Retraso en la administración intramiocardio de células madre después de la lesión por reperfusión de isquemia en un modelo murino
3 de septiembre de 2020
Células madre se investigan continuamente como tratamientos potenciales para individuos con daño miocárdico, sin embargo, su disminución de la viabilidad y retención dentro del tejido lesionado puede afectar su eficacia a largo plazo. En este manuscrito describimos un método alternativo para la entrega de células madre en un modelo murino de lesión por reperfusión de isquemia.
El daño isquémico induce un ambiente proinflamatorio hostil que afecta la supervivencia de las células trasplantadas. Nuestro protocolo presenta un método alternativo para proporcionar productos biológicos eludiendo la respuesta inmunitaria inicial a la lesión. La principal ventaja de este protocolo es que permite administrar terapias una semana después de la lesión, imitando el tratamiento en el entorno clínico.
Nuestro enfoque principal es el modelo de lesión por reperfusión de isquemia y el trasplante de células STEM. Sin embargo, este enfoque también se puede utilizar para modelos de enfermedad inflamatoria que implica la introducción de terapias biológicas. Comience por autoclavar todos los instrumentos quirúrgicos.
Si se van a realizar varias cirugías en una sesión, limpie los instrumentos después de cada animal y vuelva a esterilizarlos con un esterilizador de cuentas calientes. Administrar por vía subcutánea analgésico, pesar al animal e introducir el peso en el ventilador. Afeitar el lado izquierdo del pecho desde el esternón hasta el nivel del hombro y aplicar crema depilatoria para eliminar el exceso de piel.
Para prevenir el colapso pulmonar, mantenga la presión espiratoria final positiva en dos centímetros de agua para el procedimiento de reperfusión de isquemia y cámbielo a tres centímetros de agua para el procedimiento de inyección tardía de células. Después de anestesiar el ratón, intubarlo con un tubo endotraqueal de calibre 20 y transferirlo a una almohadilla de calentamiento controlada para mantener una temperatura corporal de 35 a 37 grados Celsius. Coloque el ratón en la reclinación lateral con el extremo craneal a la izquierda y el extremo caudal a la derecha.
Frote el área quirúrgica alternando entre yodo povidona y hisopos de alcohol tres veces y aplique pomada oftálmica en ambos ojos. Utilice un bisturí de hoja número 10 para hacer una incisión vertical de 2,5 milímetros a la derecha del pezón más a la izquierda en el campo de visión, luego use tijeras para cortar a través de las capas musculares superficiales hasta que el músculo intercostal y las costillas sean visibles. Mientras levanta las costillas y el tejido circundante, corte el espacio intercostal entre la cuarta y la quinta costillas, luego inserte el retractor del párpado en el espacio abierto.
Retirar el pericardio usando fórceps curvos, moviendo el pulmón hacia arriba y fuera de la vista. Pasar una sutura de nylon 9-0 a través del miocardio debajo de la arteria LAD 2,5 milímetros distal a la aurícula izquierda manteniendo un movimiento suave y consistente para evitar el desgarro del tejido o perforar un vaso sanguíneo importante. Ate un nudo cuadrado suelto, luego coloque un centímetro de tubo de polietileno dentro del nudo suelto.
Asegure la sutura alrededor del tubo y confirme la isquemia por palidez y arritmia ventricular, luego suéltela después de 35 minutos. Después de retirar el tubo, espere cinco minutos para confirmar la refusión del miocardio. Coloque un tubo de catéter IV de calibre 24 en la cavidad torácica un espacio intercostal a la derecha de la abertura.
Utilice 6-0 suturas absorbibles para cerrar la incisión intercostal en un patrón interrumpido simple y la capa muscular en un patrón de sutura continua. Después de cerrar la capa muscular superficial, retire el tubo torácico mientras retira el aire de la cavidad torácica con una jeringa de tuberculina de un mililitro. Cierre la incisión de la piel con una sutura absorbible 6-0 en un patrón de colchón horizontal continuo.
