Name: Taurocolato de sodio inducido pancreatitis aguda grave en ratones C57BL/6 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Aprende a inducir pancreatitis aguda biliar grave en ratones C57BL/6 mediante infusión retrógrada de taurocolato de sodio. Este protocolo reproducible permite estudiar eventos inflamatorios tempranos y evaluar respuestas farmacológicas en tejido pancreático.

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Los autores agradecen el Programa de Postgrado en Clínica Médica de la Universidad de São Paulo; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) y Facultad de Medicina de la Universidad de São Paulo (FMUSP).

Este protocolo fue aprobado por el Comité de Ética para el uso de animales de la Facultad de Medicina de la USP, Num. Proyecto: 1343/2019-CEUA: FMUSP. Para este protocolo se utilizaron ratones C57BL/6, de 6 semanas de edad, con un peso de 20 ± 2 g (n = 9/grupo).
1. Laparotomía
<ol><li>Anestesiar a los animales con xilazina (10 mg/kg) y solución de ketamina (80 mg/kg), por vía subcutánea (0,1 ml/10 g de peso corporal) utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja de 13x0,45 mm 26G 1/2. Compruebe si hay suficiente profundidad de anestesia pellizcando el dedo del pie. Controle la temperatura corporal con almohadillas térmicas. Asegúrese de que todos los materiales quirúrgicos sean estériles.</li>
	<li>Limpie el área abdominal con una solución de povidona yodada al 5% y use un recortador para eliminar el vello entre el pecho y la parte inferior del abdomen (aproximadamente 2 cm2). Limpie el área quirúrgica con alcohol al 70%.</li>
	<li>Inmovilizar al animal en el tablero quirúrgico usando cinta quirúrgica. Use tijeras para cortar 5 mm de la piel horizontalmente, en la parte superior del abdomen y 1 cm por debajo del proceso xifoide. Repita el corte en el peritoneo. Esto dará como resultado una laparotomía con una exposición mínima de la cavidad.</li>
</ol>2. Localizar y exponer el páncreas
<ol><li>Con la ayuda de un retractor, tire del hígado hacia la cabeza del ratón, ~ 1 cm del intestino.</li>
	<li>Localice la región del páncreas a la que se le inyectará taurocolato de sodio (cabeza del páncreas). Ubique el duodeno con referencia al hígado, debajo del hígado, en el lado derecho (a la izquierda como se ve el ratón). El duodeno es la primera parte del intestino delgado y está conectado a la porción final del estómago.</li>
	<li>Con la ayuda de fórceps, levante el hígado hacia la cabeza del animal y tire suavemente de la porción del intestino delgado. Fije los dos extremos laterales del intestino delgado con una sutura de polipropileno 6-0 para ver mejor la porción distal del conducto biliar común.</li>
</ol>3. Inducción de pancreatitis aguda grave
<ol><li>Ocluya temporalmente el conducto biliar común proximal con un clip de microvasos para evitar que la infusión retrógrada se filtre en el hígado. El conducto biliar común se puede ver en el lado hepático del duodeno y su unión con el duodeno aparecerá blanca. Exponga el órgano fuera de la cavidad abdominal.</li>
	<li>Punción de la región periampular (parte blanquecina de la pared del intestino delgado) para acceder al conducto biliar común con una aguja de 0,4 mm conectada a un tubo de polietileno de 0,54 mm.</li>
	<li>Hacer una oclusión temporal del conducto biliar común distal con 8-0 sutura para evitar que la solución de taurocolato de sodio se filtre en el duodeno.</li>
	<li>Inicie la bomba de perfusión y programe una infusión de solución de taurocolato de sodio al 2,5% (diluida en solución salina al 0,9%) a una velocidad constante de 10 μL/10 g de peso corporal durante 3 min.</li>
	<li>Después de la infusión, retire el clip de microvaso, el temporal 8-0 sutura y la aguja de inyección del conducto pancreático biliar para reconstituir el flujo fisiológico de la bilis.</li>
	<li>Al final, suture el abdomen con 6-0 sutura de polipropileno monofilamento no absorbente. El tiempo entre la laparotomía y la sutura final debe ser de un máximo de 30 min (ver Figura 1).</li>
	<li>Después de la cirugía, aloje a los animales en cajas de polietileno forradas con virutas de madera y agua y alimentos ad libitum.</li>
