Preparación e inyección de embriones de mosquitos Culex para generar mutaciones nulas utilizando CRISPR/Cas9
10 de septiembre de 2020
CRISPR/Cas9 se utiliza cada vez más para caracterizar la función génica en organismos no modelo. Este protocolo describe cómo generar líneas eliminatorias de Culex pipiens,desde la preparación de mezclas de inyección, hasta la obtención e inyección de embriones de mosquitos, así como la forma de criar, cruzar y detectar mosquitos inyectados y su progenie para detectar mutaciones deseadas.
Este protocolo es importante porque proporciona instrucciones detalladas sobre cómo preparar e inyectar embriones de mosquitos para la edición del genoma de CRISPR-Cas9. Las principales ventajas de esta técnica de microinyección son que tiene una alta tasa de supervivencia de los mosquitos y permite a los investigadores determinar la función de un gen. Este protocolo ha sido diseñado específicamente para inyectar mosquitos que pertenecen al género Culex.
Estos mosquitos transmiten varios patógenos, incluidos los virus que causan la fiebre del Nilo Occidental y la encefalitis de San Luis, así como los nematodos filariales, que causan el gusano del corazón canino y la elefantiasis. Por lo tanto, contar con herramientas como la edición del genoma CRISPR-Cas9, nos permitirá comprender y controlar mejor estos importantes factores de la enfermedad. Inyectar embriones de insectos recién puestos y obtener una mayor tasa de supervivencia requiere mucho tiempo, práctica y paciencia.
Por lo tanto, recomendamos inyectar varios embriones con una solución salina coloreada antes de inyectar materiales costosos para generar una mutación. Comience rellenando las agujas de inyección con la mezcla de inyección. Elija un relleno de aguja o una punta de carga de gel que quepa fácilmente en la parte posterior de la aguja de inyección seleccionada.
Asegúrese de que haya un poco de espacio entre el extremo del relleno de la aguja y la aguja de inyección. Aspire con cuidado, una sola gota pequeña de la mezcla inyectable en la aguja de inyección cerca del lugar donde comienza a disminuir. A continuación, conecte la aguja de inyección al microinyector.
Coloque el portaobjetos que contiene los embriones en la platina del microscopio. Para abrir la aguja, utilice una presión de inyección inicial de aproximadamente 30 psi y ajústela según sea necesario para administrar un volumen adecuado de mezcla de inyección. Bajo un microscopio de disección, coloque la aguja sobre el embrión del mosquito y use cuidadosamente el micromanipulador para bajar la aguja sobre el embrión.
Una vez que la aguja apenas toque el embrión, mueva rápidamente el embrión perpendicular al eje largo de la aguja. Para determinar si la aguja se abrió con éxito, presione el gatillo de inyección y vea si salen burbujas o mezcla de inyección de la aguja. De lo contrario, repita moviendo el embrión de mosquito contra la aguja hasta que esté abierto y la mezcla de inyección se escape cuando se presione el gatillo.
Coloque el primer embrión de mosquito en el centro de visión, asegúrese de que esté enfocado y coloque la aguja sobre el primer huevo. Aumente progresivamente el aumento en el microscopio, bajando con cuidado la aguja para mantenerla justo por encima del primer embrión. Proceda hasta que el microscopio haya alcanzado su máximo aumento, y tanto el embrión como la aguja estén enfocados.
Mueva el embrión ligeramente hacia la izquierda y baje la aguja para que quede en el mismo plano de visión que el embrión. Utilice la etapa del microscopio para tocar suavemente el embrión con la punta de la aguja. El extremo posterior estrecho del embrión del mosquito debe desviarse ligeramente.
Usando la etapa del microscopio, mueva el extremo posterior del embrión sobre la aguja y observe cómo la aguja penetra en el corion del huevo de mosquito. La aguja debe penetrar en la membrana y en la ubicación aproximada de las células polares dentro del embrión. Colocar la mezcla de inyección en esta región aumenta la probabilidad de que se produzcan mutaciones y se hereden en la línea germinal.
Apriete el gatillo de inyección de una a tres veces para disparar la mezcla de inyección en el embrión. Administre una pequeña cantidad de mezcla inyectable, lo suficiente como para que se pueda detectar un pequeño aclaramiento en el plasma del embrión. Use la etapa para mover el embrión hacia la derecha, lejos y fuera de la punta de la aguja.
Si la inyección salió bien, debería gotear poco o nada de líquido del embrión. Mueva la etapa hacia abajo para que el siguiente embrión se coloque frente a la aguja. Y repita la inyección.
