Name: Observación microscópica de la dinámica de linfocitos en los parches de Rat Peyer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Aprende a observar la dinámica de linfocitos en parches de Peyer de ratas mediante microscopía confocal y fotografía time-lapse. Este método permite estudiar la migración celular in vivo durante tres horas en condiciones inflamatorias.

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Esta investigación fue apoyada por subvenciones del National Defense Medical College y por una beca de investigación de Salud y Ciencias del Trabajo para la investigación sobre enfermedades intratables del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar, Japón.

El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Investigación Animal del Colegio Médico de Defensa Nacional (nº 16058). Los animales se mantuvieron en la comida de laboratorio estándar (CLEA Japan Inc, Tokio, Japón). Los animales de laboratorio fueron tratados de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud.
1. Recolección y separación de linfocitos
NOTA: Dado que los linfocitos deben estar frescos y no pueden almacenarse, deben ser recogidos de ratas para cada experimento. Además, los linfocitos trópicos intestinales deben recogerse directamente del conducto torácico donde circulan. Se espera que todos los procedimientos se completen en un plazo de 6 horas, y todos los instrumentos, guantes y superficies estén limpios. Con el fin de mantener a los animales en un estado fisiológicamente estable, todos los salinas y otros fluidos utilizados en el experimento deben mantenerse calientes.
<ol><li>Formar un tubo de canulación (1 mm de diámetro) como una curva de heparina (un radio de unos 5 mm) después de sumergirlo en agua caliente (aproximadamente 80-90 °C) y fijarlo a una placa de plástico utilizando cinta adhesiva durante unas horas de antelación.</li>
	<li>Anestesiar una rata Wistar macho (8-12 semanas) con inyección intraperitoneal de una mezcla de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) y Betulphar (2,5mg/kg) y cortar el vello corporal del abdomen usando un cortapelos. Retire el cabello firmemente después de afeitarse para que el cabello no entre en la cavidad abdominal.</li>
	<li>Después de confirmar que la profundidad estable de la anestesia requerida para el procedimiento se obtiene mediante pellizco de dedo del pie, hacer una incisión con tijeras quirúrgicas horizontalmente desde la línea media hasta el área subcostal izquierda. Tenga cuidado de no dañar los vasos sanguíneos en el peritoneo parietal observando los vasos bajo la luz.</li>
	<li>Envuelva el estómago con gasa húmeda y mueva el estómago suavemente hacia la derecha fuera del cuerpo para revelar los órganos retroperitoneales. Inserte una muesca entre los músculos erectores de la columna vertebral y el tejido adiposo usando tijeras quirúrgicas y sepámelas sin rodeos con los dedos.</li>
	<li>Retire cuidadosamente el tejido conectivo alrededor del conducto torácico. El exceso de tejido conectivo aumenta con la edad. Exponga el conducto torácico desde justo debajo de los crus izquierdos del diafragma caudalmente hasta que se visibilizó una longitud de 20 mm del conducto torácico. Separe suavemente las adherencias entre el conducto torácico y la aorta utilizando pinzas de precisión o hisopos de algodón húmedo.<ol>
<li>Realice este proceso cuidadosamente porque algunas ratas tienen arterias ramificadas de la arteria abdominal cruzando sobre el conducto torácico o un conducto torácico corto debido a una posición más alta del plexo linfático (pequeños conductos torácicos que se propagan como telarañas). Evite el contacto innecesario con el conducto torácico para evitar inducir edema.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplicar una ligadura por una cuerda (3-0 de seda) en el conducto torácico justo debajo de los crus izquierdos del diafragma. El conducto torácico caudal se distete.</li>
	<li>Hacer un agujero (5 mm de diámetro) en la pared abdominal apuñalando el filo de las tijeras quirúrgicas, pasar el tubo de canulación curvada de horquilla, y ligar el tubo en el músculo iliopsoas en un momento dado. Llene el tubo de canulación con solución salina normal que contenga 10 heparinaS/ml.</li>
	<li>Después de colocar una cuerda (3-0 de seda) debajo del conducto torácico distecido, apuñale el conducto torácico con el borde de corte afilado de un tubo de canulación, lo cannulate hacia la cola de unos 5 mm y ligar el conducto torácico con tubo de canulación para su fijación.</li>
