Aislamiento Y Cultivo De Células Madre Mesenquimales De Médula Ósea Mandibular En Ratas
25 de agosto de 2020
Este artículo presenta un método que combine la adherencia entera de la médula y el flujo cytometry que clasifica para aislar, cultivar, clasificar, e identificar las células madres mesenquimales de la médula de las mandíbulas de la rata.
Los estudios han demostrado que las BMSC derivadas del hueso facial craneal exhiben capacidades superiores a las de los huesos axiales y apendiculares. Por lo tanto, las BMSC mandibulares se consideran el recurso preferido para el desarrollo de futuras terapias de las enfermedades craneofaciales. Este protocolo combina las ventajas de la adherencia a la médula ósea total y la clasificación de células fluorescentes para obtener un número significativo de BMSC mandibulares purificadas en poco tiempo.
Si está probando este protocolo por primera vez, creo que es muy importante comprender la estructura anatómica y el movimiento funcional de la mandíbula de la rata, lo que se puede lograr viendo este video o leyendo literatura relacionada. Después de sacrificar a la rata, colóquela en una campana de gases limpia en posición supina. Incisión en la piel y los músculos buccinadores desde el ángulo de la cabeza bilateral hasta la región posterior de la mandíbula.
Abra la boca de la rata empujando los incisivos maxilares y mandibulares hacia la dirección opuesta con ambos pulgares, para exponer los dientes mandibulares, que están unidos a la mandíbula. Desconecte completamente los músculos bucales y los tendones unidos a los coracoides y el borde inferior de la mandíbula. A continuación, presione los dientes posteriores mandibulares y gírelos hacia atrás y hacia abajo hasta que los cóndilos de ambos lados queden claramente expuestos.
Separe el cuerpo de la mandíbula del cráneo y limpie el tejido blando adherido en la superficie ósea con una gasa húmeda. Coloque el hueso en un plato de vidrio estéril de 10 centímetros lleno de medio alfa esencial mínimo preenfriado, o PBS, en hielo, para preservar la viabilidad. Corte el hueso anterior a lo largo del borde mesial del primer molar del cuerpo mandibular, luego extraiga la rama mandibular, incluyendo el coracoide y el cóndilo a lo largo del borde distal del tercer molar para exponer la cavidad medular.
Llene un plato de vidrio estéril de 10 centímetros con 10 mililitros de alfa-MEM con 10%FBS. Aspire el medio con una jeringa de 10 mililitros, luego inserte la aguja en la cavidad de la médula ósea y enjuague repetidamente la médula ósea en el plato. Enjuague la cavidad ósea al menos tres veces desde los lados mesial y distal del hueso, respectivamente, hasta que el hueso se vuelva blanco.
Transfiera el medio que contiene las celdas lavadas a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y centrifuérrelo a 800 RPM y durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con tres mililitros de alfa-MEM con 10% de FBS. Coloque las células en una nueva placa de cultivo de 10 centímetros e incube a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%.
Aspire el medio de cultivo y lave el plato con PBS. Agregue dos mililitros de tripsina al 0,25% con EDTA al 0,02% en el plato y digiera las células a 37 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, añade cuatro mililitros de alfa-MEM con un 10% de FBS para detener la reacción.
Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de centrífuga de 15 mililitros y centrífugue a 800 RPM durante cinco minutos. Vuelva a suspender las células en 120 microlitros de PBS con 10% de FBS después de la centrifugación. Transfiera 100 microlitros de la suspensión celular a un nuevo tubo de microcentrífuga.
Bloquee las suspensiones celulares con un microlitro de anticuerpo contra CD16 a través de CD32 a cuatro grados Celsius durante 15 minutos, y tiña las células con anticuerpo conjugado PE contra CD45, anticuerpo conjugado FITC contra CD90 y anticuerpo APC contra CD29, a cuatro grados Celsius durante una hora en la oscuridad. Utilice los otros 20 microlitros de suspensión celular como control negativo sin teñir. Centrifugar los tubos a 800 RPM durante cinco minutos.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 0,5 mililitros de PBS con 10% de FBS. Añadir 10 microlitros de 0,01 miligramos por mililitro DAPI 10 minutos antes del análisis. Utilice filtros de 40 nanómetros colocados en tubos de centrífuga para filtrar las células, luego analice las células en un clasificador de células activado por fluorescencia.
