra el software de recopilación de datos y calibre los transductores forzados para garantizar la comparabilidad entre los conjuntos de datos. Agregue cuatro mililitros de medio de incubación basal precalentado de 30 grados centígrados a cada cámara de incubación y asegúrese de que el medio esté continuamente oxigenado con 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono. Coloque el ratón en posición prona sobre una bandeja de disección y confirme la falta de respuesta al reflejo del pedal.Luego fije una sola pata delantera con una aguja. Use tijeras para quitar la piel de la parte inferior de la pierna hasta que tanto el tendón de Aquiles como la articulación de la rodilla sean visibles. Para la disección del músculo sóleo, conecte un solo lazo de sutura de 0,4 centímetros de diámetro preparado a partir de una pieza de sutura de nylon quirúrgico no absorbible de 16 centímetros al tendón de Aquiles y asegure las pinzas de peen al tendón de Aquiles distalmente al asa.Corte para liberar los músculos sóleo y gastrocnemio de la pata y deslice cuidadosamente las pinzas peen a través del ratón para exponer el músculo sóleo. Fije las pinzas peen y coloque un segundo lazo de sutura alrededor del tendón proximal del músculo sóleo. Corte el tendón proximal y diseccione el sóleo, incluidos los dos asas de sutura unidas libres del músculo gastrocnemio.Tras la recolección, use los bucles para unir rápidamente el músculo sóleo a los respectivos ganchos en una de las cámaras de incubación. Use fórceps para quitar la fascia que cubre el músculo tibial anterior. Los tendones distales de los músculos tibiales anteriores o EDL deben ser blancos claros, visibles y separados entre sí.Cortar el tendón destilado del músculo tibial anterior y diseccionar el músculo. Use fórceps para liberar suavemente el músculo EDL de los tejidos circundantes, dejando el músculo intacto sin cortar los tendones. Coloque bucles de sutura individuales alrededor de los tendones EDL destilados y proximales.Cuando se hayan colocado los bucles, corte los tendones para liberar el músculo EDL con los bucles de sutura unidos y conecte rápidamente los bucles a los ganchos en la segunda cámara de incubación. Luego ajuste la tensión en reposo de cada músculo a aproximadamente cinco mililinewtons y permita que los músculos se equilibren en el medio durante al menos 10 minutos antes de comenzar el experimento. Para medir la absorción de glucosa estimulada por la insulina, reemplace el medio de incubación basal en las cámaras con el medio de incubación sin insulina, una concentración de insulina submáximamente efectiva o una concentración de insulina máximamente efectiva para una incubación de 20 minutos.Al final del período de estimulación, reemplace el medio de incubación con un medio de incubación de absorción de glucosa que contenga una concentración idéntica de insulina durante una incubación de 10 minutos. Al final de la incubación de absorción de glucosa, retire cuidadosamente los músculos de las cámaras de incubación y lave las muestras en un medio de incubación basal helado. Después del lavado, seque rápidamente los músculos en papel de filtro y congele el tejido sin los bucles de sutura en nitrógeno líquido.Luego, recolecte 100 microlitros del medio de incubación de absorción de glucosa de cada cámara para el almacenamiento de 20 grados centígrados y el análisis de absorción de glucosa muscular. Para medir la absorción de glucosa estimulada por la contracción, coloque electrodos de platino centralmente y a ambos lados de los músculos dentro de las cámaras de incubación, e inicie la contracción muscular inmediatamente después de reemplazar el medio de incubación basal con el medio de incubación de absorción de glucosa. Registre la producción forzada de cada músculo incubado.Después de 10 minutos, recoja y congele suavemente los músculos como se ha demostrado, almacenando 100 alícuotas de microlitros del medio de incubación de absorción de glucosa de cada cámara para el análisis de absorción de glucosa muscular como se ha demostrado. Para determinar la señalización miocelular mediante el análisis de western blotting en el mismo conjunto de muestras musculares, homogeneice cada muestra muscular congelada en 400 microlitros de tampón de homogeneización helada y gire la muestra de extremo a extremo durante una hora a cuatro grados centígrados. Luego, recolecte el licato por centrifugación y mida la cantidad de proteína de interés dentro de cada paleta de muestra de acuerdo con los protocolos estándar de análisis de western blot.Para medir la absorción de glucosa en cada muestra, agregue 150 microlitros de sobrenadante de cada muestra y 25 microlitros de medio de incubación de captación de glucosa de las cámaras de incubación correspondientes para separar los viales de conteo de centelleo líquido que contienen tres mililitros de líquido de centelleo líquido por vial. Luego cargue los viales en un contador de centelleo líquido y mida la radiactividad de dos desoxiglucosa y manitol de acuerdo con las pautas del fabricante. En este análisis representativo, las tasas de absorción de glucosa basal fueron similares entre los músculos sóleo y EDL aislados de ratones hembra.La absorción de glucosa aumentó en los músculos sóleo y EDL en respuesta a las concentraciones de insulina submáxima y máximamente efectivas. Además, tanto la ingesta de glucosa estimulada por insulina submáxima como la máxima fueron significativamente mayores en el músculo sóleo. En contraste, la absorción de glucosa inducida por la contracción fue significativamente mayor en el EDL en comparación con el músculo sóleo.Aquí, se puede observar la fuerza muscular máxima producida en los músculos sóleo y EDL durante el período de estimulación de 10 minutos. Como era de esperar, el músculo EDL generó más fuerza durante la parte inicial del período de estimulación, seguido de una disminución rápida más tarde en el período de estimulación. Las concentraciones submáximas y máximas de insulina indujeron un aumento en la fosforilación de Akt treonina 308 y TBC1D4 Serina 588, mientras que la contracción indujo un aumento en la fosforilación de AMPK Alfa treonina 172 y ACC serina 212.Ni la insulina ni la contracción condujeron a un cambio en el contenido total de proteínas. Antes de intentar medir la absorción de glucosa en músculos aislados del ratón, es vital practicar a fondo la disección de los músculos sóleo y EDL. Después de la evaluación de la absorción de glucosa muscular, el lisado de proteína muscular restante se puede utilizar para análisis bioquímicos adicionales que pueden dilucidar los cambios observados en las tasas de absorción de glucosa.

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