Name: Fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano para modelos de ratón de diseminación pleural (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Aprende a evaluar los efectos antitumorales de la fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano en modelos de ratón con cáncer de pulmón diseminado pleural utilizando imagen de bioluminiscencia.

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Ninguno

Todos los experimentos in vivo se realizaron de conformidad con la Guía para el cuidado y uso de los recursos de animales de laboratorio del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Nagoya (aprobación # 2017-29438, # 2018-30096, # 2019-31234, # 2020-20104). Ratones desnudos homocigotos homocigotos de seis semanas de edad fueron comprados y mantenidos en el Centro de Animales de la Universidad de Nagoya. Al realizar el procedimiento en ratones, fueron anestesiados con isoflurano (introducción: 4-5%, mantenimiento 2-3%); la pata fue presionada con pinzas para confirmar la profundidad de la anestesia.
1. Conjugación de IR700 con mAb
<ol><li>Incubar mAb (1 mg, 6,8 nmol) con éster IR700 NHS (66,8 mg, 34,2 nmol, 5 mmol/L en DMSO) en 0,1 mol/L Na2HPO4 (pH 8,6) a 15-25 °C durante 1 h.</li>
	<li>Purifique la mezcla usando una columna (por ejemplo, Sephadex). Prepare y lave la columna con PBS. Luego, aplique la mezcla sobre la columna y recoja la gota, que contiene el anticuerpo conjugado IR700 purificado. Este anticuerpo conjugado IR700 se conoce como el conjugado fotosensibilizador de anticuerpos (APC).</li>
	<li>Mida la proteína y la concentración de IR700 en el APC.<ol>
<li>Prepare curvas de calibración para proteínas e IR700 utilizando un espectrofotómetro.</li>
		<li>Mezcle las concentraciones estándar de albúmina con un kit de ensayo de proteínas siguiendo el protocolo del kit (consulte la Tabla de materiales,tinción de proteínas Coomassie Brilliant Blue (CBB)). Mida la absorbancia de la albúmina a una longitud de onda de 595 nm y trace la curva de calibración (una fórmula de aproximación lineal) para la proteína utilizando la siguiente ecuación: y = ax + b (x: concentración, y: absorbancia).</li>
		<li>Obtenga curvas de calibración para IR700 con absorción a 690 nm utilizando el mismo procedimiento. La concentración estándar de IR700 se recomienda a 0.1-5 μM (0.1954-9.77 μg/mL).</li>
		<li>Mida la concentración de proteína y la concentración de IR700 en el APC utilizando una curva de calibración [x = (y-b)/a (x: concentración, y: absorbancia)].</li>
		<li>Determinar el número de colorantes IR700 unidos por mAb con los resultados de la concentración molar. NOTA: Es importante determinar el número óptimo de conjugación de moléculas IR700 por molécula mAb. En general, aproximadamente tres moléculas IR700 unidas en una sola molécula mAb serían efectivas tanto in vitro como in vivo. Muchos IR700 unidos por anticuerpo (por ejemplo, seis) hacen que sea más fácil quedar atrapado en el hígado durante los experimentos in vivo. La proporción de anticuerpos unidos a IR700 estaba en el rango de 1: 2-1: 4. La proporción de IR700 se redujo, si fue necesario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) como confirmación de la formación de un APC. Imagine el gel a 700 nm utilizando un imager fluorescente y manche la proteína en el gel utilizando un kit de tinción de proteínas siguiendo el protocolo del kit (consulte la Tabla de materiales,Tinción de proteínas CBB).</li>
</ol>2. Generación de un modelo de difusión pleural
<ol><li>Preparar células diana que expresan luciferasa y suspender 1,0 × 106 células diana en 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) NOTA: Las células cancerosas intratorácicas como el cáncer de pulmón y MPM son adecuadas como células diana. Las células que expresan luciferasa se prepararon a través de la transfección del gen de la luciferasa, y se confirmó una alta expresión de luciferasa después de > 10 pasajes celulares. Las células se cultivaron en un medio suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina (100 UI/ml) y estreptomicina (100 mg/ml). El número de células se ajustó de acuerdo con la tasa de crecimiento del tumor y el curso de tiempo del tratamiento (1.0. × 105-6.0 × 106 células / peso corporal).</li>
	<li>Prepare ratones desnudos homocigotos homocigotos hembra de 8-12 semanas de edad, con un peso corporal preferible de 19-21 g.</li>
	<li>Anestesiar ratones durante el procedimiento con isoflurano (introducción: 4-5%, mantenimiento 2-3%); presione la cola con pinzas para confirmar que no hay reacción.</li>