En primer lugar, elimine las células muertas del recuento total de células mediante la activación de las células negativas para DAPI y, a continuación, para las células CD29 positivas, CD90 positivas y CD45 negativas, en las células seleccionadas como mBMSC objetivo. Recoja las mBMSC clasificadas en un tubo de centrífuga de 15 mililitros con cinco mililitros de alfa-MEM con 10% de FBS. Centrifugar los tubos a 800 rpm durante cinco minutos y retirar el tampón de recolección.
Agregue un mililitro de medio fresco para resuspender las células, luego colóquelas en una placa de cultivo de seis centímetros. Con este protocolo, una gran proporción de células se adhirieron a la placa al tercer día después del cultivo inicial. Después de tres o cuatro días adicionales de cultivo, la confluencia celular alcanzó el 70 al 80%La clasificación de células fluorescentes se utilizó para purificar las mBMSC, que representaron alrededor del 81,1% en las células P0.
Después de cultivar P2 mBMSCs en una placa de seis pocillos durante una semana, se observó una cantidad significativa de unidades formadoras de colonias. Para evaluar la capacidad de diferenciación de múltiples linajes de las mBMSC, se les indujo en linajes osteo-condro- y adipo-lineages. El aumento de la actividad de ALP, nódulos rojos calcificados bajo tinción con rojo de alizarina y el aumento de la expresión de genes osteogénicos específicos Runx2, Alp, Bsp y Ocn, indicaron inducción osteogénica.
Se utilizó la tinción de aceite-rojo-O para identificar la adipogénesis. Numerosas vacuolas ricas en lípidos fueron evidentes después de nueve días de inducción. Además, se incrementó la expresión de los genes específicos adipogénicos Ppar-gamma-1 y Cebpa.
Las muestras mostraron una tinción positiva para el azul alcián durante la observación microscópica de la diferenciación condrogénica. Además, la inmunotinción con anticuerpo anti-colágeno tipo II mostró una mayor acumulación de matriz de cartílago. Garantizar la viabilidad de los mBMSC es muy importante en este protocolo.
Este propósito se puede lograr eligiendo un animal de experimentación adecuado, operando en hielo y acortando el tiempo de experimentación. Utilizando este modelo in vitro, se puede obtener un alto número de BMSCs mandibulares proliferativas, lo que puede facilitar el estudio de las características biológicas, la reacción posterior al microambiente y otras aplicaciones de las BMSCs mandibulares.
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Descripción general
Este artículo presenta un método que combina la adhesión de médula ósea completa y la clasificación por citometría de flujo para aislar, cultivar, clasificar e identificar células madre mesenquimales de la médula ósea de mandíbulas de rata. Se considera que las CMMS de la mandíbula son un recurso preferido para el desarrollo de terapias para enfermedades craneofaciales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Investigación con Células Madre
- Biología Craneofacial
Antecedentes
- Los MSC de los huesos craneofaciales muestran capacidades superiores en comparación con los de otros huesos.
- Comprender la anatomía y el movimiento de la mandíbula de rata es fundamental para este protocolo.
- El método tiene como objetivo obtener eficientemente cantidades significativas de MSC mandibulares purificados.
- La literatura relacionada y los videos pueden mejorar la comprensión del procedimiento.
Objetivo del estudio
- Aislar y cultivar células madre mesenquimales de la médula ósea de mandíbulas de rata.
- Proporcionar un protocolo confiable para investigadores en terapéutica de enfermedades craneofaciales.
- Destacar las consideraciones anatómicas necesarias para un aislamiento exitoso.
Métodos Utilizados
- Técnica de adherencia de médula ósea completa.
- Ordenación por citometría de flujo para la purificación de células.
- Preparación de mandíbulas de rata tras la eutanasia.
- Técnicas de incisión para acceder a la mandíbula.
