Name: Medición dinámica e imagen de capilares, arterias y pericitos en el corazón del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprende a medir la microcirculación coronaria en tejido cardíaco murino ex vivo mediante monitoreo de presión y flujo arterial. Este método permite evaluar la función de pericitos y la dinámica vascular en condiciones controladas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado en parte por el Centro de Ingeniería y Tecnología Biomédica (BioMET); NIH (1U01HL116321) y (1R01HL142290) y la Asociación Americana del Corazón 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).

Todo el cuidado de los animales fue de acuerdo con las directrices de la Universidad de Maryland Baltimore y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales aprobó protocolos.
1. Preparación de las soluciones
NOTA: Preparar soluciones con antelación. Dos tipos de soluciones básicas se utilizan en los experimentos: (1) soluciones salinas fisiológicas (PSS) para superfusato de baño y (2) soluciones de Tirorode para perfusato de lúmenes. Se necesita un burbujeo continuo con CO2 para mantener el pH de PSS. La solución de Tyrode amortiguada por HEPES se utiliza en el lúmenes en lugar de PSS para evitar que las burbujas entren en los recipientes, ya que las burbujas dañarían las células endoteliales7 y ocluirían el flujo.
<ol><li>Solución PSS: Consulte la fórmula y composición de la solución PSS en la Tabla 1. Haga 10 L de solución de stock PSS sin ca2+y sin glucosa y almacene a temperatura ambiente. 1 h antes de cualquier procedimiento, sacar 1 L de la solución de stock y burbuja con 5% CO2 (74% N2 y 21% O2)para mantener el pH de la solución en ~ 7.4. Añadir 1,8 g de glucosa y 1,8 mL CaCl2 (1 M stock)8. NOTA: Añadir Ca2 + sólo después de burbujear cuando el pH es ~ 7.4, de lo contrario, Ca2 + se precipitará.</li>
	<li>Solución de Tyrode: Véase la fórmula y composición de la solución del Tirol en la Tabla 1. Filtre la solución (0,22 μm) y almacene a 4 °C para su uso futuro9.</li>
	<li>Solución de Tyrode con BDM (monoxime 2,3-Butanedione): Añadir BDM como inhibidor de miofilación reversible para prevenir la contracción de los micocitos10. Pesar 600 mg BDM y añadir a 200 mL de solución de Tirorode. Revuelva la solución con BDM hasta que se disuelva por completo. No se requiere más filtración.</li>
	<li>Almacene la solución del Tyrode que contiene BDM a 4 °C para su uso futuro.</li>
</ol>2. Preparación de la cámara
<ol><li>Cubra tanto la cámara de disección como la cámara experimental de antemano con polidimetillesiloxano (PDMS) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante.</li>
	<li>Llene la cámara de disección con la solución del Tyrode que contiene BDM.</li>
	<li>Encienda el enfriador 1 h antes del procedimiento. Ajuste la temperatura a 4 °C.</li>
</ol>3. Preparación de la cánula
<ol><li>Encienda el tirador de micropipette. Seleccione la configuración según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Tome un tubo de vidrio borosilicato limpio (el diámetro exterior e interior de los tubos de vidrio utilizados fue de 1,2 mm y 0,69 mm respectivamente).</li>
	<li>Inserte un tubo de vidrio en las abrazaderas ranuradas de un tirador de pipeta Sutter con un filamento de calentamiento de platino en forma de U.</li>
	<li>Active el tirador para producir dos cánulas, cada una con una punta delgada larga.</li>
	<li>Corte la punta de cada cánula usando un par fino de tijeras bajo un microscopio diseccionador para hacer el diámetro final de la punta alrededor de 100 a 150 μm.</li>
	<li>El fuego pule la punta de la cánula cortada para redondear ligeramente los bordes afilados.</li>
	<li>Doble la cánula a lo largo del eje utilizando un cable de platino (calentado con control fino) colocado en el lado del eje aproximadamente 2 mm de la punta. El ángulo de la curva en la cánula debe ser de alrededor de 45°.</li>
	<li>Inserte el extremo abierto de la cánula en el soporte de la cámara de miógrafo de presión y apriete el accesorio. Conecte una jeringa de 5 ml llena de la solución de Tyrode al otro lado del accesorio. Conecte la cánula a un micromanipulador montado en la cámara (consulte la Figura 1 y la Figura 2).</li>
	<li>Llene la cánula con la solución de Tyrode utilizando la jeringa (5 ml), enjuagando, el tubo y el conector de burbujas de aire.</li>
