Name: Estrategia fosfoproteómica para perfilar la señalización de estrés osmótico en Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Aprende fosfoproteómica de alto rendimiento para estudiar señalización de estrés osmótico en Arabidopsis. Este método permite analizar cambios globales del fosfoproteoma con cobertura profunda y reproducibilidad.

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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación estratégica prioritaria de la Academia China de Ciencias, Grant XDB27040106.

1. Preparación de muestras
<ol><li>Cosecha las plándas tratadas con control y estrés (1 g) en una lámina de aluminio y el flash congela las muestras en nitrógeno líquido. NOTA: Por lo general, se observa una mayor concentración de proteínas a partir de plándas de dos semanas de antigüedad que la de plantas maduras. Un gramo de plándalo genera aproximadamente 10 mg de lisato proteico, que es suficiente para el análisis de EM. Todos los pasos de centrifugación tienen lugar a 16.000 x g en el paso 1.</li>
	<li>Moler plándas congeladas en un polvo fino usando un mortero y pestle lleno de nitrógeno líquido.</li>
	<li>Añadir 1 ml de tampón de lisis ((6 M guanidina-HCl en Tris-HCl de 100 mM, pH 8.5) con tris de 10 mM (2-carboxetil)clorhidrato de fosfina (TCEP), 40 mM 2-cloroacetamida (CAA), inhibidor de la proteasa e inhibidor de la fosfatasa cócteles) al mortero y mezclar con la ayuda de pestle.</li>
	<li>Transfiera la planta a un tubo de 1,5 ml y caliente a 95 °C durante 5 minutos.</li>
	<li>Coloque el tubo sobre hielo durante 10 minutos. Sonice el tubo en hielo durante 10 s, haga una pausa de 10 s y repita tres veces.</li>
	<li>Centrífuga el tubo durante 20 min y alícuota 150 μL de lysato vegetal en un tubo de 1,5 ml.</li>
	<li>Añadir 600 μL de 100% metanol en el tubo. Vórtice y girar por el tubo.</li>
	<li>Añadir 150 μL de cloroformo al 100% en el tubo. Vórtice y girar por el tubo.</li>
	<li>Añadir 450 μL de ddH2O en el tubo. Vórtice y centrífuga el tubo durante 3 min.</li>
	<li>Deseche la capa acuosa superior. Añadir 600 μL de 100% metanol en el tubo. Centrífuga el tubo durante 3 minutos y luego deseche la solución.</li>
	<li>Lave pellets proteicos con 600 μL de 100% metanol. Deseche la solución y seque al aire el pellet proteico.</li>
	<li>Pellets proteicos resuspend en 600 μL de tampón de digestión (desoxicolato sódico de 12 mM (SDC)/12 mM de sarcosinato de lauroilo sódico (SLS) en Tris-HCl de 100 mM, pH 8.5). Sonice el tubo hasta que se homogeneice la suspensión.</li>
	<li>Mida la concentración de proteínas utilizando un kit BCA y ajuste la concentración a 4 μg/μL con el búfer de digestión. Transfiera 100 μL del lisato (400 proteínas de μg) a un nuevo tubo.</li>
	<li>Añadir 292 μL de bicarbonato de trietillammonio de 50 mM (TEAB) y 8 μL de Lys-C (2,5 Unidades/ml) al tubo. Incubar el tubo a 37 °C durante 3 h.</li>
	<li>Añadir 100 μL de 50 mM TEAB con 8 μg de trippsina al tubo. Incubar el tubo a 37 °C durante 12 h.</li>