	<li>Para suministrar solución salina para evitar la deshidratación, cree un agujero (3 mm de diámetro) en la pared anterior del átrum del estómago utilizando pinzas de precisión y pase el tubo de silicio (2 mm de diámetro) al duodeno a través del anillo pilórico. Después de coser una herida y mantener a los animales en las jaulas de Bollman, comience a infundir solución salina cargada de azúcar en el duodeno de cada rata desde el tubo de silicio a un caudal de 3 ml/h. Cubra toda la jaula con una toalla de papel para mantenerla caliente.</li>
	<li>Fije el tubo de canulación al agujero en el centro de la tapa de un tubo cónico de 50 ml sobre hielo que contenga 6 heparina U/ml, 10% suero bovino fetal y MEDIO RPMI 1640 (pH 7.4; ver la tabla de materiales) y recoger linfocitos de conducto torácico (TDL) en hielo. Tenga cuidado de no entrar en contacto con la punta del tubo a la pared del tubo cónico para evitar la oclusión del tubo cannulado debido a la formación de coágulos de fibrina dentro del tubo. El líquido linfático (aproximadamente 20 ml) incluyendo aproximadamente 1.0 x 108~ 109 linfocitos se puede obtener en 6 horas. Para obtener los linfocitos bajo anestesia completa, se controla el plano de anestesia y se observa adecuadamente el flujo linfático. Los mismos anestésicos se añaden a la misma dosis unas 3 horas después de que las ratas son puestas en la jaula de Ballman para obtener anestesia profunda continuamente durante 6 horas.</li>
</ol>2. Etiquetado de linfocitos con éster de diacetato de carboxofluorescetina (CFDSE)
<ol><li>Disolver CFDSE (Tabla de Materiales) en sulfóxido de dimetil (DMSO) a 15,6 mM (500 μg de CFDSE disuelto en 60 μL de DMSO).</li>
	<li>Incubar linfocitos (1 x 108~109)en 50 ml de RPMI 1640 con 50 μL de solución CFDSE durante 30 min a 37 °C como se describió anteriormente10.</li>
</ol>3. Configuración experimental para estudios microvasculares
<ol><li>Ratas receptoras de anestesia (8-12 semanas) con inyección intraperitoneal de una mezcla de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) y Betulphar (2,5mg/kg) y confirmar la profundidad de la anestesia por pellizco de los dedos de los dedos de los dedos de los dedos. Moje el abdomen antes de acicalar la piel para minimizar la contaminación del cabello. A continuación, abra el abdomen de la rata Wister receptora a través de una incisión de línea media.</li>
	<li>Coloque una rata en una placa portátil de acero inoxidable (aproximadamente 120 x 300 mm) con un agujero rectangular alrededor del centro cubierto con un tobogán de vidrio (24 x 50 mm). Elija unos 10 cm del segmento ileal, incluidos los PPs para la observación.</li>
	<li>Mantenga el intestino lo más caliente posible y húmedo con solución salina amortiguada por fosfato (PBS) calentada a 37 °C. Remoje la gasa que se utiliza para cubrir el intestino delgado con PBS.</li>
	<li>Mientras que dar anestesia continua con 2 % isoflurano (ver tabla de materiales), poner la diapositiva en el escenario del microscopio y elegir áreas adecuadas para la observación de la microcirculación en PPs donde algunos HEV están corriendo a través de la serosa. Rango de PPs en tamaño; los más grandes son adecuados para la observación de la microcirculación utilizando CLSM. El intestino delgado no es recto en algunos lugares; un segmento recto de al menos 2 cm de largo sin ninguna tensión es adecuado para la observación.</li>
	<li>Cubra el segmento intestinal adyacente y la mesentería con algodón absorbente empapado con PBS. Coloque el segmento intestinal entre dos bolas de algodón enrolladas y colóquelo lo más lejos posible del cuerpo de la rata para evitar que vibre los latidos del corazón y la respiración de la rata.</li>
	<li>Usando una jeringa de 1 ml, inyecte lentamente (más de 1 min) TDL etiquetados con CFSE (1 x 108 células) en la vena yugular de las ratas receptoras. Una inyección intravenosa rápida puede influir en la circulación sistémica.</li>
</ol>4. Microcirculación de linfocitos
<ol><li>Supervise continuamente los TDLs en la microvasculatura de los PPs utilizando CLSM y grabe en un ordenador durante 3 horas utilizando fotografías de lapso de tiempo a intervalos de 30 s. La profundidad de la serosa al HEV de los PPs es de aproximadamente 25 μm, lo que permite la observación de los vasos linfáticos estroboscópicos y capilares a una profundidad de 30 μm.</li>
	<li>Inyectar Texas Red-dextran (25 mg/kg) en la vena yugular de cada rata receptora para manchar el torrente sanguíneo y Hoechest 33342 (5 mg/kg) para manchar los núcleos celulares.</li>
	<li>(Opcional) Para cuantificar la dinámica de los linfocitos, defina los linfocitos que se adhieren a los HEV durante más de 30 segundos como "linfocitos adhesivos" y linfocitos que emigran de hevs a estroboscómicos como "linfocitos migratorios". A continuación, calcule el porcentaje medio de migración (linfocitos migratorios / linfocitos adhesivos + linfocitos migratorios) por campo de visión (aproximadamente 0,3 mm2).</li>
</ol>