	<li>Haga un tapón con espuma de poliestireno y fije el tapón a la aguja de 30 G para que la punta permanezca a 5 mm para evitar lesiones pulmonares. Doble la punta de la aguja con fórceps limpios o presionándola contra un objeto duro limpiado con 70% de EtOH para evitar el neumotórax(Figura 1). PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no perforarse. Use forrceps para doblar la aguja. No sostenga el tapón cuando lo conecte a la aguja. Es más seguro pegar el tapón antes de llenar las células en la jeringa.</li>
	<li>Llene una jeringa (1 ml) con células diana y conecte una aguja de 30 G con un tapón.</li>
	<li>Desinfecte el pecho del animal con 70% de EtOH antes del procedimiento.</li>
	<li>Perfore una aguja en el pecho del ratón a través del espacio intercostal. Debido a la resistencia al golpear contra las costillas en ese momento, la punta de la aguja se movió hacia arriba y hacia abajo. Después de pasar por el espacio intercostal, presione la jeringa contra el ratón e inyecte 100 μL de células diana (Figura 2). NOTA: El ratón respira profundamente cuando la aguja entra correctamente en la cavidad torácica. Con la flexión de la punta de la aguja, se podría evitar el neumotórax y la inyección inadecuada de células en el pulmón. NOTA: Se recomienda la punción de la pared torácica derecha para evitar el riesgo de punción de la pared cardíaca.</li>
	<li>Enrolle el ratón 2-3 veces para extender las células por toda la cavidad torácica.</li>
	<li>Devuelva el ratón a una jaula limpia y caliente y monitoree hasta que sea ambulatorio. Después del procedimiento, el ratón se despertará de la anestesia y se comportará normalmente.</li>
</ol>3. Medición de la bioluminiscencia
NOTA: El software utilizado para la adquisición de datos se enumera en la Tabla de materiales.
<ol><li>Para confirmar la generación del modelo de diseminación pleural, evalúe las imágenes de bioluminiscencia todos los días después de inyectar las células en la cavidad torácica.</li>
	<li>Anestesiar ratones (paso 2.3) e inyectar por vía intraperitoneal D-luciferina (15 mg/mL, 200 μL).</li>
	<li>Asegúrese de que el ratón está respirando normalmente antes y después de la obtención de imágenes. Use un calentador si es necesario para prevenir la hipotermia durante la anestesia.</li>
	<li>Diez minutos después de la inyección, coloque al ratón en el equipo de medición de imágenes de bioluminiscencia (BLI). Para la adquisición de imágenes, abra el Panel de control de adquisición del software. Seleccione Luminiscente, Fotografíay Superposición (Figura 3).</li>
	<li>Establezca el tiempo de exposición como Automático. Establezca Binning como pequeño.</li>
	<li>Establezca f/stop como 1 para luminiscente y 8 para fotografía; f/stop controla la cantidad de luz recibida por el detector de dispositivos de acoplamiento cargado.</li>
	<li>Establezca el campo de visión como C.</li>
	<li>Una vez que la muestra del ratón esté lista para la obtención de imágenes, haga clic en Adquirir para la adquisición de imágenes. Se seleccionaron ratones con suficiente actividad luciferasa para estudios adicionales. NOTA: Un modelo de diseminación pleural adecuado muestra una fuerte luminiscencia en el sitio difuso en el tórax cuando se ve desde el lado ventral. Si las imágenes de BLI no se difunden en el tórax, y solo en el sitio de inyección, el tumor puede trasplantarse por vía subcutánea.</li>
	<li>Después de mostrar la imagen, establezca el formato de visualización en Radiance. Abra el panel Paleta de herramientas (Figura 4A).</li>
	<li>Seleccione Herramientas de ROI. Recomendamos usar el Círculo para variar el área bioluminiscente en las imágenes.</li>
	<li>Haga clic en Medir ROI para medir la intensidad bioluminiscente de la superficie (Figura 4B).</li>
	<li>Utilice Configurar medición en la esquina izquierda del panel de medición de ROI para seleccionar los valores/información necesarios. Exporte esta tabla de datos como un archivo .csv (Figura 4C).</li>
	<li>Utilice los valores de Flujo Total (p/s) como cuantificación de la intensidad bioluminiscente en el archivo de .csv.</li>
</ol>4. Tomografía por imágenes de luminiscencia difusa (DLIT)
NOTA: El software utilizado para la adquisición de datos se enumera en la Tabla de materiales.
<ol><li>Encienda el botón X-ray Armed.</li>
	<li>Anestesiar a los ratones (paso 2.3) y luego inyectar D-luciferina (15 mg / ml, 200 μL) por vía intraperitoneal en los ratones. Para disparar DLIT continuamente de 3.2 a 3.7, omita este paso.</li>
	<li>Diez minutos después de la inyección, coloque el ratón en el equipo BLI.</li>
	<li>Abra el Panel de control de adquisición del software. Seleccione Luminiscente, Fotografía, CT, Ratón estándary Superposición. Otros ajustes fueron los mismos que en 3.4-3.6(Figura 5A).</li>
	<li>Seleccione el Asistente para imágenes en el Panel de control de adquisición.</li>
	<li>Seleccione Bioluminiscencia y luego DLIT (Figura 5B).</li>
	<li>Seleccione Firefly como la longitud de onda a medir (Figura 5C).</li>