	<li>Añadir 25 μL de ácido trifluoroacético (TFA) al tubo al 10%. Vórtice y centrífuga el tubo durante 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a una columna de desalada condicionada para desalar. Seque el eluato con un concentrador de centrífuga de vacío. NOTA: Activa la resina con 1 ml de metanol seguido de 1 ml de 0,1% de TFA en acetonitrilo al 80% (ACN). Lave el disolvente orgánico con al menos 3 ml de 0,1% de TFA en 5% ACN. Cargue muestras de péptidos acidificados preparadas en el paso 1.16 en la columna y luego lave la columna con al menos 3 ml de 0.1% de TFA en 5% ACN. Es posible que se necesiten más lavados para muestras con altas concentraciones de sal. Elute los fosfopéptidos con 1 ml de 0,1% de TFA en 80% ACN.</li>
</ol>2. Etiquetado de etiqueta de etiqueta de masa tándem (TMT)
<ol><li>Resuspend los péptidos secos en 100 μL de 200 mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES), pH 8.5.</li>
	<li>Disolver el reactivo TMT de cada canal (0,8 mg) en 40 μL de ACN anhidra. Vórtice el tubo reactivo TMT durante 5 minutos y girarlo hacia abajo.</li>
	<li>Transfiera 40 μL de TMT al tubo de muestra e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. NOTA: En este experimento, el canal 126 a 128 fue etiquetado con tres réplicas biológicas de plantas sin tratamiento de manitol, y el canal 129 a 131 fueron etiquetados con tres réplicas biológicas de plantas con tratamiento de manitol.</li>
	<li>Añadir 8 μL de 5% hidroxilamina e incubar durante 15 min.</li>
	<li>Mezclar 6 muestras en un tubo de 5 ml y añadir 14 μL de 10% de TFA.</li>
	<li>Añadir 3.876 μL de 0,1% de TFA al tubo. Vórtice y girar hacia abajo.</li>
	<li>Transfiera la solución a una columna de desalting condicionada para desalar. Seque el eluato con un evaporador.</li>
</ol>3. Preparación de la punta de etapa de la IMAC
<ol><li>Utilice una aguja de extremo contundente de 16 G para penetrar en un disco frit de polipropileno. NOTA: Sujete la cortadora perpendicular a la superficie del disco y enrolle el cortador un par de veces para asegurarse de que el disco está completamente excizado. Coloque el disco en una placa De Petri para su almacenamiento. Coloque la aguja en una punta de pipeta de 200 μL y empuje el frit en la punta usando un émbolo.</li>
	<li>Presione suavemente el encrespamiento en la punta con un émbolo para tapar el extremo de la punta.<ol>
<li>Coloque el disco frit en puntas con la misma presión, lo que proporciona una mejor reproducibilidad. La reproducibilidad de la producción de puntas de etapa es importante para la presión de retroceso constante, que afecta el tiempo de los pasos de centrífuga y la reproducibilidad entre las réplicas técnicas.</li>
		<li>Si las puntas del escenario muestran una alta presión de espalda durante el paso de acondicionamiento, deseche las puntas para evitar posibles obstrucciones de la punta al cargar muestras. Podría ser que el disco podría haber sido presionado demasiado duro en posición.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Invierta la columna de giro Ni-NTA y colóquela en un tubo de 1,5 ml.</li>
	<li>Utilice un émbolo para presionar suavemente el frit de las cuentas Ni-NTA y empuje las cuentas en el tubo. NOTA: Asegúrese de empujar el frit suavemente para evitar la posible pérdida de cuentas o adsorción en la columna de giro.</li>
</ol>4. Preparación de la punta de etapa hp-rp
<ol><li>Prepare la punta de etapa hp-RP como se describe para la punta de etapa IMAC mediante un disco C8. NOTA: No aplique una fuerza grande al disco porque puede dar lugar a un frit densamente embalado y aumentar la presión posterior de la punta del escenario. Todos los pasos de centrifugación tienen lugar a 1.000 x g durante 5 minutos en el paso 4.</li>