<ol><li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Vascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li>
<li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking%3A+a+general+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li>
<li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li>
<li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li>
<li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver%2C+small+intestine%2C+or+thoracic+duct+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Laboratory+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li>
<li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer%27s+Patches%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li>
<li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer%27s+Patches%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li>
<li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+%22Kaede%22+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li>
<li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophy+of+Infected+Peyer%27s+Patches+Arises+From+Global%2C+Interferon-Receptor%2C+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li>
<li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li>
<li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer%27s+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li>
<li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Microscopy%3A+Visualizing+Immunity+in+Context%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li>
<li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity%3A+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí describimos un protocolo para recolectar linfocitos ingenuas de intestino y trópicos y observar su migración en PPs de ratas. Estos procedimientos pueden revelar cómo los linfocitos se mueven en la microvasculatura de los PPs y permiten comparar visualmente su dinámica bajo una condición normal o medicada. La observación directa de estas dinámicas tiene mucho mérito para obtener una pista de modificación inmunológica por parte de algunos fármacos, aunque el período observacional se limita a sólo unas pocas horas.</p...

Los parches de Peyer consisten en cientos de folículos linfoides en la propria lamina del intestino delgado. Los PPs se dividen en folículos, la región interfollicular y los centros germinales ubicados en la parte inferior de los folículos, donde los linfocitos son estimulados por la presentación de antígenos. No hay vasos linfáticos aferentes, y los antígenos invaden la propria lamina del lúmenes intestinales a través de la capa celular epitelial. La región epitelial que cubre folículos linfoides se llama epitelio asociado al folículo, dentro del cual las células M intercaladas especializadas captan antígenos mucosos. Las células M toman antígenos del lado luminal y los antígenos son capturados por células dendríticas y presentados hacia linfocitos ingenuos que fluyen en PPs a través del endotelio de ventules endoteliales altos (HEV)1. Los PPs desempeñan un papel importante en la inmunidad intestinal y están relacionados con la etapa temprana de la inflamación. Muchas interacciones moleculares implican la entrada de linfocitos a órganos linfoides secundarios (SLOs), incluyendo moléculas de adhesión, quimioquinas2,3y esfingosina-1-fosfato4; por lo tanto, hay muchas dianas terapéuticas esperadas. Por lo tanto, observar la dinámica de linfocitos dentro de los PPs nos permite echar un vistazo a la etapa muy temprana de la inflamación y examinar la utilidad de varios fármacos prometedores.
El método aquí se centra en la migración de linfocitos en PPs, que incluye varios procedimientos (cannulación en el conducto torácico5 y recolección de linfocitos y observación a largo plazo después de la inyección en linfocitos recogidos). Dado que estos procedimientos son complejos y era difícil ver exactamente cómo se realizaba cada procedimiento en informes anteriores, mencionamos aquí algunos consejos para lograr una observación exitosa. Por ejemplo, la canulación de los tubos en el conducto torácico fue muy difícil, y la tasa de éxito inicial de la canulación fue inferior al 50%. Sin embargo, mejoramos el método y logramos una tasa de éxito superior al 80%. Mencionamos algunos otros consejos en este manuscrito que son necesarios para la observación exitosa para permitir la evaluación cuantitativa de la migración transendotelial de linfocitos en varias condiciones.
En informes anteriores, era difícil entender los cambios tridimensionales con el tiempo, como la inyección intravenosa de tinta india para manchar la estructura vascular de los PPs6,o el microscopio siendo monofocal7. En los últimos años, un método observacional utilizando algunos animales transgénicos de proteína de fluorescencia fotoconvertible como ratones Kaede han aclarado los movimientos celulares sistemáticos in vivo8. El otro estudio aclaró el apagado independiente CD69 de la salida de linfocitos de PPs9. Utilizamos microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) debido a su alta capacidad analítica. Ahora podemos obtener fácilmente imágenes de alta resolución y utilizarlas para analizar la dinámica de los linfocitos.
En este informe, demostramos una serie de métodos para evaluar la migración de linfocitos en los PPs. En primer lugar, mostramos métodos refinados de canulación de conductos torácicos para recolectar linfocitos. En segundo lugar, mejoramos los métodos de observación de varias maneras para mantener órganos objetivos siempre que sea posible bajo observación microscópica, lo que nos permite obtener imágenes de alta calidad durante 3 horas. En tercer lugar, cuantificamos los movimientos celulares de la migración de linfocitos para evaluar los efectos de algunos medicamentos. Estos protocolos modificados contribuirán al desarrollo de evaluaciones de inmunología mucosa.