Cuando haya terminado, administre 1,5 mililitros de solución salina caliente por vía subcutánea y aplique un pomada triple de antibióticos en el lugar de la incisión para prevenir la infección. Transfiera el ratón a una jaula libre de ropa de cama o a una jaula con ropa de cama cubierta en una almohadilla caliente y una temperatura de 35 a 37 grados centígrados hasta que esté completamente recuperado. Después de preparar e intubar el ratón como se describió anteriormente, retire la sutura de la capa de la piel con tijeras y fórceps, luego use un bisturí número 10 para hacer una incisión en el mismo lugar que la cirugía anterior.
Continúe cortando el tejido cicatricial hasta que la sutura de la capa muscular sea visible, luego use las tijeras y fórceps para eliminar la sutura y cortar la capa muscular abierta. Retire las suturas que sostienen las costillas juntas y continúe cortando a través del músculo intercostal de la incisión anterior. Coloque el retractor del párpado en el espacio intercostal y localice el área de la ligadura anterior.
Cargue 300.000 células STEM mesenquimales suspendidas en 20 microlitros de PBS en una jeringa de insulina de calibre 30 y doble la aguja ligeramente para lograr el ángulo de inyección adecuado. Moviéndose en la dirección desde el ápice hacia la base del corazón, inserte la jeringa en la región del peri-infarto hasta que la abertura de la aguja esté completamente dentro del miocardio, luego inyecte lentamente las células en el miocardio, espere tres segundos y retire la aguja. Observe el corazón de cerca durante tres minutos para asegurarse de que no hay ninguna reacción anormal a las células como la fibrilación ventricular.
Después de tres minutos, coloque un tubo de catéter IV de calibre 24 en la cavidad torácica un espacio intercostal a la derecha de la abertura. Cierre el músculo intercostal y las capas de la piel y retire el tubo torácico como se describió anteriormente. Administrar 1,5 mililitros de solución salina caliente por vía subcutánea y aplicar un pomada triple de antibióticos en el lugar de la incisión para prevenir la infección.
Transfiera el ratón a una jaula o jaula libre de ropa de cama con ropa de cama cubierta en una almohadilla caliente hasta que esté completamente recuperado. El ecocardiograma postoperatorio y el electrocardiograma se realizaron el día en que se estaba realizando la implantación de células STEM, confirmando el infarto y la disminución de la función contráctil ventricular. Un examen adicional de los datos mostró que la fracción de eyección y el acortamiento fraccionado disminuyeron en ratones que recibieron lesiones isquémicas, mientras que los volúmenes diastólicos y sistólicos finales aumentaron.
La tinción tricromática de Masson del tejido miocárdico siete días después de la lesión mostró un aumento de la deposición de colágeno y adelgazamiento de la pared ventricular izquierda en corazones de ratones que recibieron lesiones isquémicas. La imagen bioluminiscente in vivo o BLI se realizó al día siguiente de la implantación de células STEM mesenquimales. La entrega exitosa de MSC se ejemplifica con la señal BLI en comparación con los ratones que habían inducido lesiones por reperfusión de isquemia pero no recibieron MSC.
Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que los pequeños movimientos intencionales al cortar a través de los intercostales, ligar el vaso, y las células de inyección son vitales para prevenir daños indebidos en el corazón o el pulmón en el campo de visión. Estos procedimientos ofrecen la capacidad de monitorear la función cardíaca después del trasplante a través de ultrasonido, viabilidad celular a través de imágenes de bioluminiscencia, o otras técnicas moleculares o bioquímicas dependiendo de la terapia utilizada.
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Resumen
Este estudio presenta un método innovador para la administración de células madre en un modelo murino de lesión por isquemia-reperfusión. El enfoque tiene como objetivo mejorar la viabilidad y retención de las células madre en el miocardio dañado, lo que podría mejorar los resultados del tratamiento.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Terapia con células madre
- Lesión cardiovascular
- Lesión por isquemia-reperfusión
Antecedentes
- Las células madre están siendo investigadas para el tratamiento del daño miocárdico.
- La viabilidad y retención de las células madre en el tejido lesionado son fundamentales para la eficacia.
