Observación microscópica de la dinámica de linfocitos en los parches de Rat Peyer

Este protocolo permite realizar la observación in vivo de la dinámica de los linfocitos en los parches de Peyer de rata durante largos periodos de tiempo. Se puede utilizar para explorar los efectos de varias pistas en los linfocitos in vivo. La demostración del procedimiento estará a cargo de Kazuki Horiuchi, un médico de mi laboratorio.

Comience formando un tubo de canulación y sumérjalo en agua caliente, luego dóblelo y fíjelo a una tabla de plástico con cinta adhesiva. Después de anestesiar a una rata Wistar macho y quitarle el pelo del abdomen, realice una incisión horizontal con tijeras quirúrgicas desde la línea media hasta la zona subcostal izquierda, teniendo cuidado de no dañar los vasos sanguíneos del peritoneo parietal. Envuelva el intestino con una gasa húmeda y muévala suavemente hacia el exterior del cuerpo para revelar los órganos retroperitoneales.

Inserte una muesca entre los músculos erectores de la columna vertebral y el tejido adiposo con unas tijeras quirúrgicas, luego sepárelos sin rodeos con los dedos. Retire con cuidado el tejido conectivo alrededor del conducto torácico. Exponga el conducto torácico desde justo debajo de la crus izquierda del diafragma caudalmente hasta que 20 milímetros del conducto sean visibles.

Separe suavemente las adherencias entre el conducto torácico y la aorta con pinzas de precisión o hisopos de algodón húmedos. Aplique una ligadura en el conducto torácico justo debajo del conducto torácico izquierdo del diafragma, lo que hace que el conducto torácico caudal se distienda. Haga un agujero de cinco milímetros en la pared abdominal apuñalándolo con las tijeras quirúrgicas, pase el tubo de canulación curvado en el orificio y lige el tubo en el músculo iliopsoas.

Llene el tubo de canulación con solución salina normal que contenga 10 unidades por mililitro de heparina. Después de colocar una cuerda debajo del conducto torácico distendido, apuñale el conducto con un borde cortado bruscamente del tubo de canulación, cánulo aproximadamente cinco milímetros hacia la cola y lige el conducto torácico con el tubo de canulación. Para prevenir la deshidratación, cree un orificio de tres milímetros en la pared anterior del antro del estómago con pinzas de precisión y pase un tubo de silicona de dos milímetros al duodeno a través del anillo pilórico.

Después de cerrar la herida, mantenga a los animales en las jaulas de Bollman y comience a infundir solución salina cargada de azúcar en el duodeno de la rata desde el tubo de silicona a un caudal de tres mililitros por hora. Cubre toda la jaula con una toalla de papel para mantenerla caliente. Para recoger los linfocitos del conducto torácico, fije el tubo de canulación al orificio en el centro de la tapa de un tubo cónico de 15 mililitros sobre hielo que contenga seis unidades por mililitro de heparina, 10% de suero fetal bovino y medio RPMI 1640.

Disuelva CFDSE y dimetilsulfóxido a 15,6 milimolares e incube una vez 10 a los novenos linfocitos en 15 mililitros de RPMI 1640 con 50 microlitros de solución CFDSE durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Bajo anestesia continua con isoflurano al 2%, se colocó la rata Wistar en una placa portátil de acero inoxidable con un orificio rectangular alrededor del centro cubierto con un portaobjetos de vidrio y se abrió el abdomen de la rata Wistar receptora a través de una incisión en la línea media. Seleccione aproximadamente 10 centímetros del segmento ileal con parches de Peyer para la observación.

Mantenga el intestino húmedo y lo más caliente posible empapando la gasa que se usa para cubrir el intestino delgado con PBS calentado a 37 grados centígrados. Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio y elija áreas adecuadas para la observación de la microcirculación en los parches de Peyer donde algunas vénulas endoteliales altas corren a través de la serosa. Cubra el segmento intestinal adyacente y el mesenterio con algodón absorbente empapado con PBS.

Coloque el segmento de intestino entre dos bolas de algodón enrolladas y colóquelo lo más lejos posible del cuerpo de la rata para evitar que vibre con los latidos del corazón y la respiración de la rata. Use una jeringa de un mililitro para inyectar lentamente los linfocitos del conducto torácico marcados con CFSE en la vena yugular de las ratas receptoras desde el catéter venoso. Monitorizar de forma continua los linfocitos del conducto torácico en la microvasculatura de los parches de Peyer mediante CLSM y realizar imágenes time-lapse durante tres horas a intervalos de 32.

Inyecte 25 miligramos por kilogramo de dextrano rojo de Texas en la vena yugular de la rata receptora para manchar el torrente sanguíneo y cinco miligramos por kilogramo Hoechest 33342 para teñir los núcleos celulares. Para cuantificar la dinámica de los linfocitos, defina los linfocitos que se adhieren a las vénulas endoteliales altas durante más de 30 segundos como linfocitos adhesivos y los que migran de las vénulas endoteliales altas al estroma como linfocitos migratorios. A continuación, calcule el porcentaje medio de migración en cada campo de visión.

Este protocolo se utilizó para recolectar linfocitos intestinales vírgenes naïve y observar su migración en parches de Peyer de rata. Aquí se muestran imágenes microscópicas de los parches de Peyer. Los núcleos de las células endoteliales vasculares se tiñen de azul.

El plasma sanguíneo es rojo y el flujo sanguíneo se detecta mediante el flujo de células no teñidas. Se pueden ver linfocitos intestinales tropicales teñidos de verde adheridos a vénulas endoteliales altas. Al realizar este protocolo, tenga en cuenta que es importante la preparación para crear el entorno óptimo para la canulación, incluida la exposición del conducto torácico y el ajuste de la relación posicional entre el conducto torácico y el catéter que corre en paralelo.

La observación de la dinámica de los linfocitos en los parches de Peyer en varias condiciones puede ser la base para futuras investigaciones sobre la inmunidad intestinal.