Una Tubería Bioinformática Para La Investigación De La Evolución Molecular Y La Expresión Génica Usando RNA-seq
28 de mayo de 2021
El propósito de este protocolo es investigar la evolución y expresión de genes candidatos utilizando datos de secuenciación de ARN.
Este protocolo describe los pasos bioinformáticos para investigar la evolución molecular y la expresión de genes candidatos. Aquí proporcionamos instrucciones exhaustivas para que cualquier persona con una experiencia bioinformática mínima pueda ejecutar este protocolo. Esta tubería se puede aplicar a cualquier organismo y a cualquier familia de genes.
Un problema común al hacer bioinformática es el error de los scripts de shell. Al intentar este protocolo, asegúrese de tener el software más actualizado, lea los archivos de error y revise el manual cuidadosamente. Para empezar, inicie sesión en la cuenta de clúster de equipos en una ventana de aplicación de terminal o PuTTY.
En el terminal, descargue SRA Toolkit versión 2.8.1 usando Wget, luego termine de instalar el programa. Busque ncbi para el número de acceso SRA para las muestras deseadas, después obtenga los datos de la secuencia del ARN en la ventana terminal. Obtener dos archivos FASTQ para el tipo de archivos de extremo emparejado.
Encuentre el genoma de referencia en línea si existe uno. Para obtener un ensamblado de referencia, escriba wget en la ventana de terminal y pegue la dirección del vínculo. Si está disponible, copie también el archivo GTF y el archivo FASTA de proteínas para el genoma de referencia.
Indexe el genoma, luego mapee las lecturas y calcule la expresión para cada muestra. Cambie el nombre del archivo de resultados a algo descriptivo y genere una matriz de todos los recuentos. Abra una ventana del navegador de Internet y vaya a NCBI GenBank.
En la barra de búsqueda, escriba el nombre del gen de interés y el nombre de las especies estrechamente relacionadas que han sido secuenciadas. A la izquierda de la barra de búsqueda, seleccione Proteína y, a continuación, haga clic en Buscar. Extraiga las secuencias haciendo clic en Enviar a y, a continuación, seleccione Archivo.
En Formato, seleccione FASTA y, a continuación, haga clic en Crear archivo. Mueva el archivo FASTA de homólogos al clúster de equipos mediante una ventana de terminal local o FileZilla. A continuación, busque genes candidatos usando BLAST+En el clúster de computadoras, haga una base de datos BLAST a partir del genoma o la proteína traducida por transcriptoma, FASTA.
BLAST las secuencias de genes homólogos de NCBI a la base de datos de las especies de interés, a continuación, ver el archivo de salida utilizando el comando más. Copie los identificadores de genes únicos de las especies de interés en un nuevo archivo de texto. Extraiga las secuencias de genes candidatos.
Para confirmar la anotación de genes mediante Reciprocal BLAST, vaya a la herramienta de búsqueda de alineación local BLAST, seleccione BLASTP, luego pegue las secuencias candidatas, seleccione la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes y haga clic en BLAST. Abra MEGA, haga clic en Alinear, luego en Editar alineación de compilación, seleccione Crear una nueva alineación y haga clic en Aceptar. Seleccione Proteína. Cuando se abra la ventana Alineación, haga clic en Editar.
Haga clic en Insertar secuencias desde archivo y seleccione el FASTA con secuencias de proteínas de genes candidatos y homólogos probables. Seleccione Todas las secuencias. Encuentra el símbolo del brazo y pasa el cursor sobre él.
Debe decir alinear secuencias usando algoritmo muscular. Haga clic en el símbolo del brazo y, a continuación, haga clic en Alinear proteína para alinear las secuencias Editar parámetros o haga clic en Aceptar para utilizar los parámetros predeterminados. Este protocolo se aplicó a los tejidos de Hydra vulgaris que es un invertebrado de agua dulce que pertenece al filo Cnidaria.
Los genes opsinos fueron investigados para obtener información sobre la evolución de los ojos y la detección de luz en animales. Las secuencias para los genes opsina-relacionados de H.vulgaris y de otras especies fueron extraídas en un archivo de FASTA del NCBI GenBank. Los genes de opsina se alinearon en MEGA, lo que permite identificar las opsinas de Hydra a las que les faltaba un aminoácido de lisina conservado necesario para unirse a una molécula sensible a la luz.
Se generó un árbol de máxima verosimilitud utilizando secuencias de opsina de Hydra vulgaris y otras especies. La filogenia sugiere que los genes de opsina están evolucionando por duplicaciones específicas del linaje en cnidarios, y potencialmente por duplicación en tándem en H.vulgaris. A continuación, se realizó un análisis de expresión diferencial en edgeR para investigar la expresión absoluta de los genes de opsina.
Para determinar si una o más opsinas están reguladas en el hipostoma, o la cabeza, se realizaron comparaciones en pares de hipostoma versus la columna corporal, la zona en ciernes, el pie y los tentáculos. Fue encontrado que 1, 774 transcripciones fueron expresadas diferenciado entre el hypostome y la columna del cuerpo. Se determinaron los genes que se regularon a través de comparaciones múltiples, y se realizó un enriquecimiento funcional en Blast2GO.
Finalmente, se investigó la expresión absoluta de los genes de la opsina en diferentes tejidos durante diferentes etapas de la brotación, y durante diferentes puntos de tiempo de regeneración. La inspección visual de la alineación y el árbol confirmará si los genes candidatos pertenecen a la familia de interés. Los genes que son demasiado diferentes en secuencia o un grupo fuera de todo lo demás, son probablemente parte de una familia de genes diferente.