- El daño isquémico crea un entorno proinflamatorio que afecta la supervivencia celular.
- Los métodos actuales podrían no abordar eficazmente la respuesta inmunitaria tras la lesión.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para administrar células madre después de la respuesta inmunitaria inicial.
- Imitar las cronologías de tratamiento clínico permitiendo la administración de células una semana después de la lesión.
- Evaluar la eficacia de este método en un modelo murino.
Métodos Utilizados
- Modelo murino de lesión por isquemia-reperfusión.
- Administración de células madre mesenquimales en el miocardio.
- Monitoreo de la función cardíaca postoperatoria mediante ecocardiograma.
- Análisis histológico del tejido miocárdico para la deposición de colágeno.
Resultados principales
- Los ecocardiogramas postoperatorios confirmaron una disminución de la función contráctil ventricular.
- Se observó un aumento del depósito de colágeno en el tejido miocárdico tras la lesión.
- La inyección de células madre se realizó con éxito sin reacciones adversas inmediatas.
- Los datos indicaron un potencial para mejorar los resultados en la reparación miocárdica.
Conclusiones
- El método propuesto para la administración de células madre podría mejorar la eficacia del tratamiento.
- El momento de la administración es crucial para superar la respuesta inmunitaria.
- Se necesitan más estudios para evaluar los resultados a largo plazo y los mecanismos involucrados.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La administración diferida de células madre aborda una brecha traslacional clave al imitar los cronogramas de tratamiento clínicos, en los que las terapias se administran tras la fase inflamatoria aguda. Este enfoque mejora el valor predictivo de los modelos preclínicos al aumentar la viabilidad y retención de células madre en el miocardio lesionado. Asimismo, facilita la reducción mecanicista de riesgos en la medicina regenerativa cardiovascular al aislar el efecto terapéutico de los factores de confusión inmunitarios tempranos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas con células madre en un sistema relevante para la enfermedad que refleja escenarios de infarto subagudo.
- Valor operativo: Reduce la variabilidad en estudios de injerto al evitar factores de confusión proinflamatorios tempranos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona una plataforma estandarizada para cuantificar la retención y viabilidad de células madre mediante imágenes bioluminiscentes.
- Valor operativo: Facilita la reproducibilidad del ensayo mediante parámetros quirúrgicos y de administración celular consistentes.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al modelar la intervención terapéutica diferida en la lesión por isquemia-reperfusión.
- Valor operativo: Permite el seguimiento longitudinal del injerto y de los resultados funcionales mediante ecografía e imágenes moleculares.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método sitúa la administración diferida de células madre como un puente entre el descubrimiento temprano y las pruebas de eficacia preclínica, particularmente para terapias regenerativas cardiovasculares.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al permitir la evaluación de mecanismos de células madre en un entorno de infarto estabilizado.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas basadas en imágenes para evaluar la retención y viabilidad celular a lo largo del tiempo.
- Análisis: Genera datos longitudinales de imágenes bioluminiscentes y funcionales para comparar condiciones terapéuticas.
- Investigación Traducional: Se alinea con las cronologías clínicas para la administración de células madre tras una lesión miocárdica, aumentando la confianza predictiva.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma quirúrgica reutilizable para la administración diferida de tratamientos biológicos en modelos de enfermedades isquémicas e inflamatorias.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la validación de objetivos al reducir el ruido procedente de respuestas inmunitarias agudas en estudios de injerto de células madre.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante un flujo de trabajo estandarizado de dos procedimientos y una ventana definida de administración celular.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o no continuar al proporcionar datos de eficacia más relevantes desde el punto de vista clínico.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo de candidatos a células madre al mejorar la confianza predictiva en modelos preclínicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía cardíaca en modelos murinos y en la modelización de isquemia-reperfusión.
- Depende de infraestructura de imagen para el monitoreo mediante ultrasonido y bioluminiscencia.
- Necesita protocolos estandarizados de preparación y dosificación celular en todos los centros del estudio.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tipos de células madre y modelos de enfermedad.
- Limitado por la escalabilidad del modelo murino y las respuestas inmunitarias específicas de la especie.