	<li>Suspender 1 mg de cuentas C18 en 100 μL 100% metanol y pasar la solución de cuentas a través de la punta.</li>
	<li>Añadir 20 μL de buffer 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2,pH 10.0) a la punta del escenario y pasar el buffer 8 a través de la punta por centrifugación.</li>
	<li>Agregue 20 μL de buffer A (200 mM NH4HCO2)a la punta de etapa y pase el buffer A a través de la punta por centrifugación. NOTA: Equilibre la centrífuga durante el uso y asegúrese de que la punta de la etapa Hp-RP no esté completamente seca.</li>
</ol>5. Preparación del adaptador de giro
<ol><li>Utilice pinzas de extremo afilado para perforar un agujero en el centro de la tapa de un tubo de 1,5 ml.</li>
	<li>Inserte la punta de etapa IMAC o la punta de la etapa Hp-RP en el orificio del adaptador de giro. NOTA: Asegúrese de que la punta del escenario no esté cerca de la parte inferior del adaptador de giro.</li>
</ol>6. Enriquecimiento de fosfopéptido usando la punta de etapa de IMAC
<ol><li>Suspenda las cuentas Ni-NTA de 10 mg con 400 μL de búfer de carga (6% ácido acético (AA), pH 3.0) y cargue toda la solución de cuentas en por punta. Pase la solución a través de la punta por centrifugación. NOTA: Todos los pasos de centrifugación tienen lugar a 200 x g durante 3 minutos en el paso 6 además del paso 6.8.</li>
	<li>Cargue 100 μL de ácido etilenodiaminetetraacético de 50 mM (EDTA) para quitar los iones de níquel de la punta de etapa IMAC y pasar la solución a través de la punta por centrifugación.</li>
	<li>Cargue 100 μL de búfer de carga a la punta del escenario y pase la solución a través de la punta por centrifugación.</li>
	<li>Cargue 100 μL de 50 mM FeCl3 en un 6% AA a la punta del escenario y pase la solución a través de la punta por centrifugación. Los iones Fe3+ se quelarán a la punta del escenario de IMAC.</li>
	<li>Cargue 100 μL de búfer de carga para acondicionar la punta del escenario y pasar la solución a través de la punta por centrifugación.</li>
	<li>Cargue 100 μL de búfer de carga con péptidos de muestra preparados en el paso 2.7 hasta la punta del escenario y pase la solución a través de la punta por centrifugación. NOTA: Tome un nuevo tubo como adaptador de espín para recoger el flujo de la muestra y almacenar el flujo en el congelador para su análisis futuro.</li>
	<li>Cargue 100 μL de búfer de lavado (4,5% AA y 25% ACN) a la punta del escenario y pase la solución a través de la punta por centrifugación.</li>
	<li>Realice el segundo lavado con búfer de carga. Cargue 100 μL de búfer de carga a la punta del escenario y pase la solución a través de la punta utilizando centrífuga de 1000 × g durante 3 minutos. NOTA: Asegúrese de que el búfer de lavado se reemplaza por el búfer de carga en la punta del escenario para eliminar la pérdida de fosfopéptidos durante el paso de elución. Eequilibrar la punta de la etapa IMAC antes de la elución de fosfopéptido para asegurar que la concentración de ACN esté por debajo del 5%.</li>
	<li>Recorta la punta de la etapa IMAC en la parte delantera con una tijera y coloca la punta de la etapa IMAC recortada dentro de la punta hp-RP. Asegúrese de que las dos capas de puntas del escenario no toquen la tapa de la centrífuga.</li>
</ol>7. Fraccionamiento de fosfopéptido usando la punta de etapa Hp-RP C18