	<li>Antes del procedimiento de canulación, mida la presión de perfusión dentro de la cánula sobre un rango de flujo determinado (50 a 300 μL/min, Figura 3). Hazlo solo cuando se utilice una nueva cánula. NOTA: La presión de perfusión dentro de la cánula es proporcional al flujo y está instalada linealmente (Figura 3).</li>
</ol>4. Extracción del corazón del ratón
<ol><li>Ponga un ratón C57BL/6 (cualquiera de los dos sexos, de 8 a 16 semanas de edad) en la caja de anestesia que está conectada a los tanques de isoflurano y oxígeno.</li>
	<li>Encienda el tanque de oxígeno e inicie el flujo de isofluranos. Espere ~5 minutos hasta que el ratón esté completamente anestesiado.</li>
	<li>Una vez establecida la anestesia, saque el ratón de la caja de anestesia e inyecte heparina IP (en la cavidad peritoneal, 360 unidades, 0,5 ml/ratón) para evitar la formación de coágulos sanguíneos en la vasculatura. A continuación, vuelva a colocar el ratón en la caja de anestesia.</li>
	<li>10 minutos después de inyectar la heparina, mueva el ratón a la cama calentada en posición supina y estabilice sus patas usando cinta adhesiva. Mantenga el ratón bajo anestesia completa con isoflurano usando un cono nasal.</li>
	<li>Levante la piel abdominal del ratón por encima del diafragma con fórceps y use tijeras quirúrgicas para cortar y exponer el diafragma.</li>
	<li>Corta el diafragma y el esternón. Abre el pecho.</li>
	<li>Disecciona el corazón de la cavidad torácica, cortando lo más cerca posible de la pared torácica dorsal.</li>
	<li>Coloque el corazón en la solución de Tyrode helada que contenga BDM de 30 mM.</li>
	<li>Limpie el corazón para extraer los tejidos conectivos como el pulmón.</li>
	<li>Transfiera el corazón a la cámara de disección preenfriada llena con la solución de Tyrode que contiene BDM de 30 mM.</li>
</ol>5. Preparación y canulación de arteria septal
<ol><li>Encienda la bomba servo. Ajuste la bomba servo al modo de "flujo". Deje que funcione a alta velocidad hasta que el tubo esté lleno de la solución del Tyrode que se utilizará para perfundir el lúmenes vasculares. Asegúrese de que no haya burbujas en el tubo. A continuación, baje la velocidad.</li>
	<li>Ancle el corazón sobre el PDMS, evitando cualquier daño a la zona media del corazón.</li>
	<li>Retire las adriículas derecha e izquierda. Abra el ventrículo derecho y retire la pared libre ventricular derecha con un microscopio diseccionador.</li>
	<li>Exponer e identificar la arteria septal. Coloque un hilo de nylon (30 μm de diámetro) debajo de la arteria septal y ate un nudo suelto para su uso futuro. NOTA: La arteria septal se puede identificar fácilmente mediante un microscopio diseccionador. La arteria septal es una arteria importante en el tabique procedente de la arteria coronaria derecha en la mayoría de los casos.</li>
	<li>Retire la pared libre ventricular izquierda con tijeras finas.</li>
	<li>Transfiera la preparación del músculo papilar a la cámara experimental en la que se colocó la cánula. La cámara está llena de la solución de Tyrode que contiene BDM. La parte inferior de esta cámara está recubierta con una fina capa (~2 mm) de PDMS.</li>
	<li>Ajuste la posición de la cánula (utilizando el micromanipulador) para permitir la canulación de la arteria septal. Apriete el nudo.</li>
	<li>Asegure el músculo papilar usando pequeños alfileres en el suelo de la cámara para que el objetivo del microscopio tenga una visión clara de la vasculatura. Preste atención al ángulo y a la posición de la cánula y asegúrese de que la punta de la cánula esté paralela a la pared arterial.</li>
	<li>Pruebe la canulación expulsando gradualmente la solución de la jeringa a través de la cánula. Si todos los elementos funcionan correctamente, la sangre residual en el músculo papilar saldrá del tejido al comienzo de este proceso y sólo la solución de Tyrode se verá más adelante.</li>
</ol>6. Estabilización de la preparación
<ol><li>Encienda la bomba peristáltica que proporcionará la solución de superfusión. A continuación, sobrefunda constantemente la preparación en el baño con PSS pre-gaseoso a razón de 3-4 mL/min.</li>
	<li>Encienda el controlador de temperatura para la solución de superfusión. Ajuste la temperatura del superfusato de baño a ~35-37 °C.</li>
	<li>Conecte la cánula a la servobomba. Lea la presión mostrada en el controlador de servo de presión.</li>