	<li>Trate a los ratones de control de la misma manera que a los ratones experimentales, pero asegúrese de que la infusión consista solo en solución salina. Realizar el procedimiento quirúrgico y la infusión de solución salina (10 ml/min, durante 3 min) en un grupo control (SHAM) para eliminar el sesgo inflamatorio causado por la cirugía y la canulación.</li>
	<li>Use tramadol 12,5 mg/kg por vía subcutánea cada 8 horas, comenzando después de la recuperación postquirúrgica.</li>
</ol>4. Métodos de análisis
<ol><li>A las 12 h después de la inducción de AP, anestesiar a los animales con xilazina (10 mg/kg) y ketamina (80 mg/kg) para recolectar aproximadamente 250 μL de sangre a través del plexo orbitario.<ol>
<li>Sostenga suavemente la piel en la espalda, promoviendo una ligera protuberancia del globo ocular, y colóquelo con el ojo hacia arriba.</li>
		<li>Inculque una gota de ungüento para los ojos que contenga anestésico local en el ojo del animal.</li>
		<li>Coloque el extremo del tubo capilar en la esquina medial del ojo e insértelo suavemente debajo del globo ocular, con un ángulo de ~ 30 ° -45 °. Gire el tubo capilar hasta que comience el flujo sanguíneo. Recuerde que no es necesario usar la fuerza para el procedimiento.</li>
		<li>Una vez finalizada la recolección, asegure la homeostasis manteniendo los párpados cerrados por compresión ligera con la gasa. Deseche el tubo capilar en el contenedor de objetos punzantes19.</li>
		<li>Centrifugar el suero (700 x g, 15 min) y almacenar el sobrenadante para la dosis de amilasa e IL-6 (pasos 4.7 y 4.8).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sacrificar ratones por asfixia de CO2 .</li>
	<li>Use una aguja de 27 G para inyectar 4 ml de 1x PBS helado en la cavidad peritoneal. Tensar la piel abdominal y asegurarse de que la aguja se empuja lentamente en el peritoneo para no perforar ningún órgano. Después de la inyección, masajee suavemente el peritoneo durante 10 s para eliminar las células adheridas al peritoneo.</li>
	<li>Usando tijeras y pinzas, haga un pequeño corte (0,5 cm) en la piel interna y la musculatura para exponer la cavidad abdominal. Inserte una pipeta de bulbo en el peritoneo y recoja el líquido. Tenga cuidado de no aspirar tejido graso u otros órganos.</li>
	<li>Recolecte la mayor cantidad de líquido posible y deposite la suspensión celular recolectada en tubos mantenidos en hielo. Deseche la pipeta de la bombilla en el contenedor de objetos punzantes20. Centrifugar el líquido peritoneal (250 x g, 5 min) y almacenar el sobrenadante para la dosificación de IL-6 (paso 4.9).</li>
	<li>Recoger la región del páncreas adyacente al duodeno (<5 mm).</li>
	<li>Procesa el páncreas fijando en formalina al 10% e incorpóralo a la parafina.<ol>
<li>Tiñe los portaobjetos con hematoxilina y eosina para análisis histopatológicos bajo microscopía de luz. Utilice el protocolo de Schmidt21 (edema pancreático, célula acinar, lesión/necrosis, inflamación pancreática) para evaluar la extensión de la PA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mida la amilasa (U/dL) utilizando kits disponibles comercialmente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.</li>
	<li>Mida IL-6 mediante ensayos Luminex utilizando kits comerciales de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.</li>
	<li>Guarde el suero y el sobrenadante de líquido peritoneal obtenidos en los pasos 4.1 y 4.4 en un congelador a -80 °C si es necesario.</li>
</ol>

<ol><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+different+clinical+features+between+hypertriglyceridemia+and+biliary+acute+pancreatitis%3A+A+retrospective+study+of+730+patients+from+a+tertiary+center%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Significantly different clinical features between hypertriglyceridemia and biliary acute pancreatitis: A retrospective study of 730 patients from a tertiary center.</a> BMC Gastroenterology. 18 (1), 1-8 (2018).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método de inducción de la pancreatitis aguda por infusión retrógrada de taurocolato de sodio ya se ha demostrado en ratas22,23,24. Tres trabajos similares, publicados en 2008, 2010 y 2015, sirvieron de referencia para el protocolo3,14,15. En este trabajo, enumeramos todos los pasos críticos para reproducir este método en ratones C57B...