<ol><li>Añadir 100 μL de tampón de elución (fosfato de amonio de 200 mM (NH4H2PO4)) a la punta de etapa IMAC recortada y pasar la solución a través de las dos capas de puntas de etapa por centrifugación. NOTA: Si la solución no pasa a través de la punta del escenario, aumente la velocidad de giro hacia abajo. Todos los pasos de centrifugación tienen lugar a 1.000 x g durante 5 minutos en el paso 7. Todos los búferes Hp-RP se enumeran en la Tabla 1.</li>
	<li>Deseche la punta de la etapa IMAC usando una pinza y agregue 20 μL de Buffer A a la punta de etapa Hp-RP y pase el búfer a través de la punta por centrifugación. NOTA: Asegúrese de que todo el búfer de elución pase a través de la punta de la etapa IMAC antes de descartarla.</li>
	<li>Añadir 20 μL de Buffer 1 a elute fracción 1 y recoger el eluato en un nuevo tubo por centrifugación. Repita el proceso con buffers 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 para recoger cada fracción en un tubo nuevo. Seque el eluato final de cada fracción utilizando un concentrador de vacío. NOTA: Prepare búferes de fraccionamiento nuevos. Tome 8 tubos nuevos como adaptador de espín de cada fracción. Recoge el eluato de cada fracción en un adaptador de espín diferente. Los fosfopéptidos no son estables en condiciones básicas, por lo que secan los elutos por un concentrador o acidificados por un 10% de TFA inmediatamente.</li>
</ol>8. Análisis y análisis de datos LC-MS/MS
<ol><li>Añadir 5 μL de ácido fórmico (FA) del 0,1% y analizar la muestra mediante un espectrómetro de masas.</li>
	<li>Ejecute un degradado de 90 minutos con 6-30% buffer B (80% ACN y 0.1% FA) para cada fracción.</li>
	<li>Fragmente los 10 péptidos etiquetados como top 10 mediante disociación de energía de alta colisión (HCD). Complete una búsqueda de base de datos para identificar sitios de fosforilación.</li>
	<li>Cargue los archivos sin procesar en el software MaxQuant, asigne un nombre a los experimentos y establezca fracciones y PTM. NOTA: El tutorial del software MaxQuant se puede encontrar en https://www.maxquant.org/.</li>
	<li>Seleccione reporter ion MS2 en el tipo de ejecución LC-MS/MS y 6plex TMT como etiquetas isobáricas. Habilite el filtro mediante la función PIF y establezca el PIF mínimo como 0,75.</li>
	<li>Seleccione Acetil (proteína N-término), Oxidación (M) y Fosfo (STY) en el panel de modificaciones variables. Seleccione Carbamidomethyl (C) como modificaciones fijas.</li>
	<li>Establece el modo de digestión como específico, selecciona Trypsin/P como enzima de digestión y dos escotes perdidos.</li>
	<li>Establezca psm falsa tasa de descubrimiento (FDR) y proteína FDR como 0.01. Establezca la puntuación mínima para péptidos modificados como 40.</li>
	<li>Agregue la base de datos Arabidopsis thaliana al panel de archivos fasta y ejecute la búsqueda de bases de datos.</li>
	<li>Cargue el archivo txt de los sitios de Fosfo (STY) en el software Perseus mientras se realiza la búsqueda. NOTA: Los tutoriales detallados del software Perseus se pueden encontrar en https://www.maxquant.org/perseus/.</li>
	<li>Filtre los sitios de fosforilación inversa. Filtre los sitios de fosforilación no localizados utilizando una probabilidad de localización del 75% como corte.</li>
	<li>Utilice las intensidades de los sitios de fosforilación para el análisis estadístico.</li>
</ol>