	<li>Monitoree el flujo y la presión. El flujo (μL/min) y la presión arterial por perfusión (mm Hg) se digitalizan mediante digitalizador y se registran utilizando un software asociado (Figura 2).</li>
	<li>Ajuste el flujo para ajustar la presión ~ 10 mmHg y dejar que funcione por ~ 10 min.</li>
	<li>Aumente el flujo de la solución luminal para hacer la presión de la arteria ~ 60 mmHg. Obtener la presión de perfusión final de la propia arteria restando la caída de presión de la cánula (Figura 3). NOTA: Si se selecciona el modo de "presión" en el controlador de servo de presión, la presión luminal se establece ~60 mmHg para estos experimentos. A continuación, supervise el cambio del flujo.</li>
	<li>Deje que la muestra se estabilice durante ~30-60 min monitoreando los niveles de flujo y/o presión. Normalmente se observa un aumento gradual de la presión arterial al principio de la perfusión después de la canulación. Un nuevo estado estable se establecerá por sí mismo en unos 30 minutos(Figura 4).</li>
	<li>Inicie un experimento después de estabilizar la presión de perfusión (en flujo constante).</li>
</ol>7. Carga de la preparación con agglutinina de germen de trigo etiquetada fluorescentemente (WGA)
<ol><li>Prepare la solución de Tyrode que contiene Alexa-Fluor-488 WGA conjugada añadiendo 100 μg de WGA conjugado en 5 ml de solución de Tyrode.</li>
	<li>Cambie cuidadosamente el perfusato de la solución normal de Tyrode a uno que contenga WGA etiquetada fluorescentemente. Es importante cambiar cuidadosamente el perfusato para que no se introduzcan burbujas.</li>
	<li>Después de ~30 min de perfusión WGA o cuando la solución WGA está a punto de agotarse, cambie el perfusato de nuevo a la solución normal de Tyrode.</li>
</ol>8. Imágenes confocales de arterias y capilares
<ol><li>Encienda el sistema de microscopios confocales de disco Nipkow.</li>
	<li>Utilice el microscopio para localizar la arteria septal utilizando un objetivo de baja potencia (4x) en modo de luz transmitida. NOTA: La arteria septal se puede localizar siguiendo la posición de la cánula.</li>
	<li>Inicie las imágenes confocales con el disco giratorio confocal y elija el láser de excitación de 488 nm, la ampliación objetiva de 40x y ajuste la intensidad del láser y la frecuencia de muestreo (10 - 500 ms por imagen).</li>
	<li>Configure las posiciones de imagen superior e inferior del microscopio confocal para definir el rango de imágenes e introduzca los parámetros de las imágenes de pila z.</li>
	<li>Establezca el tamaño del paso según lo recomendado para el sistema que se está utilizando o establezca el tamaño del paso como desee.</li>
	<li>Elija la configuración de la pila z y/o la configuración de la serie temporal.</li>
	<li>Seleccione o establezca una nueva carpeta para almacenar la nueva imagen.</li>
	<li>Haga clic en "Ejecutar" para iniciar la grabación de imágenes para su análisis futuro (Figura 5).</li>
</ol>9. Ejemplo de experimento vasodilatador: vasodilatación inducida por pinacida (Video 1).
<ol><li>Preparar solución de pinacidil stock (100 mM en DMSO) y almacenar a 4 °C.</li>
	<li>Prepare 10 ml de solución de Tirol. Añadir 10 μL de solución de pinacidil stock para hacer la concentración final de pinacidil 100 μM.</li>
	<li>Imagen del músculo papilar a baja magnificación (objetivo 4x) para incluir la arteria septal y las arterias de la rama.</li>
	<li>Cambie la solución luminal a la solución que contiene pinacidil.</li>
</ol>10. Ejemplo de experimentos de control del flujo sanguíneo: aumento de la presión arterial de perfusión inducida por vasoconstrictor a flujo constante (Figura 6)
<ol><li>Preparar solución de stock de endotelina-1 (ET-1) (10 μM) y almacenarse a -20 °C.</li>
	<li>Prepare 10 ml de solución de Tirol. Añadir 10 μL de solución de stock ET-1 (10 μM) para realizar la concentración final de ET-1 10 nM.</li>
	<li>Graba la presión luminal con flujo constante e imagen del músculo papilar.</li>
	<li>Cambie la solución luminal a la solución que contiene ET-1.</li>
</ol>11. Ejemplos de imágenes de capilar con pericitos (Figura 7)
<ol><li>Sacrificar un ratón transgénico NG2DsRedBAC como se describe en la sección 4 de este protocolo.</li>
	<li>Extraiga el corazón, cannulate la arteria septal y cargue la muestra con Alexa-Fluor-488 WGA conjugado siguiendo los protocolos 5-7.</li>
	<li>Imagen del músculo papilar a 488 nm y 560 nm de excitación, y 510-525 nm, 575-625 nm de emisión utilizando confocal. La presión arterial rondará los 40 mmHg.</li>
</ol>