	<li>Establezca el sujeto de imagen como ratón,los parámetros de exposición como configuración automática,el campo de visión como C-13,4 cmy la altura del sujeto como 1,5 cm (Figura 5D).</li>
	<li>Empujar los rayos X se producirá cuando se energize. Adquirir.</li>
	<li>Abra los datos de la imagen secuencial de TC.</li>
	<li>Abra Topografía de superficie en la paleta de herramientas. Seleccione Mostrar (Figura 6A).</li>
	<li>Ajuste el umbral ya que la pantalla púrpura muestra solo la superficie del cuerpo (Figura 6B). A continuación, seleccione el ratón desnudo del sujeto y haga clic en generar superficie. Asegúrese de que el contorno del ratón se dibuja con precisión (Figura 6C).</li>
	<li>Abra la ficha Paleta de herramientas, Propiedades de reconstrucción 3D de DLIT. Seleccione Propiedades del tejido como tejido de ratón y Espectro de fuente como luciérfrica (Figura 6D). A continuación, abra la pestaña Analizar y confirme los datos para cada dato de longitud de onda seleccionado. Finalmente, haga clic en el botón Reconstruir (Figura 6E).</li>
	<li>Confirme la presencia de BLI en la cavidad torácica en la imagen DLIT configurada.</li>
</ol>5. NIR-PIT para el modelo de diseminación pleural in vivo
<ol><li>Mida la dosis de luz del láser de longitud de onda (NIR) de 690 nm con un medidor de potencia y ajuste la salida a 100 mW/cm2. NOTA: La luz láser es coherente con un tamaño de bobina preciso; por lo tanto, la energía de la luz apenas cambia independientemente de la distancia dentro de los 50 cm. Si hay muchos eventos adversos, como quemaduras, reduzca la salida dentro del rango de 40 mW / cm2.</li>
	<li>Limpie la cola con 70% de EtOH e inyecte APC por vía intravenosa (100 μg) a través de la vena de la cola 24 h antes de la irradiación NIR. Aplique presión en el lugar de la inyección para controlar el sangrado. NOTA: Ajuste el volumen de APC a 50-200 μL para inyección.</li>
	<li>Anestesiar a los ratones (paso 2.3) y acostarlos sobre su espalda. Para evitar la irradiación NIR al sitio no objetivo, proteja otros sitios con papel de aluminio(Figura 7A). Irradiar con luz NIR con un láser de 100 J/cm2; si el tumor se disemina de nuevo al vientre, la dosis de irradiación con luz NIR podría dividirse en múltiples direcciones(Figura 7B). NOTA: Ajuste la dosis a 30-150 J/cm2 dependiendo de los resultados in vitro y eventos adversos como quemaduras.</li>
	<li>Cuando la irradiación NIR esté completa y el ratón esté despierto, devuélvalo a la jaula.</li>
	<li>Observe el BLI y mida el ROI a lo largo del tiempo (todos los días) (ver 3.2-3.12).</li>
	<li>Para imágenes ex vivo, eutanasiar ratones con dióxido de carbono 24 h después de la inyección de APC, inmediatamente antes de la irradiación NIR.<ol>
<li>Para observar el interior del pecho del ratón, retire el tórax y corte las costillas y el esternón. Capture la imagen de fluorescencia (700 nm) junto con el control sin administración de APC. Luego, aplique D-luciferina (150 μg / ml) sobre el tórax expuesto, y se tomó el BLI (consulte 3.2-3.7).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Burley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+photoimmunotherapy+targeting+EGFR-Shedding+new+light+on+glioblastoma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Near-infrared photoimmunotherapy targeting EGFR-Shedding new light on glioblastoma treatment.</a> International Journal of Cancer. 142, 2363-2374 (2018).</li>
<li>Nagaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+using+a+fiber+optic+diffuser+for+treating+peritoneal+gastric+cancer+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Gastric+Cancer%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for treating peritoneal gastric cancer dissemination.</a> Gastric Cancer. 22, 463-472 (2019).</li>
<li>Nagaya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+near+infrared+photoimmunotherapy+using+a+fiber+optic+diffuser+for+peritoneal+dissemination+of+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Endoscopic near infrared photoimmunotherapy using a fiber optic diffuser for peritoneal dissemination of gastric cancer.</a> Cancer Science. 109, 1902-1908 (2018).</li>
<li>Harada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+photoimmunotherapy+with+galactosyl+serum+albumin+in+a+model+of+diffuse+peritoneal+disseminated+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Near-infrared photoimmunotherapy with galactosyl serum albumin in a model of diffuse peritoneal disseminated ovarian cancer.</a> Oncotarget. 7, 79408-79416 (2016).</li>
<li>Journals, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JNCI+Journal+of+the+National+Cancer+Institute+Way+to+Better+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">JNCI Journal of the National Cancer Institute Way to Better DNA.</a> Annals of Internal Medicine. 37, 1-9 (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