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<li>Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((through+signaling+between+wheat+and+the+fungal+pathogen+Septoria+tritici+revealed+by+proteomics+and+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics.</a> Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).</li>
<li>Tsai, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+Mass+Tag+labeling+facilitates+reversed-phase+liquid+chromatography-mass+spectrometry+analysis+of+hydrophilic+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides.</a> Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

El rango dinámico y la complejidad del proteoma vegetal y el fosfoproteoma siguen siendo un factor limitante a la profundidad de los análisis de fosfoproteómica. A pesar de la capacidad del análisis LC-MS/EM de una sola ejecución para identificar 10.000 sitios de fosforilación21,22,la cobertura de todo el fosfoproteoma vegetal sigue siendo limitada. Por lo tanto, se requiere un flujo de trabajo fosfoproteómico que proporcione alta sensibilidad y eficiencia de sep...

La alta salinidad, las bajas temperaturas y la sequía causan tensiones osmóticas, que es un factor ambiental importante que afecta la productividad de las plantas1,2. La fosforilación proteica es una de las modificaciones post-traslacionales más significativas que median la percepción y la transducción de la señal en respuesta de la planta a la tensión osmótica3,4,5. La proteína quinasa 2s (SnRK2s) relacionada con SNF1 está implicada en la señalización de tensión osmótica6. Nueve de cada diez miembros de la familia SnRK2 muestran una activación significativa en respuesta al estrés osmótico7,8. El snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple (snrk2-dec) mutante que tiene mutaciones en los diez SnRK2 mostró hipersensibilidad al estrés osmótico. En el mutante snrk2-dec, la acumulación osmótica inducida por estrés de inositol 1,4,5-trisphosphato (IP3),biosíntesis de ácido abscísico (ABA) y expresiones génicas se reducen fuertemente, destacando el papel vital de SnRK2s en las respuestas de estrés osmótico6. Sin embargo, todavía no está claro cómo las quinasas SnRK2s regulan estos procesos biológicos. Perfilar los cambios fosfoproteómicos en respuesta al estrés osmótico es una manera eficiente de cerrar esta brecha y delinear los mecanismos de defensa activados por estrés osmótico en las plantas.
La espectrometría de masas (EM) es una potente técnica para mapear la fosfoproteomavegetal 9. Sin embargo, la caracterización de la fosfoproteómica vegetal sigue siendo un desafío debido al rango dinámico del proteoma vegetal y a la complejidad del lysatovegetal 4. Para superar estos desafíos, desarrollamos un flujo de trabajo fosfoproteómico vegetal universal, que elimina interferencias no deseadas como los pigmentos fotosintéticos y metabolitos secundarios, y permite la cobertura profunda de fosfoproteoma vegetal10. Se han desarrollado varios métodos de enriquecimiento de fosfopéptidos como cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) y cromatografía de óxido metálico (MOC) para enriquecer fosfopéptidos antes del análisis de EM11,12,13,14,15,16. Los no fosfopéptidos ácidos que se purifican con fosfopéptidos son las principales interferencias para la detección de fosfopéptidos. Anteriormente, estandarizamos el valor de pH y la concentración de ácido orgánico del búfer de carga IMAC para eliminar la unión de no fosfopéptidos, para obtener más del 90% de especificidad de enriquecimiento pasando por alto el paso de pre-fraccionamiento11.
La pérdida de muestras en el proceso de varios pasos de enriquecimiento y fraccionamiento de fosfopéptidos dificulta la sensibilidad de la identificación de fosfopéptidos y la profundidad de la cobertura fosfoproteómica. Las puntas stop-and-go-extraction (puntas de escenario) son puntas de pipeta que contienen pequeños discos para tapar el extremo de la punta, que se pueden incorporar con cromatografía para el fraccionamiento de péptidos y limpieza17. La pérdida de muestras durante el procedimiento de la punta del escenario se puede minimizar evitando la transferencia de muestras entre los tubos. Hemos implementado con éxito la punta de etapa en Ga3+-IMAC y Fe3+-IMAC para separar péptidos fosforilados múltiples de baja abundancia de péptidos fosforilados, que mejoraron la profundidad del fosfoproteoma humano15. Además, el uso de alta punta de etapa de fase invertida de pH (Hp-RP) ha demostrado la mayor cobertura del proteoma de membrana humana en comparación con la del intercambio de cationes fuertes (SCX) y la cromatografía de intercambio de aniones fuertes (SAX)18. Por lo tanto, la integración de las técnicas de punta de etapa IMAC y Hp-RP puede aumentar la cobertura de fosfoproteoma vegetal con simplicidad, alta especificidad y alto rendimiento. Hemos demostrado que esta estrategia identificó más de 20.000 sitios de fosforilación de plánexas arabidopsis, lo que representa una mayor profundidad de fosfoproteoma vegetal19.
Aquí, informamos de un protocolo fosfoproteómico basado en la punta de etapa para la elaboración de perfiles fosfoproteómicos en Arabidopsis. Este flujo de trabajo se aplicó para estudiar la perturbación fosfoproteómica de plántulos mutantes de tipo salvaje y snrk2-dec en respuesta al estrés osmótico. El análisis fosfoproteómico reveló los sitios de fosforilación implicados en la activación de la quinasa y la señalización de estrés osmótico temprano. El análisis comparativo de datos de fosfoprotemas mutantes de tipo salvaje y snrk2-dec llevó al descubrimiento de una cascada de quinasa similar a Raf (RAF)-SnRK2 que desempeña un papel clave en la señalización de estrés osmore en plantas altas.