<ol><li>Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-+and+voltage-dependent+electro-metabolic+signaling+regulates+blood+flow+in+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).</li>
<li>Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+perfusion+pressure+on+force+of+contraction+in+thin+papillary+muscles+and+trabeculae+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart.</a> Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).</li>
<li>Tillmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+in+the+ventricle+of+the+dog+and+turtle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle.</a> Circulation Research. 34, 561-569 (1974).</li>
<li>Martini, J., Honig, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+intercapillary+distance+in+beating+rat+heart+in+situ+under+various+conditions+of+O2+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply.</a> Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).</li>
<li>Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+coronary+vessel+pressure+and+diameter+in+an+intact+beating+rabbit+heart+using+fixed-position+and+free-motion+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques.</a> Circulation Research. 49, 342-353 (1981).</li>
<li>Marcus, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+coronary+circulation+through+studies+at+the+microvascular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level.</a> Circulation. 82, 1-7 (1990).</li>
<li>Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protocol+for+removal+of+the+endothelium+from+the+perfused+rat+hind-limb+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation.</a> Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).</li>
<li>Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptors+mediate+UTP-induced+cation+currents%2C+Ca2%2B+signals%2C+and+vasoconstriction+in+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Amercian+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries.</a> Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).</li>
<li>Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1+enhances+SR+Ca2%2B+content+through+binding+phospholamban+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).</li>
<li>Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction+uncoupling+with+butanedione+monoxime+versus+low+calcium+or+high+potassium+solutions+on+flow+and+contractile+function+of+isolated+hearts+after+prolonged+hypothermic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion.</a> Circulation. 89, 2412-2420 (1994).</li>
<li>Lawton, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Low-Cost+and+Open+Source+Pressure+Myograph+System+for+Vascular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology.</a> Frontiers in Physiology. 10, 99(2019).</li>
<li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).</li>
</ol>