En este estudio, demostramos un método para medir el efecto terapéutico de NIR-PIT en el modelo de diseminación pleural de MPM. La muerte celular altamente selectiva se realizó con NIR-PIT; así, el tejido normal apenas se dañó23,24,25. Con este tipo de muerte celular selectiva, se demostró que NIR-PIT es seguro en los modelos diseminados9,26</s...

El cáncer sigue siendo una de las principales causas de mortalidad a pesar de décadas de investigación. Una razón es que la radioterapia y la quimioterapia son técnicas altamente invasivas, lo que puede limitar sus beneficios terapéuticos. Las terapias dirigidas celulares o moleculares, que son técnicas menos invasivas, están recibiendo una mayor atención. La fotoinmunoterapia es un método de tratamiento que mejora sinérgicamente el efecto terapéutico mediante la combinación de inmunoterapia y fototerapia. La inmunoterapia mejora la inmunidad tumoral al aumentar la inmunogenicidad del microambiente tumoral y reducir la supresión inmunorreguladora, lo que resulta en la destrucción de tumores en el cuerpo. La fototerapia destruye los tumores primarios con una combinación de fotosensibilizadores y rayos de luz, y los antígenos específicos del tumor liberados de las células tumorales mejoran la inmunidad tumoral. Los tumores se pueden tratar selectivamente con fotosensibilizadores, ya que son específicos y selectivos para las células diana. La modalidad de fototerapia incluye terapia fotodinámica (PDT), terapia fototérmica (PTT) y terapias basadas en fotoquímica1.
La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es un método recientemente desarrollado de fototerapia antitumoral que combina la terapia basada en fotoquímicos y la inmunoterapia1,2. NIR-PIT es una terapia dirigida molecularmente que se dirige a moléculas específicas de la superficie celular a través de la conjugación de un colorante de ftalocianina de silicio del infrarrojo cercano, IRdye 700DX (IR700), a un anticuerpo monoclonal (mAb). La membrana celular de la célula diana se destruye tras la irradiación con luz NIR (690 nm)3.
El concepto de usar terapia de luz dirigida mediante la combinación de fotosensibilizadores y anticuerpos convencionales o PDT dirigida tiene más de tres décadas de antigüedad4,5. Estudios previos han intentado dirigirse a los agentes PDT convencionales conjudicándolos con anticuerpos. Sin embargo, hubo un éxito limitado porque estos conjugados quedaron atrapados en el hígado, debido a la hidrofobicidad de los fotosensibilizadores6,7. Además, el mecanismo de NIR-PIT es completamente diferente del de la PDT convencional. Los fotosensibilizadores convencionales generan estrés oxidativo que resulta de una conversión de energía que absorbe la energía de la luz, se disloca a un estado excitado, hace la transición al estado fundamental y causa apoptosis. Sin embargo, NIR-PIT causa necrosis rápida al destruir directamente la membrana celular al agregar fotosensibilizadores en la membrana a través de una reacción fotoquímica8. NIR-PIT es superior a la PDT dirigida convencional en muchos sentidos. Los fotosensibilidades convencionales tienen bajos coeficientes de extinción, lo que requiere la unión de un gran número de fotosensibilizadores a una sola molécula de anticuerpo, lo que podría reducir la afinidad de unión. La mayoría de los fotosensibilidades convencionales son hidrófobos, lo que dificulta la unión de los fotosensibilizadores a los anticuerpos sin comprometer su inmunorreactividad o la acumulación de dianas in vivo. Los fotosensibilizadores convencionales suelen absorber la luz en el rango visible, reduciendo la penetración del tejido.
Se han reportado varios estudios sobre NIR-PIT dirigidos a tumores intratorácicos como el cáncer de pulmón y las células del mesotelioma pleural maligno (MPM)9,10,11, 12,13,14,15,16,17. Sin embargo, solo unos pocos informes han descrito la eficacia de NIR-PIT en MPM diseminada pleural o cáncer de pulmón modelos9,10,11,12. Se cree que los modelos de xenoinjerto tumoral subcutáneo son modelos tumorales estándar y actualmente se utilizan ampliamente para evaluar los efectos antitumorales de las nuevas terapias18. Sin embargo, el microambiente tumoral subcutáneo no es permisivo para el desarrollo de una estructura tisular adecuada o una condición que recapitula adecuadamente un verdadero fenotipo maligno19,20,21,22. Idealmente, se deben establecer modelos de enfermedades ortotópicas para una evaluación más precisa de los efectos antitumorales.
Aquí, demostramos un método de evaluación de la eficacia en un modelo de ratón de cáncer de pulmón diseminado pleural, que fue tratado con NIR-PIT. Un modelo de ratón de diseminación pleural se genera inyectando células tumorales en la cavidad torácica y se confirma utilizando luminiscencia de luciferasa. El ratón fue tratado con una inyección intravenosa de mAb conjugada con IR700 e irradiación NIR al tórax. El efecto terapéutico se evaluó mediante luminiscencia de luciferasa.