<table><tbody><tr><td>A1R +</td> <td>Nikon</td><td></td><td>Microscopía de escaneo láser Comfocal</td></tr><tr><td>Carboxifluoresceína diacetato éster succinimidílico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>099-06571</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio</td><td>GIBCO</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Rojo de Texas &ndash; dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1863</td><td></td></tr></tbody></table>

observación microscópica de la dinámica de linfocitos en los parches de rat peyer

Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Los linfocitos ingenuos recirculan de la sangre a los tejidos linfoides bajo condición fisiológica y comúnmente se reconoce como un fenómeno importante en la inmunidad intestinal. El estroma de órganos linfoides secundarios, como los parches de Peyer (PPs) o los ganglios linfáticos mesentericos, es donde los linfocitos ingenuos detectan antígenos. Los linfocitos ingenuos circulan a través del torrente sanguíneo para llegar a ventules endoteliales altos, el portal de entrada en PPs. Se estima que algunos inmunomoduladores influyen en la migración de linfocitos, pero la evaluación precisa de la dinámica de microcirculación es muy difícil, y establecer un método para observar la migración de linfocitos in vivo puede contribuir a la clarificación de los mecanismos precisos. Refinamos el método de recolección de linfocitos del conducto linfático y observando la dinámica detallada de los linfocitos trópicos intestinales en los PPs de rata. Elegimos la microscopía de escaneo láser confocal para observar los PPs de rata in vivo y la grabamos usando fotografía de lapso de tiempo. Ahora podemos obtener imágenes claras que puedan contribuir al análisis de la dinámica de los linfocitos.

Recolección de linfocitos de la linfa Para preparar la rata para la canulación del conducto torácico, haga una incisión en el tenso conducto torácico como se muestra en la Figura 1 y luego mantenga a la rata en la jaula de un Bollman como se muestra en la Figura 2.
Cuando los linfocitos están bien recogidos, podemos obtener alrededor de 20 ml/6 h de líquido linfático que contiene aproximadamente 107~ 10<...

Aquí, describimos un método preciso para recoger linfocitos de conductos torácicos y observar la migración de linfocitos trópicos intestinales en parches de rata Peyer durante 3 horas utilizando fotografía de lapso de tiempo. Esta técnica puede aclarar cómo la dinámica de los linfocitos se ve afectada en condiciones inflamatorias.