En el presente trabajo, hemos introducido un método ex vivo notablemente simple pero altamente práctico para estudiar la microcirculación coronaria en el corazón en condiciones fisiológicas. Este método fue modificado a partir de investigaciones mecánicas utilizando ratas2. La adición desafiante fue la tecnología de imágenes con alta velocidad y alta resolución óptica. Por lo tanto, pudimos aprovechar los avanzados sistemas de imágenes ópticas que ahora están disponibles comercialmente. Mediante u...

La regulación adecuada del flujo de presión coronaria asegura suficiente suministro de sangre al corazón para satisfacer sus demandas metabólicas1. Sin embargo, recientemente ha quedado claro cómo el flujo de presión coronario está regulado dinámicamente en el corazón, a pesar de los extensos estudios que se han realizado in vivo e in vitro durante las últimas décadas. Una de las razones es la dificultad de establecer un modelo de trabajo fisiológico para este tipo de estudios debido a la latido constante del corazón. A pesar de todo, se han establecido una variedad de métodos para la observación de los micro-vasos coronarios en tejidos vivos o animales, pero ninguno de estos métodos fue capaz de lograr un enfoque constante / estable y las mediciones de la presión, flujo y diámetro microvascular al mismo tiempo2,3. La visualización directa de micro-vasos arteriales coronarios en el corazón latiendo se introdujo hace décadas4,3,pero las mediciones de diámetro en recipientes pequeños fue un desafío y las funciones específicas de los muchos tipos de células especializadas asociadas con la microcirculación fueron igualmente molestas. Incluso el método estroboscópico y el sistema objetivo flotante no podían proporcionar la información anterior simultáneamente5. No obstante, se ha obtenido una cantidad significativa de información valiosa utilizando las tecnologías antes mencionadas, que nos han ayudado a comprender más sobre la regulación del flujo sanguíneo coronario6. El método que estamos describiendo en este artículo ayudará a investigar y entender en detalle cómo los componentes de las arterias coronarias, las arterias y la microvasculatura responden de manera diferente a las estimulaciones y demandas metabólicas.
El modelo de trabajo que establecimos para llevar a cabo estos estudios se construyó sobre el trabajo anterior de Westerhof et al.2. Después de la canulación de la arteria septal del corazón del ratón, se utilizó solución salina fisiológica para perfundir esa arteria para mantener nutridos los micocitos y otros componentes del tejido cardíaco. La presión arterial por perfusión, el flujo y el diámetro vascular fueron monitoreados entre otras funciones fisiológicas utilizando indicadores fluorescentes apropiados. Este método nos permite visualizar el lecho microvascular coronario bajo presión fisiológica en el tejido vivo y estudiar por primera vez los mecanismos celulares subyacentes a la regulación de la microcirculación.

<table><tbody><tr><td>Solución de CaCl2 1 M</td><td>MilliporeSigma, EE. UU.</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>Solución de MgCl2 de 1 M</td><td>MilliporeSigma, EE. UU</td>. Software <td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>AxoScope</td><td>Molecular Devices, San José, CA, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enfriador/incubadora de agua</td><td>FisherScientific, EE. UU.</td><td>Isotemp 3016S</td><td></td></tr><tr><td>Confocal</td><td>Nikon Instruments, EE. UU.</td><td>A1R</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidrio personalizado</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>9-000-3301</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Molecular Devices, San José, CA, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus, Japón</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Endotelina-1</td><td>MilliporeSigma, EE. UU.</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Sódica Salt</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Calentador de solución en línea</td><td>Warner Istruments, Hamden, CT, EE. UU.</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>VETone, Idaho, EE. UU.</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA, EE. UU</td>. <td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Soporte para micropipeta/cánula</td><td>Warner Istruments, Hamden, CT, EE. UU.</td><td>64-0981</td><td></td></tr><tr><td>Ratón transgénico NG2DsRedBAC</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#008241</td><td></td></tr><tr><td>Hilo de nylon para atar vasos sanguíneos</td><td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vermont, EE. UU</td>. <td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>PDMS (polidimetilsiloxano)</td><td>SYLGARD, Germantown, WI, EE. UU</td>. <td>184 SIL ELAST KIT</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Gilson, Middleton, WI, EE. UU</td>. <td>MINIPULS 3</td><td></td></tr><tr><td>Servo de presión Controlador</td> Living <td>Systems Instrumentation, Burlington, Vermont, EE. UU.</td><td>PS-200-S</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras</td><td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA, EE. UU.</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Servo Pump Living</td><td>Systems Instrumentation, Burlington, Vt, EE. UU</td>. <td>PS-200-P</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Warner Instruments, Hamden, CT, EE. UU</td>. <td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>Aglutinina de germen de trigo, Alexa Fluor 488 Conjugado</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA EE. UU</td>. <td>W11261</td><td></td></tr></tbody></table>

medición dinámica e imagen de capilares, arterias y pericitos en el corazón del ratón

