Fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano para modelos de ratón de diseminación pleural

Este método se puede utilizar para evaluar los efectos terapéuticos de NIR-PIT en tumores torácicos en un modelo tumoral clínicamente relevante. Los procedimientos NIR-PIT que utilizan el modelo de cáncer diseminado pleural son fáciles de entender y realizar. Para configurar un modelo de diseminación de ratón, use espuma de poliestireno para hacer un tapón y desinfecte con etanol al 70%.

Fije la aguja al tapón con la punta que se extiende cinco milímetros fuera del tapón. Doble la punta de una aguja calibre 30 con pórceps limpios o contra un objeto duro limpiado con etanol al 70%, y llene una jeringa con una vez 10 a las seis células tumorales objetivo en 100 microlitros de PBS. Confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedaleo en un ratón desnudo anestesiado, de 19 a 21 gramos, de ocho a 12 semanas de edad, hembra, homocigoto, desnudo atímico.

Inserte la aguja en el pecho a través del espacio intercostal, moviendo la aguja hacia arriba y hacia abajo para evitar el contacto con las costillas. Cuando la punta haya pasado a través del espacio intercostal, coloque la jeringa de modo que se presione contra el ratón e inyecte todo el volumen de células objetivo. Después de la inyección, enrolle el ratón dos o tres veces para extender las células por toda la cavidad torácica, y devuelva el ratón a su jaula con monitoreo hasta la recuperación completa.

24 horas después de la inyección celular y todos los días a partir de entonces, inyecte a los ratones anestesiados con células tumorales inyectadas con 200 microlitros de 15 miligramos por mililitro de D-luciferina. Después de 10 minutos, coloque los ratones en un imager de bioluminiscencia y abra el Panel de control de adquisición en el software del imager. Seleccione Luminiscente, Fotografía y Superposición.

Establezca el tiempo de exposición en Automático, el Binning en Pequeño, el F/Stop en uno para Luminiscente y en ocho para Fotografía, y el Campo de Visión en C.Click Adquirir para obtener la imagen de la bioluminiscencia. Establezca el formato de visualización en Radianes y seleccione el círculo en las Herramientas de región de interés del panel Paleta de herramientas. Haga clic en Medir regiones de interés para medir la intensidad bioluminiscente de la superficie y utilice Configurar medición para seleccionar los valores relevantes para el experimento.

Exporte esta tabla de datos como un archivo csv. A continuación, utilice los valores de flujo total para la cuantificación de la intensidad bioluminiscente en el archivo. Antes de realizar la fototerapia de infrarrojo cercano de los ratones inyectados por tumor, use un medidor de potencia para medir la dosis de luz de un láser de longitud de onda de 690 nanómetros y ajuste la salida a 100 milivatios por centímetro cuadrado.

24 horas antes del tratamiento, se inyectaron por vía intravenosa 100 microgramos de fotosensibilizador de anticuerpos conjugados en 50 a 200 microlitros de PBS a través de la vena de la cola del animal inyectado por tumor. El día del tratamiento de fototerapia, coloque el ratón anestesiado conjugado-inyectado, cargado de tumores en posición supina, y proteja los sitios no objetivo con papel de aluminio. Cuando se hayan colocado todos los escudos, use un láser de 100 julios por centímetro cuadrado para irradiar la cavidad torácica con luz infrarroja cercana durante aproximadamente 30 segundos.

Cuando la irradiación esté completa y el ratón se haya despertado, devuelva al animal a su jaula y mida la bioluminiscencia diariamente como se ha demostrado. En este análisis representativo, la conjugación del anticuerpo anti-podoplanina con IR700 fue confirmada por el análisis SDS-PAGE. Después de la inyección de células tumorales, se deben realizar imágenes de bioluminiscencia y tomografía por imágenes de luminiscencia difusa para determinar qué ratones expresan suficiente actividad de luciferasa en la cavidad torácica para su posterior estudio.

En el quinto día después de la inyección, los ratones inyectados con anticuerpos anti-podoplanina IR700 demuestran una alta fluorescencia IR700 y actividad luciferasa en tumores torácicos, lo que indica que el anticuerpo conjugado IR700 inyectado por vía intravenosa llega a los sitios tumorales pleurales diseminados. En particular, los ratones diseminados pleurales tratados con fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano demuestran una disminución de la actividad de la luciferasa, mientras que las unidades de luz relativas en el grupo de control exhiben un aumento gradual de la intensidad. Dado que la energía de irradiación NIR requerida depende de la línea celular y los anticuerpos, asegúrese de verificar las condiciones con anticipación in vitro.