Observación microscópica de la dinámica de linfocitos en los parches de Rat Peyer

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

Este protocolo permite realizar la observación in vivo de la dinámica de los linfocitos en los parches de Peyer de rata durante largos periodos de tiempo. Se puede utilizar para explorar los efectos de varias pistas en los linfocitos in vivo. La demostración del procedimiento estará a cargo de Kazuki Horiuchi, un médico de mi laboratorio.Comience formando un tubo de canulación y sumérjalo en agua caliente, luego dóblelo y fíjelo a una tabla de plástico con cinta adhesiva. Después de anestesiar a una rata Wistar macho y quitarle el pelo del abdomen, realice una incisión horizontal con tijeras quirúrgicas desde la línea media hasta la zona subcostal izquierda, teniendo cuidado de no dañar los vasos sanguíneos del peritoneo parietal. Envuelva el intestino con una gasa húmeda y muévala suavemente hacia el exterior del cuerpo para revelar los órganos retroperitoneales.Inserte una muesca entre los músculos erectores de la columna vertebral y el tejido adiposo con unas tijeras quirúrgicas, luego sepárelos sin rodeos con los dedos. Retire con cuidado el tejido conectivo alrededor del conducto torácico. Exponga el conducto torácico desde justo debajo de la crus izquierda del diafragma cauda

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Las células M en un folículo especializada asociada a epitelio que recubre las placas de Peyer juegan un papel importante para el inmunovigilancia la mucosa en el intestino de tejido linfoide asociado. Aquí se describe el método de evaluación para transcitosis bacteriana por las células...

La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M

Los recientes avances en microscopía de dos fotones han permitido en tiempo...

Imagen intravital del nodo linfático poplíteo ratón

En este video, demostramos el aislamiento de linfocitos de un parche de Peyer de ratón cosechado. Los linfocitos aislados se pueden utilizar para análisis posteriores.

Aislamiento de linfocitos de un parche de Peyer de ratón

Existe un creciente interés en la comprensión de las funciones inmunológicas de subpoblaciones específicas de células en las placas de Peyer (PP), los sitios primarios de inducción de los tejidos linfoides asociados al intestino. Aquí resumimos los protocolos paralelos para preparar PP preparativos de célula única para el análisis de citometría de flujo y cryosections PP para inmunoticción.

Aislar y inmunoticción Los linfocitos y las células dendríticas de las placas de Peyer murinas de

Aquí presentamos un protocolo optimizado y detallado para la inmunotinción doble en secciones de tejido del sistema nervioso central (SNC) y de los ganglios linfáticos periféricos (LN) de rata fijadas en formol, incluidas en parafina.

El análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido

De alta resolución de imagen intravital con mejor contraste de hasta 120 m de profundidad en los ganglios linfáticos de ratones adultos se consigue modular espacialmente el patrón de excitación de un multi-focal del microscopio de dos fotones. En 100 m de profundidad se midió resoluciones de 487 nm (laterales) y 551 nm (axial), eludiendo así los límites de dispersión y difracción.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

La inmunidad adaptativa está controlada por 'sinapsis inmunológicas' dinámicas formadas entre las células T y las células presentadoras de antígenos. Este protocolo describe métodos para investigar las células endoteliales, tanto como APC fisiológicas poco estudiadas como un nuevo tipo de "modelo de APC celular plana".

Un modelo de la célula endotelial planar for Imaging inmunológica Synapse Dinámica

Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

En este estudio, presentamos un novedoso y eficaz protocolo para el aislamiento de los linfocitos de las placas de Peyer (PP), que pueden utilizarse posteriormente para ensayos funcionales en vivo y en vitro como en estudios de citometría de flujo folicular t helper y células del centro germinal B.

Desentrañando los jugadores claves de inmunidad Humoral: avanzada y Protocolo de aislamiento de linfocitos de parches Murine placas de Peyer

Aquí, demostramos los métodos de cuantificación en vivo de la salida de leucocitos de ingenuo, inflamado y mala piel murina. Realizamos una comparación directa de dos modelos: photoconversion de aplicación y en situ FITC transdérmica. Además, demostramos la utilidad de photoconversion para el seguimiento de salida de leucocitos de tumores cutáneos.

Cuantificación de leucocitos salida vía los recipientes linfáticos de la piel murina y tumores

Aquí presentamos un protocolo utilizado para realizar experimentos de microscopía de fuerza de tracción en células B. Describimos la preparación de geles blandos de poliacrilamida y su funcionalización, así como la adquisición de datos en el microscopio y un resumen del análisis de datos.

Microscopía de fuerza de tracción para estudiar la activación de linfocitos B

Aprende a observar la dinámica de linfocitos en parches de Peyer de ratas mediante microscopía confocal y fotografía time-lapse. Este método permite estudiar la migración celular in vivo durante tres horas en condiciones inflamatorias.

Observación microscópica de la dinámica de linfocitos en los parches de Rat Peyer

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