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

El tono arterial coronario junto con la apertura o cierre de los capilares determinan en gran medida el flujo sanguíneo a los cardiomiocitos a presión constante de perfusión. Sin embargo, es difícil monitorear los cambios dinámicos de las arterias coronarias y los capilares en todo el corazón, principalmente debido a su movimiento y latido sin parar. Aquí describimos un método que permite monitorear la tasa de perfusión arterial, la presión y los cambios de diámetro de las arterias y capilares en los músculos papilares ventriculares derecho del ratón. La arteria septal del ratón se puede acumular y perfundir a un flujo o presión constante con la otra medida dinámica. Después de perfusión con una lectina etiquetada fluorescentemente (por ejemplo, Alexa Fluor-488 o -633 etiquetada Wheat-Germ Agglutinin, WGA), las arterias y capilares (y otros vasos) en el músculo papilar ventrículo derecho y el tabique podrían ser fácilmente imaginedos. Los cambios en el diámetro de los vasos podrían medirse en presencia o ausencia de contracciones cardíacas. Cuando se expresaron proteínas fluorescentes codificadas genéticamente, se pudieron monitorear características específicas. Por ejemplo, los pericitos se visualizaron en corazones de ratón que expresaban NG2-DsRed. Este método ha proporcionado una plataforma útil para estudiar las funciones fisiológicas de los pericitos capilares en el corazón. También es adecuado para estudiar el efecto de los reactivos en el flujo sanguíneo en el corazón mediante la medición del diámetro vascular / capilar y la presión luminal arterial simultáneamente. Esta preparación, combinada con un sistema de imágenes ópticas de última generación, permite estudiar el flujo sanguíneo y su control a nivel celular y molecular en el corazón en condiciones casi fisiológicas.

Cuando un marcador vascular de fluorescencia se perfunde en lúmenes vasculares (aquí WGA conjugado con Alexa Fluor-488), es posible visualizar árboles vasculares enteros como se muestra en la Figura 5 (panel izquierdo) utilizando microscopio confocal de alta velocidad. Una mayor ampliación permite la toma de imágenes de capilar en detalle(Figura 5,Panel derecho). Dado que el sistema presurizado admite un monitoreo constante de la presión luminal, esta preparació...

Aquí se presenta un protocolo para estudiar la microcirculación coronaria en el tejido cardíaco murino vivo mediante la monitorización ex vivo de la presión arterial perfusión y el flujo que mantiene la presión, así como componentes de árboles vasculares incluyendo los lechos capilares y pericitos, ya que la arteria septal está cánulada y presurizada.

Medición dinámica e imagen de capilares, arterias y pericitos en el corazón del ratón