En humanos, la presencia de cálculos biliares es la causa más frecuente de pancreatitis debido a la obstrucción de la porción terminal del coledocal, interrumpiendo el flujo de secreciones pancreáticas y provocando un intenso proceso inflamatorio en el páncreas, con un aumento de la concentración de enzimas digestivas en el suero y mediadores inflamatorios1,2.
Se han propuesto dos teorías diferentes para explicar el desarrollo de la pancreatitis aguda (PA). La teoría del "canal común" sugiere que los cálculos presentes en la vesícula biliar obstruyen el sistema de conductos biliares comunes distales, permitiendo que la secreción biliar fluya retrógrada hacia el conducto pancreático. La segunda teoría (la teoría de la "obstrucción del conducto") sugiere que la obstrucción del conducto pancreático por exceso de cálculos biliares provoca un bloqueo en el flujo de secreción pancreática al duodeno, causando hipertensión ductal3. Aunque los mecanismos que conducen a la pancreatitis biliar aguda no se comprenden completamente, el resultado es un proceso inflamatorio intenso. La erupción enzimática digestiva y la autodigestión del páncreas conducen a cambios histopatológicos, un aumento de las citoquinas inflamatorias (IL-1β, IL-6, TNF-α) en el líquido ascítico y el suero, y un aumento de las proteínas de fase aguda4,5,6.
La pancreatitis aguda grave es una afección que merece atención clínica debido a la afectación de múltiples órganos y a un alto riesgo de mortalidad. Los modelos animales para la reproducción de la pancreatitis aguda (PA) son importantes ya que explican los mecanismos fisiopatológicos de la enfermedad y ayudan a monitorear la evolución de los eventos inflamatorios, a partir de las etapas iniciales de la enfermedad. Esto generalmente no es posible en las clínicas2,7. Además, el acceso a los tejidos pancreáticos es fácil en estudios preclínicos, favoreciendo la elucidación de los cambios vinculados a las condiciones clínicas8 junto con la posibilidad de trabajar con especies isogénicas, eliminando variables indeseables y reflejando la similitud clínica con los resultados observados en la condición humana9.
Los modelos biliares y no biliares para la inducción de pancreatitis aguda en especies de ratas y ratones se han estudiado con frecuencia en la literatura científica. Los métodos no biliares de inducción incluyen la administración de dosis estimulantes supramáximas del secretagogo colecistoquinina o su análogo ceruleína10; administración de dosis casi letales de L-arginina; o la administración de una dieta deficiente en colina suplementada con etionina11. Aunque estos métodos son fáciles de reproducir y dan lugar a la inflamación pancreática, no replican los mecanismos que en teoría desencadenan la PA (es decir, el reflujo de la secreción biliar en el conducto pancreático). La técnica que aborda el modelo biliar se basa en la infusión retrógrada de ácidos biliares en el conducto pancreático y requiere de investigadores bien formados para llevar a cabo este protocolo. Se han publicado varios estudios utilizando este método en ratas (aparentemente por razones técnicas ya que estos experimentos implican procedimientos quirúrgicos)12,13. Sin embargo, el abordaje en ratones puede ofrecer resultados más interesantes en el estudio de la inflamación3,14,15. En este estudio, mostraremos una lista de verificación de los pasos a seguir para la reproducción de la pancreatitis aguda grave por infusión de taurocolato de sodio en ratones anestesiados C57BL/6.
Para trabajos que impliquen la necesidad de experimentos con anticuerpos y análisis de la expresión génica y proteica, es preferible el uso de ratones por el mayor arsenal de materiales para estos animales y la posibilidad de trabajar con especies isogénicas y knockout, entre otras que pueden ser utilizadas relevantes para estudios16. Ratones C57BL/6 es una cepa endogámica de ratones desarrollada originalmente para el estudio de la actividad antitumoral y la inmunología. Esta cepa está siendo cada vez más preferida por los investigadores por ser isogénica, lo que permite una mayor reproducibilidad de los resultados, lo que puede implicar el uso de un menor número de animales en un experimento y una menor variabilidad de resultados entre un mismo grupo17,18.
Perides et al. (2010)14 publicaron un protocolo para la inducción de AP en ratones por infusión de taurocolato de sodio. Aquí actualizamos este modelo utilizando una mayor concentración de taurocolato de sodio (2,5%) en ratones C57BL/6, con un volumen y velocidad de infusión definidos (Figura 1). El nivel máximo de gravedad se alcanza dentro de las 12 h de la inducción en ratones. La elevación de la concentración de IL-6 tanto en el suero como en la cavidad peritoneal se correlaciona con la progresión de la PA. Con la práctica, el tiempo total estimado desde la inducción de la anestesia hasta la finalización de la infusión, es de 25 min por animal. Es esencial que un investigador capacitado realice este experimento. Para asegurarse de que la solución se inyecta correctamente en el conducto biliar común, realice varias sesiones de entrenamiento piloto utilizando azul de metileno en lugar de taurocolato de sodio.