<table><tbody><tr><td>0.25w/v% Tripsina-1mmol/l EDTA 4Na Solución con Rojo de Fenol</td><td>Wako</td><td>209-016941</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td>para experimento con ratones</td></tr><tr><td>Aguja 30G</td><td>Nipro</td><td>1907613</td><td>para ratón</td></tr><tr><td>experimento BALB/cSlc-nu/nu</td><td>Japan SLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collidal Blue Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td>uso para tinción de proteínas en gel</td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Plus</td> ensayo de proteínas <td>Thermo Fisher Scientific Inc (Waltham, MA, EE. UU.)</td><td>PI-23200</td><td>para medir la concentración de APC</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Wako</td><td>043-07216</td><td>uso para la conjugación de IR700</td></tr><tr><td>D-luciferina (sal de potasio)</td><td>Cayman Chemical</td><td>14681</td><td>para imágenes de bioluminiscencia y DLIT</td></tr><tr><td>GraphPad Prism7</td><td>Software GraphPad</td><td>para análisis estadístico</td>Image Studio Li-Cor Biosciences para el análisis de imagen fluorescente de 700 nm IRDye 700DX Ester Infrared Dye LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)929-70011 isoflurano Wako 095-06573 para ratones anestesia IVIS Spectrum CT PerkinElmer para captura <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> imagen bioluminiscente y DLIT</td></tr><tr><td>Living Image</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>para el análisis de imágenes bioluminiscentes y DLIT</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, EE. UU.)</td> <td>S9763</td><td>uso para la conjugación de IR700</td></tr><tr><td>Láser NIR</td><td>Changchun Tecnología de optoelectrónica de New Industries</td><td>MRL-III-690R</td><td>para irradiación NIR</td></tr><tr><td>Novex WedgeWell 4 a 20%, Tris-Glycine, 1,0 mm, Mini Gel de Proteínas, 12 pocillos</td><td>Invitrogen</td><td>XP04202BOX</td><td>uso para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (x4)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>uso para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Medidor de potencia óptica</td><td>Thorlabs (Newton, NJ, EE. UU.)</td><td>PM100</td><td>para medir la salida del láser NIR&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS(-)</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Pearl Trilogy sistema de imagen</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>para la captura de imágenes fluorescentes</td><td></td> de 700 nm</tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina (x100)</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>Clorhidrato de puromicina</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113803</td><td>para la transfección de luciferasa</td></tr><tr><td>RediFect Red-Fluc-Puromycin Lentiviral Prtículos</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS960002</td><td>para la transfección de luciferasa</td></tr><tr><td>RPMI-1640 con L-glutamina y Phenol Red</td><td>Wako</td><td>189-02025</td><td>para cultivo celular</td></tr><tr><td>Sephadex G25 columna (PD-10)&nbsp;</td><td>GE Healthcare (Piscataway, NJ, EE. UU.)</td><td>17-0851-01</td><td>uso para la conjugación de IR700</td></tr><tr><td>UV-1900i</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>para medir la concentración de APC</td></tr></tbody></table>

fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano para modelos de ratón de diseminación pleural

Near Infrared Photoimmunotherapy for Mouse Models of Pleural Dissemination

La eficacia de la fotoinmunoterapia se puede evaluar con mayor precisión con un modelo de ratón ortotópico que con uno subcutáneo. Se puede utilizar un modelo de diseminación pleural para la evaluación de métodos de tratamiento para enfermedades intratorácicas como el cáncer de pulmón o el mesotelioma pleural maligno.
La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es una estrategia de tratamiento del cáncer desarrollada recientemente que combina la especificidad de los anticuerpos dirigidos al tumor con la toxicidad causada por un fotoabsorbente (IR700Dye) después de la exposición a la luz NIR. La eficacia de NIR-PIT se ha reportado usando varios anticuerpos; sin embargo, sólo unos pocos informes han demostrado el efecto terapéutico de esta estrategia en un modelo ortotópico. En el presente estudio, demostramos un ejemplo de evaluación de la eficacia del modelo de cáncer de pulmón diseminado pleural, que fue tratado con NIR-PIT.

El anticuerpo anti-podoplanina NZ-1 se conjudicó con IR700 para generar NZ-1-IR700. Confirmamos la unión de NZ-1 e IR700 en un SDS-PAGE (Figura 8). La expresión de luciferasa H2373 (H2373-luc) se preparó transfectando células malignas de mesotelioma (H2373) con un gen luciferasa10.
Anestesiamos ratones desnudos homocigómicos hembra de 8-12 semanas de edad e inyectamos 1 × 105 células H2373-luc en la cavidad torácica. El día de la...

La fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT) es una estrategia terapéutica emergente contra el cáncer que utiliza un conjugado anticuerpo-fotoabsorbente (IR700Dye) y luz NIR para destruir las células cancerosas. Aquí, presentamos un método para evaluar el efecto antitumoral de NIR-PIT en un modelo de ratón de cáncer de pulmón diseminado pleural y mesotelioma pleural maligno utilizando imágenes de bioluminiscencia.

Fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano para modelos de ratón de diseminación pleural

The efficacy of photoimmunotherapy can be evaluated more accurately with an orthotopic mouse model than with a subcutaneous one. A pleural dissemination ...