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

Este método se puede utilizar para estudiar la microcirculación coronaria en el tejido cardíaco murino vivo y los componentes del árbol vascular mediante la monitorización ex vivo de la presión y el flujo de perfusión arterial. Este método proporciona una plataforma útil para estudiar la función de los pericitos y la microcirculación de los reactivos dentro del corazón, por lo que tendemos a medir el diámetro vascular y la presión luminal de la arteriola. Para preparar una cánula para el experimento, utilice un extractor de micropipetas para producir dos cánulas con puntas largas y delgadas, a partir de un solo tubo de vidrio de borosilicato limpio.Use un par de tijeras finas y un microscopio de disección para cortar la punta de cada cánula hasta un diámetro final de 100 a 150 micrómetros, y pula las puntas con fuego para redondear ligeramente los bordes afilados. Use un alambre de platino colocado en el costado del eje, aproximadamente a dos milímetros de la punta para doblar la cánula a lo largo del eje en un ángulo de aproximadamente 45 grados, e inserte el extremo abierto de la cánula en el soporte de la cánula. Luego, apriete el accesorio y use una jeringa de cinco mililitros para enjuagar la cánula y el tubo con la solución de Tyrode.Monte el soporte de la cánula en la micromanipulación de una cámara de miógrafo de presión. Para recolectar un corazón de ratón para el experimento, primero ingrese un par en él e inyecte 500 microlitros de heparina en un ratón C 57 negro seis anestesiado de ocho a 16 semanas de edad. Después de 10 minutos, coloque el ratón en una cama caliente en posición supina y estabilice las patas con cinta adhesiva.Use fórceps y tijeras quirúrgicas para hacer una incisión en la piel abdominal, por encima del diafragma y corte el diafragma y el esternón para permitir la disección del corazón de la cavidad torácica. Coloque el corazón en una solución helada de Tyrode que contenga 30 milimolares de BDM y extraiga cualquier tejido conectivo del corazón según sea necesario. A continuación, coloque el corazón en una cámara de disección preenfriada, llena de solución fresca de Tyrode suplementada con 30 milimolares de BDM.Para preparar la arteria septal para la canulación, encienda la servopompa y configure la presión del servocontrolador en modo de flujo. En el corazón sobre el PDMS, teniendo cuidado de evitar daños en el área media del tejido y colocando el tejido bajo un microscopio de disección. Extirpar una o ambas aurículas y abrir el ventrículo derecho.Retire la pared libre del ventrículo derecho y exponga la arteria septal. Use un hilo de nailon de 30 micrómetros de diámetro para hacer un nudo suelto alrededor de la arteria septal. Utilice unas tijeras finas para extraer la pared libre del ventrículo izquierdo y transferir la preparación del músculo papilar a la cámara experimental.Utilice un micromanipulador para insertar una cánula en la arteria septal y asegure la cánula con la sutura. A continuación, utilice clavos para fijar el músculo papilar al suelo de la cámara con la punta de la cánula paralela a la pared arterial, de modo que se pueda obtener una visión clara de la vasculatura y utilice la jeringa para enjuagar gradualmente la solución a través de la cánula. Para estabilizar la preparación del tejido, encienda una bomba peristáltica y superfusione continuamente la preparación con una solución salina fisiológica pregaseada a un caudal de tres a cuatro mililitros por minuto, encienda el controlador de temperatura para la solución de superfusión y ajuste la temperatura del baño superfusado a 35 a 37 grados Celsius.Conecte la cánula a la servobomba y ajuste el flujo para establecer la presión a aproximadamente 10 milímetros de mercurio. Deje correr la superfusión durante unos 10 minutos, luego aumente el flujo de la solución luminal para ajustar la presión arterial a aproximadamente 60 milímetros de mercurio y permitir que la muestra se estabilice durante 30 a 60 minutos con monitoreo. Para cargar la muestra con aglutinina de germen de trigo, perfunda la preparación con cinco mililitros de solución de Tyrode, suplementada con 100 microgramos de aglutinina de germen de trigo conjugada Alexa Fluor-488.Después de 30 minutos, cambie el auxiliar de perfusión a la solución normal de Tyrode y encienda el sistema de microscopio confocal. Utilice el microscopio a una potencia de aumento más baja para localizar la arteria septal en modo de luz transmitida y comience a obtener imágenes con este disco giratorio confocal. Seleccione un aumento de objetivo de 40X y el láser de excitación de 488 nanómetros, y ajuste la intensidad del láser y la frecuencia de muestreo.Para definir el rango de imagen, defina las posiciones de imagen superior e inferior del microscopio y defina el tamaño del paso y los parámetros de imagen de la pila Z. A continuación, seleccione una carpeta para almacenar la imagen y haga clic en ejecutar para comenzar a grabar las imágenes. Cuando un marcador vascular de fluorescencia se perfunde en la luz vascular, es posible visualizar árboles vasculares completos, utilizando microscopía confocal de alta velocidad.Un aumento adicional permite obtener imágenes del capilar en detalle. Cuando el pinacidil y el agonista de los canales de potasio sensibles al ATP se administran desde el lumen, el diámetro de las arterias aumenta. Cuando el vasoconstrictor endotelina se aplica desde el lumen.El diámetro de la arteria disminuye. Cuando el ajuste de flujo es constante, la presión luminal aumenta. En estas imágenes de tejido papilar de un ratón transgénico que expresa NG dos DS rojos, tanto el capilar como los pericitos se pueden visualizar dentro del tejido muscular papilar, en condiciones que imitan mejor la fisiología de los animales vivos.Es importante que no haya burbujas dentro del tubo en ningún momento durante el procedimiento. Combinando este método con técnicas de imagen óptica, la preparación se puede utilizar para estudiar la microcirculación en el corazón y las comunicaciones intercelulares entre diferentes tipos de células, utilizando ratones transgénicos con tecnología de fluorescencia.

dynamic-measurement-imaging-capillaries-arterioles-pericytes-mouse

Research

Investigación

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Microscopia intravital para seguir los acontecimientos hemodinámicos e inflamatorios temporal y espacial en la microcirculación pial.

Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado

Este documento detalla el procedimiento de disección, la configuración instrumental y las condiciones experimentales durante el mapeo óptico del potencial de membrana (Vm) y el calcio intracelular transitoria (CAT) en Langendorff perfundidos aislados intactos los corazones de ratón.

Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

El endotelio glicocalix / endotelial capa superficial está muy bien estudiada mediante microscopía intravital. Microscopía intravital es técnicamente difícil en un órgano en movimiento, como el pulmón. Se demuestra cómo simultánea campo claro y microscopía de fluorescencia se puede usar para estimar el espesor de capa de la superficie endotelial en un libremente...

Medición in vivo de la capa de ratón pulmonar superficie endotelial

Microscopía intravital del cremáster microcirculación ratón M. ofrece un único y bien estandarizada-modelo in vivo para el análisis de médula ósea periférica migración de células madre en.

Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas

La examinación ecocardiográfica se utiliza con frecuencia en los ratones. Dispositivos de ecografía de alta resolución caro han sido desarrollados para este propósito. Este protocolo describe un procedimiento ecocardiográfico asequible combinado con análisis de morfometría histológica para determinar la morfología cardiaca.

Examen ecocardiográfico e histológico de la morfología cardiaca en el ratón

Este estudio utiliza una técnica de microscopía (LSFM) de hoja de luz fluorescencia iluminación doble cara combinada con la compensación óptica para estudiar el corazón murino.

Hoja de luz fluorescencia microscopía para el estudio del corazón murino

Este estudio describe un protocolo integral de resonancia magnética cardiovascular (CMR) para cuantificar los parámetros funcionales del ventrículo izquierdo del corazón de ratón. El protocolo describe la adquisición, el post-procesamiento y el análisis de las imágenes CMR, así como la evaluación de diferentes parámetros funcionales cardíacos.

Cuantificación de la función ventricular izquierda del corazón de ratón, la distensión miocárdica y las fuerzas hemodinámicas mediante imágenes de resonancia magnética cardiovascular

Este protocolo presenta pasos para adquirir y analizar imágenes de calcio fluorescente de pericitos que envuelven el cerebro y datos de flujo sanguíneo de vasos sanguíneos cercanos en ratones anestesiados. Estas técnicas son útiles para estudios de fisiología de células murales y se pueden adaptar para investigar transitorios de calcio en cualquier tipo de célula.

Calcio de pericitos cerebrales e imágenes hemodinámicas en ratones transgénicos in vivo

Presentamos un método para la reconstrucción mesoscópica de todo el corazón del ratón mediante la combinación de nuevos avances en la transformación de tejidos y la tinción con el desarrollo de un microscopio de hoja de luz escaneado axialmente.

Imágenes ópticas mesoscópicas del corazón de todo el ratón

La preparación intensiva de "tubos" endoteliales cerebrales intactos de ratón de las arteriolas del parénquima cerebral se ilustra para estudiar la regulación del flujo sanguíneo cerebral. Además, demostramos las fortalezas experimentales de este modelo de estudio endotelial para imágenes de fluorescencia y medición electrofisiológica de vías clave de señalización celular, incluidos los cambios en el [Ca2+] intracelular y el potencial de membrana.

Aislamiento y análisis funcional del endotelio arteriolar del parénquima cerebral de ratón

Este protocolo introduce un método rápido para la obtención de imágenes vasculares tridimensionales cuantitativas de montaje completo mediante microscopía de fluorescencia de lámina de luz. La eficacia del método se demuestra utilizando el sistema de arterias de arco faríngeo del modelo de embrión de pollo, con fuerzas hemodinámicas cuantificadas mediante dinámica de fluidos computacional.

Obtención rápida de imágenes de alta resolución de la vasculatura de animales pequeños para estudios cuantitativos

Aprende a medir la microcirculación coronaria en tejido cardíaco murino ex vivo mediante monitoreo de presión y flujo arterial. Este método permite evaluar la función de pericitos y la dinámica vascular en condiciones controladas.

Medición dinámica e imagen de capilares, arterias y pericitos en el corazón del ratón

Explorar más videos