<table><tbody><tr><td>Tubo de 1,5 mL</td><td>eppendorf</td><td>22431081</td><td>Protein LoBind, 1,5 mL, PCR limpio, incoloro, 100 tubos</td></tr><tr><td>200 y micro; Punta de pipeta</td><td>en L Gilson</td><td>F1739311</td><td></td></tr><tr><td>2-cloroacetamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0267</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5438080100</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>hidróxido de amonio</td><td>Sigma-Aldrich 338818</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fosfato de amonio monbasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216003</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>aguja roma</td><td>Hamilton</td><td>90516</td><td>Cubo Kel-F (KF), estilo de punta 3, calibre 16</td></tr><tr><td>Perlas C18-AQ</td><td>Dr. Maisch</td><td>ReproSil-Pur-C18-AQ 5 &micro; m</td><td></td></tr><tr><td>C8 Disco Empore</td><td>3 M</td><td>2214</td><td>47 mm</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>eppendorf</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CX1058</td><td></td></tr><tr><td>software</td><td></td> de análisis de datos <td>Perseus 1.6.2.1</td><td>https://maxquant.net/perseus/</td></tr> <tr><td>ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fórmico Ácido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>Fritas</td><td>Agilent</td><td>12131024</td><td>Fritas para cartuchos SPE</td></tr><tr><td>Clorhidrato de guanidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50933</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1153334000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de hierro (III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157740</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-orbitrap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Velos Pro</td><td></td></tr><tr><td>espectrómetro de masas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LTQ-Orbitrap Velos Pro</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>nano LC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Easy-nLC 1000</td><td></td></tr><tr><td>Columna de espín Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>31014</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroilsarcosine sal de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Émbolo</td><td>Hamilton</td><td>1122-01 Conjunto de</td><td>émbolo N, RN, LT, LTN para el modelo 1702 (25 &mu; l)</td></tr><tr><td>software</td><td></td> de motor de búsqueda <td>MaxQuant 1.5.4.1</td><td>https://www.maxquant.org</td></tr><tr><td>SEP-PAK Cartucho 50 mg</td><td>Aguas</td><td>WAT054960</td><td></td></tr><tr><td>desoxicolato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SPD121P</td><td></td></tr><tr><td>TMT 6-plex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90061</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de bicarbonato de trietilamonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91707</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

estrategia fosfoproteómica para perfilar la señalización de estrés osmótico en arabidopsis

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

La fosforilación proteica es crucial para la regulación de la actividad enzimática y la expresión génica en condiciones osmóticas. La espectrometría de masas (EM) basada en la fosfoproteómica ha transformado la forma de estudiar la transducción de la señal vegetal. Sin embargo, el requisito de una gran cantidad de materiales de partida y el tiempo prolongado de medición de EM para lograr la profundidad de cobertura ha sido el factor limitante para el estudio de alto rendimiento de los cambios fosfoproteómicos globales en las plantas. Para mejorar la sensibilidad y el rendimiento de la fosfoproteómica vegetal, hemos desarrollado un enfoque de extracción de parada e ir (etapa) basado en puntas fosfoproteómicas junto con etiquetado de etiqueta de masa tándem (TMT) para el análisis rápido e integral de la perturbación de la fosforilación vegetal en respuesta al estrés osmótico. Aprovechando la simplicidad y el alto rendimiento de la técnica de punta de etapa, todo el procedimiento tarda aproximadamente una hora utilizando dos consejos para terminar el enriquecimiento de fosfopéptidos, fraccionamiento y pasos de limpieza de muestras, lo que sugiere un fácil de usar y una alta eficiencia del enfoque. Este enfoque no sólo proporciona un análisis de fosfoproteómica vegetal en profundidad (> 11.000 identificación de fosfopéptido) sino que también demuestra la eficiencia de separación superior (< 5% de superposición) entre fracciones adyacentes. Además, se ha logrado la multiplexación utilizando el etiquetado TMT para cuantificar los cambios fosfoproteómicos de las plantas mutantes de decuple de tipo salvaje y snrk2. Este enfoque se ha utilizado con éxito para revelar los eventos de fosforilación de quinasas similares a Raf en respuesta al estrés osmótico, que arroja luz sobre la comprensión de la señalización osmótica temprana en las plantas terrestres.

Para demostrar el rendimiento de este flujo de trabajo, explotamos la punta de etapa de IMAC junto con el fraccionamiento de punta de etapa Hp-RP para medir los cambios fosfoproteómicos en plándela mutantes de tipo salvaje y snrk2-dec con o sin tratamiento de manitol durante 30 minutos. Cada muestra se realizó en triplicatos biológicos y el flujo de trabajo experimental se representa en la Figura 1. Los péptidos digeridos (400 μg) de cada muestra fueron etiquetados con un canal TMT-...

Aquí se presenta un enfoque fosfoproteómico, a saber, detener e ir extracción a base de punta fosfoproteómica, que proporciona alto rendimiento y cobertura profunda de arabidopsis fosfoproteoma. Este enfoque delinea la visión general de la señalización de estrés osmótico en Arabidopsis.