Los resultados de este protocolo se pueden considerar generadores de hipótesis. Esta tubería puede destacar los genes candidatos para estudiar funcionalmente en estudios futuros. Después de explorar la expresión de la opsina de Hydra, ahora estamos utilizando técnicas similares para investigar genes relacionados entre especies con el fin de identificar similitudes y diferencias en la función.
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Descripción general
Este protocolo investiga la evolución molecular y la expresión de genes candidatos mediante el uso de datos de secuenciación de ARN, centrándose específicamente en los genes de opsina en Hydra vulgaris. El estudio muestra una canalización bioinformática que puede aplicarse a diversos organismos.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Análisis de expresión génica
- Evolución molecular
- Bioinformática
Antecedentes
- Investiga genes candidatos relevantes para la detección de luz y la evolución del ojo
- Utiliza al invertebrado de agua dulce Hydra vulgaris
- Emplea recursos del NCBI para la recuperación de datos de secuencias
Métodos Utilizados
- Secuenciación de ARN mediante una canalización bioinformática
- Hydra vulgaris como sistema biológico
- Herramientas como BLAST, MEGA y edgeR para el análisis
Resultados principales
- Identificaron genes de opsina que evolucionan mediante duplicaciones específicas de linaje en Cnidarios
- Encontraron expresión diferencial de 1.774 transcritos en diversas partes del cuerpo
- Generaron un árbol filogenético de máxima verosimilitud de secuencias de opsina
Conclusiones
- El protocolo destaca el potencial de los genes candidatos para futuros estudios funcionales
- Contribuye al avance del conocimiento sobre la evolución y expresión génica en relación con la biología sensorial
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta canalización bioinformática permite la investigación sistemática de la evolución y expresión de familias de genes, apoyando la validación de objetivos mediante la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Al integrar el análisis filogenético con la cuantificación mediante RNA-seq, proporciona una confianza predictiva para priorizar genes candidatos con funciones conservadas o divergentes entre especies. El enfoque ayuda en la selección de carteras al identificar hipótesis basadas en mecanismos antes de asignar recursos a estudios funcionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología y Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas al aclarar la ortología de genes y las relaciones evolutivas dentro de familias diana.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas mediante el perfilado comparativo de la expresión en diferentes tejidos y etapas del desarrollo.
- Valor predictivo: Apoya la identificación de candidatos principales al destacar genes con expansiones específicas de linaje y patrones de expresión enriquecidos en tejidos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara conjuntos de genes validados para análisis posteriores al confirmar la pertenencia a la familia mediante alineación de secuencias y topología filogenética.
- Valor operativo: Genera matrices de conteo estandarizadas a partir de datos de RNA-seq, permitiendo resultados cuantitativos reproducibles para la preparación de ensayos.
- Escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma en distintos organismos mediante la aplicación de protocolos consistentes de BLAST, alineación y análisis filogenéticos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta los datos de expresión de la fase de descubrimiento con modelos preclínicos mediante la identificación de patrones de expresión conservados en tejidos relevantes.
- Alienación de Biomarcadores: Aporta soporte al descubrimiento de biomarcadores traslacionales mediante el análisis de expresión diferencial entre condiciones, como el hipostomio frente a la columna corporal en Hydra.
- Avance Ajustado al Riesgo: Orienta las decisiones de continuar o interrumpir un proyecto al revelar la dinámica de expresión durante las etapas de regeneración y gemación, lo que indica relevancia funcional.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la continuación del descubrimiento desde la identificación del blanco hasta la optimización del compuesto inicial, permitiendo un avance basado en hipótesis desde el análisis de secuencias hasta la priorización funcional.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la generación de filogenias que revelan eventos de duplicación y presiones selectivas sobre familias génicas de interés.
- Selección: Proporciona sistemas biológicos listos para ensayos mediante matrices de expresión normalizadas que permiten la comparación cruzada de la actividad génica entre muestras.
- Analítica: Ofrece mediciones cuantitativas de variables dependientes mediante la expresión diferencial basada en edgeR, posibilitando la comparación estadística de condiciones.
- Investigación Traductiva: Se conecta con la continuidad preclínica al identificar genes con funciones conservadas en sistemas sensoriales a través de metazoos.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad bioinformática reutilizable para investigar cualquier familia génica, reduciendo el desarrollo redundante de tuberías en diversos proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la selección de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista mediante el contexto evolutivo y de expresión.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización mediante procedimientos bioinformáticos documentados y por etapas, aplicables entre diferentes equipos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en los objetivos antes de invertir en validación experimental.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al destacar genes con fuerte conservación evolutiva e inducción específica de tejido.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en bioinformática, incluidas herramientas de línea de comandos, bases de datos de secuencias y software filogenético.
- Depende del acceso a infraestructura computacional para manejar grandes conjuntos de datos de RNA-seq y ejecutar análisis BLAST, MEGA y edgeR.
- Necesita estandarización entre equipos en cuanto a nomenclatura de archivos, versiones del genoma de referencia y configuraciones de parámetros para el alineamiento y la construcción de árboles filogenéticos.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el flujo de trabajo a organismos no modelo con genomas o anotaciones incompletos.
- Está limitado por la calidad y completitud de los datos de entrada, incluida la profundidad del RNA-seq y la precisión de la anotación del genoma de referencia.