<table><tbody><tr><td>aguja de 0,4 mm</td><td>INTRAG MEDICAL TECH</td><td></td> 90183210 <td>30G</td></tr><tr><td>&nbsp; Tubo de polietileno de 0,54 mm</td><td>Tygon</td><td>730010-Bloque</td> <td>de</td></tr> <tr><td>espuma de poliestireno</td><td>-</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>cinta de enmascarar para montar el ratón</td><td>Missner</td><td>1236-Bomba</td> <td>de</td></tr> <tr><td>infusión programada para 10&micro; L/min.</td><td>Havard aparatus-Bomba peristáltica serie</td><td>MA1 55-7766</td><td>&nbsp; Modelo 66 Tijeras y</td></tr><tr><td>pinzas</td><td></td><td></td><td></td></tr> peristálticas <tr><td>pequeñas Providina yodada antiséptica Pfizer</td><td></td><td>12086OR</td><td>antisepsia</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>SIGMA</td><td>459836</td><td>Mix 700 mL 100% etanol con 300 mL dH2O</td></tr><tr><td>Cuchilla de afeitar</td><td>Lord</td><td>bdk9a1ghk6</td><td>Para tricotomía</td></tr><tr><td>Taurocolato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86339- 1G</td><td>NÚMERO CAS- 345909-26-4</td></tr><tr><td>pinza para microvasos</td><td>Medicon Surgical</td><td>56.87.35</td><td>Aproximador, apertura 4,0 mm, presión de cierre 30 -&nbsp; 40 g</td></tr><tr><td>6-0 prolene</td><td>Bioline</td><td>5162</td><td>Línea de sutura</td></tr><tr><td>Ketamin NP (cloridrato de dextrocetamina) 50mg/mL</td><td>Crist&aacute; lia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilazine 2%</td><td>Syntec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina estéril (0,9% (wt/vol) solución salina)</td><td>Farmace</td><td>105851</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metilo</td><td>Sigma-Aldrich Chemicals</td><td>M5528</td><td></td></tr><tr><td>MILLIPLEX&nbsp; MAPA&nbsp; Panel de perlas magnéticas de citocinas/quimiocinas de ratón - Ensayo multiplexado de inmunología</td><td>MERCK</td><td>MCYTOMAG-70K</td><td>Analice simultáneamente múltiples biomarcadores de citocinas y quimiocinas con ensayos Multiplex basados en perlas utilizando la tecnología Luminex, en muestras de suero, plasma y cultivos celulares de ratón.</td></tr><tr><td>Ensayo de amilasa</td><td>Labtest</td><td>11</td><td></td></tr><tr><td>Retractor Desmarres 13-mm ancho</td><td>ROBOZ</td><td>RS-6672</td><td></td></tr></tbody></table>