Resultados Principales
- Aislamiento exitoso de un número significativo de CMBM de la mandíbula.
- Demuestra la eficacia del método combinado.
- Información sobre la estructura anatómica que facilita el procedimiento.
- Aplicaciones potenciales en terapias para enfermedades craneofaciales.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un método eficiente para aislar CMBM.
- Comprender la anatomía es fundamental para una aplicación exitosa.
- Las CMBM mandibulares tienen potencial para futuros desarrollos terapéuticos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de células madre mesenquimales de alta pureza a partir de médula ósea craneofacial apoya la validación de dianas en medicina regenerativa al proporcionar una fuente celular biológicamente relevante con potencial de diferenciación superior. Este método permite la generación rápida de CMSC-mó de alta proliferación para estudios preclínicos, facilitando la reducción mecanicista de riesgos de candidatos terapéuticos craneofaciales. El acceso a células madre bien caracterizadas mejora la confianza predictiva en las primeras etapas del descubrimiento mediante la modelización de las respuestas del tejido humano en un sistema relevante para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de la biología de las células madre mesenquimales en un contexto específico de la región craneofacial para la comprobación de hipótesis específicas.
- Valor operativo: Proporciona una fuente reproducible de mBMSCs purificadas mediante separación por adherencia y clasificación activada por fluorescencia, garantizando entradas experimentales consistentes.
- Valor científico: Permite la validación funcional de la capacidad de autorrenovación mediante la diferenciación multilínea hacia vías osteogénica, adipogénica y condrogénica.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera mBMSCs estandarizados y controlados por pasaje, adecuados para el desarrollo de ensayos en cribado de citotoxicidad, migración o diferenciación.
- Valor operativo: Proporciona altos números celulares con una pureza superior al 80 % tras el ordenamiento en P0, lo que permite ensayos escalables basados en placas.
- Valor científico: Ofrece lecturas cuantificables tales como actividad de ALP, vacuolos lipídicos y tinción de matriz para cribado fenotípico específico de linaje.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Utiliza un sistema relevante para la enfermedad (hueso mandibular) para modelar la regeneración del tejido craneofacial y las interacciones con el microentorno.
- Valor operativo: Permite cultivos longitudinales (P2) para evaluar la capacidad formadora de colonias y el potencial proliferativo a largo plazo.
- Valor científico: Facilita estudios alineados con biomarcadores mediante marcadores superficiales validados (CD29+CD90+CD45−) para garantizar continuidad traslacional.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica, al proporcionar células con información mecanicista en cada etapa.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre el comportamiento del nicho de células madre y el compromiso de linaje mediante el uso de células primarias purificadas.
- Selección: Permite la preparación de ensayos mediante cultivos adherentes estandarizados con resultados de diferenciación cuantificables.
- Análisis: Ofrece cuantificación basada en citometría de flujo y lecturas de inmunofluorescencia para comparaciones objetivas entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la demostración de diferenciación tri-linaje relevante para la reparación de tejidos craneofaciales.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo de aislamiento reutilizable, aplicable a múltiples modelos de enfermedades craneofaciales y campañas de selección.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del objetivo al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías de reparación mediadas por células madre.
- Valor operativo: Estandariza el origen celular mediante pasos definidos de adherencia y clasificación, mejorando la reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de continuar/interrumpir al permitir la evaluación temprana de las respuestas celulares en un modelo fisiológicamente relevante.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos regenerativos craneofaciales mediante la funcionalidad validada de células madre.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en anatomía de roedores, lavado aséptico de médula ósea y clasificación celular activada por fluorescencia.
- Depende de equipos estériles para cultivo de tejidos, centrífugas, citómetro de flujo y microscopios invertidos para la validación.
- Necesita la estandarización de tiempos de digestión enzimática, protocolos de tinción con anticuerpos y estrategias de selección (gating) entre diferentes operadores.
- Implica consideraciones de adaptación al trasladar el método a otras fuentes óseas o especies debido a la variabilidad anatómica.
- Está limitado por la necesidad de tejido fresco y ventanas cortas de procesamiento posteriores a la eutanasia para mantener la viabilidad celular.