Este método se puede utilizar para evaluar los efectos terapéuticos de NIR-PIT en tumores torácicos en un modelo tumoral clínicamente relevante. Los procedimientos NIR-PIT que utilizan el modelo de cáncer diseminado pleural son fáciles de entender y realizar. Para configurar un modelo de diseminación de ratón, use espuma de poliestireno para hacer un tapón y desinfecte con etanol al 70%.Fije la aguja al tapón con la punta que se extiende cinco milímetros fuera del tapón. Doble la punta de una aguja calibre 30 con pórceps limpios o contra un objeto duro limpiado con etanol al 70%, y llene una jeringa con una vez 10 a las seis células tumorales objetivo en 100 microlitros de PBS. Confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedaleo en un ratón desnudo anestesiado, de 19 a 21 gramos, de ocho a 12 semanas de edad, hembra, homocigoto, desnudo atímico.Inserte la aguja en el pecho a través del espacio intercostal, moviendo la aguja hacia arriba y hacia abajo para evitar el contacto con las costillas. Cuando la punta haya pasado a través del espacio intercostal, coloque la jeringa de modo que se presione contra el ratón e inyecte todo el volumen de células objetivo. Después de la inyección, enrolle el ratón dos o tres veces para extender las células por toda la cavidad torácica, y devuelva el ratón a su jaula con monitoreo hasta la recuperación completa.24 horas después de la inyección celular y todos los días a partir de entonces, inyecte a los ratones anestesiados con células tumorales inyectadas con 200 microlitros de 15 miligramos por mililitro de D-luciferina. Después de 10 minutos, coloque los ratones en un imager de bioluminiscencia y abra el Panel de control de adquisición en el software del imager. Seleccione Luminiscente, Fotografía y Superposición.Establezca el tiempo de exposición en Automático, el Binning en Pequeño, el F/Stop en uno para Luminiscente y en ocho para Fotografía, y el Campo de Visión en C.Click Adquirir para obtener la imagen de la bioluminiscencia. Establezca el formato de visualización en Radianes y seleccione el círculo en las Herramientas de región de interés del panel Paleta de herramientas. Haga clic en Medir regiones de interés para medir la intensidad bioluminiscente de la superficie y utilice Configurar medición para seleccionar los valores relevantes para el experimento.Exporte esta tabla de datos como un archivo csv. A continuación, utilice los valores de flujo total para la cuantificación de la intensidad bioluminiscente en el archivo. Antes de realizar la fototerapia de infrarrojo cercano de los ratones inyectados por tumor, use un medidor de potencia para medir la dosis de luz de un láser de longitud de onda de 690 nanómetros y ajuste la salida a 100 milivatios por centímetro cuadrado.24 horas antes del tratamiento, se inyectaron por vía intravenosa 100 microgramos de fotosensibilizador de anticuerpos conjugados en 50 a 200 microlitros de PBS a través de la vena de la cola del animal inyectado por tumor. El día del tratamiento de fototerapia, coloque el ratón anestesiado conjugado-inyectado, cargado de tumores en posición supina, y proteja los sitios no objetivo con papel de aluminio. Cuando se hayan colocado todos los escudos, use un láser de 100 julios por centímetro cuadrado para irradiar la cavidad torácica con luz infrarroja cercana durante aproximadamente 30 segundos.Cuando la irradiación esté completa y el ratón se haya despertado, devuelva al animal a su jaula y mida la bioluminiscencia diariamente como se ha demostrado. En este análisis representativo, la conjugación del anticuerpo anti-podoplanina con IR700 fue confirmada por el análisis SDS-PAGE. Después de la inyección de células tumorales, se deben realizar imágenes de bioluminiscencia y tomografía por imágenes de luminiscencia difusa para determinar qué ratones expresan suficiente actividad de luciferasa en la cavidad torácica para su posterior estudio.En el quinto día después de la inyección, los ratones inyectados con anticuerpos anti-podoplanina IR700 demuestran una alta fluorescencia IR700 y actividad luciferasa en tumores torácicos, lo que indica que el anticuerpo conjugado IR700 inyectado por vía intravenosa llega a los sitios tumorales pleurales diseminados. En particular, los ratones diseminados pleurales tratados con fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano demuestran una disminución de la actividad de la luciferasa, mientras que las unidades de luz relativas en el grupo de control exhiben un aumento gradual de la intensidad. Dado que la energía de irradiación NIR requerida depende de la línea celular y los anticuerpos, asegúrese de verificar las condiciones con anticipación in vitro.

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Investigación

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Medicina

La terapia fotodinámica (TFD) es un método no invasivo y no quirúrgico para el tratamiento del cáncer de pulmón. Los fotosensibilizadores se acumulan selectivamente en el tejido tumoral y provocan la muerte de las células tumorales en presencia de oxígeno y la longitud de onda adecuada de la luz. Este vídeo describe el análisis de eficacia antitumoral in vivo utilizando fotosensibilizadores que contienen nanopartículas en un ratón portador de tumores, para determinar el potencial fototóxico del...

Análisis de eficacia antitumoral in vivo de PDT: una técnica para determinar el potencial fototóxico de un fotosensibilizador en ratones portadores de tumores

Este video muestra un método para generar un modelo de ratón de diseminación pleural mediante la inyección de suspensión de células de cáncer de pulmón en la cavidad torácica de un ratón inmunodeficiente.