taurocolato de sodio inducido pancreatitis aguda grave en ratones c57bl/6

Sodium Taurocholate Induced Severe Acute Pancreatitis in C57BL/6 Mice

La inducción de la pancreatitis aguda biliar por infusión de taurocolato de sodio ha sido ampliamente utilizada por la comunidad científica debido a la representación de la condición clínica humana y la reproducción de eventos inflamatorios correspondientes a la aparición de pancreatitis biliar clínica. La gravedad del daño pancreático se puede evaluar midiendo la concentración, la velocidad y el volumen del ácido biliar infundido. Este estudio proporciona una lista de verificación actualizada de los materiales y métodos utilizados en la reproducción del protocolo y muestra los principales resultados de este modelo de pancreatitis aguda (AP). La mayoría de las publicaciones anteriores se han limitado a reproducir este modelo en ratas. Hemos aplicado este método en ratones, lo que proporciona ventajas adicionales (es decir, la disponibilidad de un arsenal de reactivos y anticuerpos para estos animales junto con la posibilidad de trabajar con cepas de ratones modificadas genéticamente) que pueden ser relevantes para el estudio. Para la inducción de pancreatitis aguda en ratones, presentamos un protocolo sistemático, con una dosis definida de taurocolato de sodio al 2,5% a una velocidad de infusión de 10 μL/min durante 3 min en ratones C57BL/6 que alcanza su nivel máximo de gravedad dentro de las 12 h de la inducción y destaca los resultados con resultados que validan el método. Con la práctica y la técnica, el tiempo total estimado, desde la inducción de la anestesia hasta la finalización de la infusión, es de 25 min por animal.

La gravedad de la pancreatitis se puntuó entre 0-3 según la escala de Schmidt21 donde cero corresponde a la ausencia, 1 corresponde a una presencia leve (&lt;25%), 2 corresponde a una presencia moderada (entre 25 y 50%) y 3 corresponde a una presencia intensa (&gt; 50%) (Tabla 1). Las mediciones realizadas fueron actividad plasmática de la amilasa, edema pancreático, célula acinar, lesión/necrosis, inflamación pancreática (por análisis histológico ...

Los modelos animales para la pancreatitis aguda grave permiten el estudio de los cambios fisiopatológicos en la etapa inicial, facilitando la observación de la evolución de los eventos inflamatorios. Aquí proporcionamos un protocolo para la inducción de pancreatitis biliar aguda grave por infusión retrógrada de taurocolato de sodio en el conducto pancreático de ratones C57BL/ 6 anestesiados.

Taurocolato de sodio inducido pancreatitis aguda grave en ratones C57BL/6

Biliary acute pancreatitis induction by sodium taurocholate infusion has been widely used by the scientific community due to the representation of the ...

Este método se puede utilizar para reproducir los eventos inflamatorios que ocurren en la pancreatitis biliar aguda. Es posible estudiar los cambios en el tejido pancreático en sus primeras etapas, lo que generalmente no es posible en la clínica. Las principales ventajas de esta técnica son que es rápida y fácil de reproducir para un investigador capacitado, y ofrece resultados similares a la pancreatitis aguda en humanos.El método se puede utilizar para estudiar las respuestas inmunes farmacológicas de las moléculas de fármacos y otras intervenciones terapéuticas, ya que permite el estudio de las células mediadoras inflamatorias en el páncreas y los órganos adyacentes. Al intentar este protocolo, la localización de los órganos y el establecimiento de la región de canulación es crucial. Memorice la ubicación de los órganos y ejerza la aplicación de inyección primero utilizando una solución de color como el azul de metileno.Después de verificar la profundidad de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie, limpie el área abdominal de un ratón anestesiado con una solución de yodo de povidona al 5%. Con un recortador, retire el vello entre el pecho y la parte inferior del abdomen

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Este video describe el procedimiento para la generación de un modelo de ratón con pancreatitis biliar aguda mediante infusión pancreática de taurocolato de sodio. Este modelo ayuda a estudiar los cambios fisiopatológicos inducidos por el taurocolato de sodio en el páncreas.