Estrategia fosfoproteómica para perfilar la señalización de estrés osmótico en Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Esta estrategia es una poderosa herramienta para estudiar de manera integral los cambios globales de los fosfoproteomas de las plantas, en respuesta a estreses bióticos o abióticos. Esta técnica permite un análisis fosfoproteómico en profundidad, de una manera fácil de usar y de alto rendimiento. Para la preparación de la punta de la etapa IMAC, use una aguja de punta roma de calibre 16 para penetrar un disco de frita de propileno y use un émbolo para presionar suavemente la frita en la punta.Luego, coloque una columna de centrifugación de níquel-NTA invertida, en un tubo de 1,5 mililitros, y use el émbolo para presionar suavemente la frita de perlas de níquel-NTA en el tubo. Para el enriquecimiento de fosfopéptidos, utilizando una punta de etapa IMAC, agregue 400 microlitros de tampón de carga a las perlas de níquel-NTA y cargue todo el volumen de solución de perlas en una punta de etapa IMAC. Pasar la solución a través de la punta por centrifugación y cargar 100 microlitros de EDTA de 50 milimolares, para extraer los iones de níquel de la punta por centrifugación.Tratar la punta con 100 microlitros de tampón de carga por centrifugación. A continuación, tratar la punta con 100 microlitros de cloruro férrico de 50 milimolares en ácido acético al 6%, por centrifugación. Acondicionar la etapa con 100 microlitros de tampón de carga, por centrifugación.Seguido de centrifugación con 100 microlitros de tampón de carga, suplementado con los péptidos de la muestra. Después de la centrifugación, enjuague la punta dos veces, con 100 microlitros de tampón de lavado por lavado, seguido de un enjuague con 100 microlitros de tampón de carga. Al final de la centrifugación, use unas tijeras para recortar la parte delantera de la punta de la etapa IMAC y coloque la punta recortada dentro de la punta de fase inversa de pH alto.Para el fraccionamiento de fosfopéptidos, utilizando una punta de etapa C18 de fase inversa de pH alto, pase 100 microlitros de tampón de elución a través de ambas capas de puntas de etapa, por centrifugación. Al final del centrifugado, use pinzas para desechar la punta de la etapa IMAC y agregue 20 microlitros de tampón A a la punta de la etapa de fase inversa de pH alto. Después de la centrifugación, agregue 20 microlitros de tampón 1, a la fracción recolectada, y recoja el eluido en un tubo nuevo, por centrifugación.Repita el proceso con los tampones 2 a 8, hasta que se hayan recogido las ocho fracciones. A continuación, seque el eluido final de cada fracción en un concentrador de vacío. En este análisis representativo, se identificaron un total de 8, 107 y 7, 248 fosfopéptidos de muestras de mutantes de tipo salvaje y SnRK2 decuples, respectivamente, lo que ilustra la eficiencia del flujo de trabajo al proporcionar una cobertura en profundidad para delinear la visión global de la transducción de señales en Arabidopsis.La comparación del número de fosfopéptidos identificados en ocho fracciones reveló la presencia de pocos fosfopéptidos en las dos primeras fracciones, pero la mayoría de los fosfopéptidos se distribuyeron uniformemente entre las últimas seis fracciones. Lo que sugiere este enfoque proporciona la capacidad de separar los fosfopéptidos complejos del fosfoproteoma de la planta. La evaluación de la superposición de fosfopéptidos entre dos fracciones adyacentes, indicó que menos del 5% de los fosfopéptidos se superponen en las fracciones adyacentes.Después del tratamiento con manitol, se incrementaron 433 sitios de fosforilación en la muestra de tipo salvaje. Mientras tanto, se incrementaron 380 sitios en la muestra del mutante SnRK2 decuple. Entre estas, 312 fosfositas mostraron inducción en plantas de tipo silvestre, pero no en plantas mutantes SnRK2 dec.Es importante utilizar la misma cantidad de presión para cargar el disco de frita en las puntas, para garantizar una mejor reproducibilidad del análisis. Próximamente, la cromatografía de intercambio catiónico podrá utilizarse, como medida alternativa, para fraccionar los fosfopéptidos enriquecidos, con el fin de obtener una cobertura más amplia del fosfoproteoma de la planta.

phosphoproteomic-strategy-for-profiling-osmotic-stress-signaling

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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