Establecimiento de un modelo murino de cáncer de pulmón pleural diseminado

Este video muestra una técnica de fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano para tratar el cáncer de pulmón en un modelo de ratón diseñado que exhibe células tumorales que expresan luciferasa. Al inyectar un conjugado anticuerpo-fotosensibilizador (APC) que se une a antígenos específicos en las células tumorales, el ratón se expone a la radiación infrarroja cercana, lo que induce cambios fotoquímicos en la APC y conduce a la muerte necrótica de las células tumorales unidas. La eficacia del...

Una técnica de fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano para tratar el cáncer de pulmón en un modelo murino

Este video muestra una técnica para eliminar selectivamente células específicas de un cultivo celular 3D mixto a través de fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano. En este método, las células objetivo se identifican con precisión utilizando un anticuerpo conjugado con un fotoabsorbente NIR. La irradiación posterior con luz infrarroja induce la muerte celular, eliminando eficazmente las células objetivo del cultivo 3D.

Fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano para la eliminación de células dirigidas en cultivos 3D mixtos

Eliminar células específicas sin dañar otras células es extremadamente difícil, especialmente en tejido establecido, sin embargo, existe una necesidad urgente de un método de eliminación celular en el campo de la ingeniería de tejidos. Aquí, presentamos un método para la eliminación de células específicas a partir de un cultivo celular mixto en 3D utilizando fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT).

La eliminación selectiva de células de Cultura mezclada 3D mediante técnica de infrarrojo cercano Photoimmunotherapy

Investigación sobre las estrategias de tratamiento de los teratomas derivados de células madre pluripotentes es importante para la traducción clínica de la terapia de células madre. Aquí, describimos un protocolo para, en primer lugar, generar derivados de células madre de los teratomas en ratones y, luego, selectivamente objetivo y tratar estos tumores in vivo utilizando un irradiador de pequeños animales.

Tratamiento específicos y selectivo de los Teratomas derivados de células madre pluripotentes utilizando radiación de haz externo en un modelo animal de pequeño

Este artículo describe la generación de un modelo de ratón ortotópico de mesotelioma pleural humano mediante la implantación de células de mesotelioma H2052/484 en la cavidad pleural de ratones atímicos inmunocomprometidos. El monitoreo longitudinal del desarrollo de tumores intrapleurales se evaluó mediante tomografía multimodal no invasiva [18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose positron emission tomography and computed tomography.

Implantación y monitorización por PET/CT de un modelo ortotópico de mesotelioma pleural humano en ratones atímicos

Este protocolo presenta un conjunto de experimentos adoptados para la evaluación de péptidos anticancerígenos fotoconmutables, que pueden ser utilizados en el cribado preclínico de dichos compuestos. Esto incluye la evaluación de citotoxicidad en cultivos celulares 2D y 3D, la evaluación de la eficiencia de fotoisomerización ex vivo (tejido modelo) y la eficacia in vivo .

Evaluación in vitro e in vivo de compuestos biológicamente activos fotocontrolados: posibles candidatos a fármacos para la fotofarmacología del cáncer

Presentamos un método para estudiar la rediseminación de células tumorales a partir de metástasis pulmonares que implica un protocolo quirúrgico para la fotoconversión selectiva de metástasis pulmonares, seguido de la identificación de células tumorales rediseminadas en órganos terciarios.

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La traslación de los hallazgos de la microscopía intravital se ve desafiada por su poca profundidad de penetración en el tejido. Aquí describimos un modelo de ratón de cámara de ventana dorsal que permite el registro conjunto de la microscopía intravital y las modalidades de imagen clínicamente aplicables (p. ej., TC, RM) para la correlación espacial directa, lo que podría agilizar la traducción clínica de los hallazgos de la microscopía intravital.

Un modelo de ratón tumoral con cámara de ventana de pliegue cutáneo dorsal para la microscopía intravital combinada y la resonancia magnética en la investigación traslacional del cáncer

Este protocolo presenta las técnicas y la metodología necesarias para la terapia hipertérmica dirigida en modelos de tumores sólidos. El enfoque aprovecha la conversión fototérmica de la luz infrarroja cercana mediante nanovarillas de oro inyectadas intratumoralmente para inducir un calentamiento localizado dentro del microambiente tumoral.

Inducción de hipertermia leve dirigida en modelos tumorales murinos mediante conversión fototérmica de luz infrarroja cercana mediante nanovarillas de oro intratumorales

Aprende a evaluar los efectos antitumorales de la fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano en modelos de ratón con cáncer de pulmón diseminado pleural utilizando imagen de bioluminiscencia.

Fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano para modelos de ratón de diseminación pleural

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