Modelo de pancreatitis biliar aguda: un método para generar un modelo de ratón de pancreatitis biliar aguda mediante infusión de conducto pancreático

La pancreatitis crónica (PC) es una enfermedad caracterizada por inflamación y fibrosis del páncreas, a menudo asociada con dolor abdominal intratable. Este artículo se centra en refinar la técnica para generar un modelo de ratón de CP mediante infusión de conductos biliares con ácido sulfónico trinitrobenceno 2,4,6 (TNBS).

Un modelo de ratón para la pancreatitis crónica a través de la infusión de TNBS del conducto biliar

Aquí se describe un modelo de ratón de pancreatitis aguda grave. El procedimiento presentado aquí es muy rápido, simple y accesible, lo que potencialmente permite el estudio de los mecanismos moleculares y las diferentes intervenciones terapéuticas en la pancreatitis aguda de una manera conveniente.

Establecimiento de un modelo de pancreatitis aguda grave en ratones mediante inyección retrógrada de taurocolato de sodio en el conducto biliopancreático

La administración intraperitoneal de fármacos es un enfoque no invasivo seguro y eficaz para inducir la lesión pancreática. Este estudio comparó cinco protocolos distintos de inyección intraperitoneal en ratones para inducir diversos grados de lesión pancreática y estableció un modelo de lesión pancreática grave para investigar los cambios patológicos y las estrategias de tratamiento para la pancreatitis aguda grave (PAS).

Preparación de un modelo de pancreatitis aguda grave en ratones mediante una combinación de caeruleina e inyección intraperitoneal de lipopolisacáridos

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Un modelo murino de lesión pulmonar inducida por ventilador es una herramienta importante para el estudio de una lesión pulmonar...

La presión de la ventilación controlada para inducir la lesión pulmonar aguda en ratones

Se describen modelos de lesión renal por isquemia-reperfusión inducida moderada y grave en la que los ratones se someten a pedículo renal unilateral de sujeción seguida de simultánea o en diferido nefrectomía contralateral, respectivamente. Estos modelos dan consistentemente lugar a la disfunción renal y la fibrosis después de la lesión, pero gravedad de la lesión y la supervivencia dependen de equipos de fondo, la edad y quirúrgicos ratón.

La isquemia-reperfusión modelo de lesión renal aguda y post lesión fibrosis en ratones

Trauma cerebral aguda es una lesión grave que no tiene un tratamiento adecuado hasta la fecha. Multiphoton microscopía permite estudiar longitudinalmente el proceso de desarrollo trauma cerebral agudo y en la exploración de estrategias terapéuticas en los roedores. Dos modelos de trauma cerebral agudo estudiado con imágenes in vivo de dos fotones de cerebro se demuestran en este protocolo.

Trauma cerebral aguda en ratones seguido de Longitudinal dos fotones de imágenes

La transferencia de linfocitos bm12 a un receptor C57BL/6 es un modelo establecido de lupus eritematoso sistémico. Aquí describimos cómo iniciar la enfermedad utilizando este modelo y cómo caracterizar las células T foliculares auxiliares, las células B del centro germinal y las células plasmáticas mediante citometría de flujo.

El inducible Modelo BM12 del lupus eritematoso sistémico (LES) en ratones C57BL / 6 ratones

Murino colostomía distal proporciona un modelo murino para la colitis de la diversión humana, una colitis linfocítica predominante en el segmento de colon excluido de la corriente fecal.

Murino colostomía Distal, un modelo novedoso de desvío Colitis en ratones C57BL/6

Aprende a inducir pancreatitis aguda biliar grave en ratones C57BL/6 mediante infusión retrógrada de taurocolato de sodio. Este protocolo reproducible permite estudiar eventos inflamatorios tempranos y evaluar respuestas farmacológicas en tejido pancreático.

Taurocolato de sodio inducido pancreatitis aguda grave en ratones C57BL/6

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