Modelo de retinopatía inducida por oxígeno para enfermedades retinianas isquémicas en roedores

Después de su desarrollo, el modelo de retinopatía inducida por oxígeno se ha utilizado ampliamente en estudios preclínicos de enfermedades neovasculares de la retina. Se ha utilizado como modelo para estudiar la angiogénesis patológica en respuesta a la hipoxia. La principal ventaja de este modelo es que induce una respuesta neurovascular robusta, reproducible y fácilmente cuantificable.

Este modelo se puede utilizar como modelo preclínico para estudiar los efectos de posibles candidatos terapéuticos. Se considera un modelo relevante para varias enfermedades humanas, como la retinopatía del prematuro, la retinopatía diabética y la degeneración macular húmeda relacionada con la edad. Registrar el peso de los animales antes y después de la inducción de la hipoxia y en el momento del sacrificio.

Asegúrese de que haya suficiente comida en el fondo de la jaula y agregue cal sodada con indicador de color al fondo de la cámara para absorber el exceso de dióxido de carbono cuando no se use un sistema de filtración. Controle la humedad y la temperatura dentro de la cámara, manteniendo la humedad entre el 40 y el 65%Si es necesario, aumente la humedad de la cámara colocando platos con agua en el fondo. Calibre el sensor de oxígeno con aire ambiental normal y oxígeno al 100%.

Luego coloque los ratones P7 en una cámara y ajuste el nivel de oxígeno al 75%Mantenga a los ratones en la cámara durante cinco días hasta P12, monitoreando a los animales durante la inducción. Cuando termines, retira los ratones de la cámara. Pesar a los animales y hacer marcas de identificación en la cola o en la oreja.

Después de anestesiar al animal, realice un pellizco en el dedo del pie. Un pequeño reflejo es aceptable. Mantenga al animal sobre una almohadilla térmica durante el tratamiento.

Use una jeringa de vidrio con una aguja de calibre 33 a 34 para la inyección de IVT. Aplique una gota de yodo, luego presione el párpado hacia abajo y agarre el globo ocular con pinzas. Realice la inyección detrás del limbo, aproximadamente en un ángulo de 45 grados apuntando hacia el nervio óptico.

Mantenga la aguja en su lugar durante 30 segundos después de inyectar el medicamento para evitar el reflujo de la solución inyectada. Examine el ojo en busca de complicaciones, como hemorragias o daño en la retina, después de retirar la aguja. Aplique ungüento antibiótico sobre el ojo después de la inyección.

Si lo desea, realice imágenes in vivo en animales vivos durante el período de seguimiento para registrar los cambios que se desarrollan en la retina durante las respuestas angiogénicas. Utilice la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral para visualizar las capas de la retina in vivo. Recoja los ojos de los animales cortando el tejido alrededor del ojo, agarrándolo detrás del globo ocular con pinzas curvas y levantando el ojo fuera de la órbita.

Incubar los globos oculares en paraformaldehído filtrado al 4% recién hecho durante una a cuatro horas. Retire el fijador y lave los globos oculares tres veces con PBS durante 10 minutos por lavado. Diseccione las retinas inmediatamente o guárdelas en PBS a cuatro grados centígrados.

Preparar monturas planas de retina para cuantificar la cantidad de neovascularización y el tamaño de las áreas avasculares o AVA. Diseccionar la retina bajo un microscopio estereoscópico usando microtijeras y fórceps. Coloque el globo ocular en PBS para mantenerlo húmedo y punciónelo en el limbo con una aguja de calibre 23, luego corte alrededor del limbo con microtijeras curvas para eliminar el iris y la córnea.

Coloque con cuidado la punta de las tijeras entre el EPR y la retina neural y corte el complejo esclerótico coroideo del EPR hacia el nervio óptico. Haz lo mismo con el otro lado del globo ocular. A continuación, corte o rasgue suavemente el tejido hasta que la copa de la retina quede expuesta.

Saque el lente de la copa de la retina y agregue PBS a la copa. Retire todos los vasos hialoides, el vítreo y los desechos sin dañar la retina. Haz cuatro incisiones en la retina con unas microtijeras rectas para crear una estructura similar a una flor.

Use un pincel suave o una pipeta de transferencia para transferirlo a una placa de pocillo para teñirlo. Etiquetar la vasculatura de la retina con isolectina B4, que tiñe la superficie de las células endoteliales. Incubar las retinas en tampón bloqueante durante una hora y lavarlas con 1%NGS y 0,1%Triton en TBS durante 10 minutos.

Incubar las retinas con 5 a 10 microgramos por mililitro de colorante fluorescente conjugado con isolectina B4 durante la noche a cuatro grados centígrados mientras se protegen de la luz. Al día siguiente, lavar las retinas tres veces con 1% de NGS y 0,1% de Triton en TBS durante 10 minutos por lavado. Coloque las retinas en un microscopio con la retina interna hacia arriba.

A continuación, extienda con cuidado la retina con un pincel suave y retire los vasos hialoides o residuos restantes. Agregue medio de montaje en la parte superior de la muestra y coloque un cubreobjetos en la parte superior del portaobjetos. Almacena las retinas a cuatro grados centígrados protegidas de la luz.

Tome imágenes de las monturas planas de la retina utilizando un microscopio de fluorescencia con un objetivo 10X. Enfoque en el plexo vascular superficial y la neovascularización prerretiniana. Cree una imagen de escaneo de mosaico para capturar toda la retina y fusionar los escaneos de mosaico.

Cuantificar las imágenes midiendo los AVA, el área de neovascularización y el área total de la retina mediante un programa de procesamiento de imágenes. Dibuje los AVA y el área total de la retina con una herramienta de dibujo a mano alzada y seleccione las áreas neovasculares con una herramienta de selección. En el modelo de retinopatía inducida por oxígeno en ratones, la vasoobliteración se produce en la retina central.

Mientras que en el modelo de rata, se desarrolla en la periferia de forma similar a la ROP humana. La neovascularización prerretiniana se desarrolla cerca de las áreas avasculares, específicamente la retina central en el ratón y la periferia en las ratas. El análisis histológico utilizando secciones transversales o montajes planos se puede realizar para evaluar los cambios morfológicos en las retinas OIR o la presencia de tipos celulares de interés, por ejemplo, células inflamatorias.

Opcionalmente, se pueden realizar imágenes in vivo no invasivas durante el período de seguimiento de la OIR. La vasculatura retiniana y hialoidea se puede visualizar con angiografía con fluoresceína y la tomografía de coherencia óptica de dominio espectral se puede utilizar para evaluar los cambios estructurales en la retina. Los cambios funcionales se pueden medir mediante electrorretinografía.

Aflibercept, una trampa soluble de VEGF, inhibe la revascularización neovascular y fisiológica en la OIR. Los ojos OIR inyectados en P14 con una dosis alta de aflibercept tenían AVA retinianos aún más grandes que los ojos no tratados, lo que sugiere que aflibercept también bloquea la revascularización fisiológica de la retina impulsada por la hipoxia. Al intentar este protocolo, recuerde considerar el tamaño de camada adecuado para su experimento con anticipación y monitorear el bienestar de las madres y las crías en la cámara de oxígeno.

Tenga en cuenta que el aumento de peso postnatal afecta el resultado en el modelo. Las muestras de retina obtenidas a partir de este modelo se pueden utilizar para métodos analíticos, como inmunohistoquímica, análisis de expresión génica o de proteínas, y para medir los efectos de posibles candidatos terapéuticos en la retina a nivel molecular.