Si la mezcla inyectable no parece salir, o si una gran cantidad de líquido se escapa del embrión después de retirar la aguja, reemplace la aguja de inyección y comience de nuevo. Destruye los óvulos no inyectados o dañados. Después de que se hayan inyectado todos los embriones en el portaobjetos, lave el aceite de halocarbono aplicando agua de ósmosis inversa con una botella rociadora.
Dirija el chorro de agua hacia la parte superior del cubreobjetos por encima de los embriones inyectados y permita que el agua fluya por el cubreobjetos, asegurándose de no dirigir el chorro hacia los embriones. Cubre el portaobjetos con 150 microlitros de agua y colócalo sobre papel de filtro húmedo dentro de una placa de Petri cuadrada. Incube la placa de Petri en una cámara ambiental, ajustada a 25 a 27 grados Celsius y 70 a 80% de humedad relativa con un fotoperíodo de día largo.
Este protocolo se utilizó para inyectar con éxito embriones del mosquito doméstico del norte, Culex pipiens, asegurando que el extremo anterior del embrión del mosquito se extienda más allá de la tira de apósito médico, lo que aumenta en gran medida la supervivencia de las larvas y da como resultado una descendencia de alta calidad que es capaz de desarrollarse hasta la edad adulta y reproducirse. La secuenciación reveló que aproximadamente el 10% de los mosquitos examinados mostraron una pequeña inserción o deleción cerca del sitio de corte Cas9 del primer ARN guía, lo que sugiere que las células polares fueron atacadas con éxito durante las microinyecciones. Los individuos F1 se aparearon con éxito y produjeron descendencia viable, algunos de los cuales también contenían la mutación.
Al microinyectar embriones de insectos, la mayoría de las personas tienen dificultades para abrir inicialmente la aguja y mover el embrión sobre la aguja. Recuerde que desarrollar estas habilidades requiere tiempo y práctica. Este protocolo puede ser modificado o adaptado para inyectar los embriones de otros mosquitos o incluso de otras especies de insectos.
Más allá de usar este protocolo para eliminar genes con la edición del genoma CRISPR-Cas9 dirigida, las mismas técnicas se pueden usar para inyectar plásmidos o transposones en genes knock-in o generar mutaciones aleatorias. Mi laboratorio está utilizando actualmente esta técnica para comprender mejor cómo los mosquitos miden diariamente y regulan sus respuestas estacionales. Sin embargo, los investigadores estadounidenses están utilizando la edición del genoma CRISPR-Cas9 para comprender mejor la biología de varios organismos.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para utilizar la edición del genoma CRISPR/Cas9 con el fin de crear líneas knock-out de Culex pipiens, una especie de mosquito que transmite varios patógenos. Detalla la preparación y la inyección de embriones de mosquito, asegurando altas tasas de supervivencia y facilitando el análisis de la función génica.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Edición del genoma con CRISPR/Cas9
- Control de vectores y prevención de enfermedades
- Embriología de insectos
Antecedentes
- Culex pipiens es un vector importante para varias enfermedades.
- La identificación de la función génica es crucial para comprender la transmisión de patógenos.
- Las técnicas de microinyección mejoran la eficiencia de las modificaciones genéticas.
Métodos Utilizados
- Microinyección de embriones de mosquito
- Culex pipiens como modelo biológico
- Sistema CRISPR/Cas9 para edición genómica dirigida
Resultados Principales
- La inyección exitosa dio como resultado que aproximadamente el 10 % de los mosquitos analizados presentaran mutaciones dirigidas.
- Se lograron altas tasas de supervivencia larval, produciendo descendencia viable.
- Las mutaciones se heredaron a través de la línea germinal en individuos F1.
Conclusiones
- Este estudio demuestra la factibilidad de utilizar CRISPR/Cas9 para estudios de función génica en Culex pipiens.
- El protocolo tiene implicaciones significativas para las estrategias de control de vectores en la gestión de enfermedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La edición génica mediada por CRISPR/Cas9 en mosquitos vectores de enfermedades permite la validación de objetivos y la genómica funcional para estudios sobre la transmisión de patógenos. Este protocolo facilita la reducción de riesgos mecanicistas al establecer la transmisión germinativa de mutaciones en Culex pipiens, un vector clave para el virus del Nilo Occidental y nematodos filariales. El enfoque proporciona una plataforma escalable para cribado fenotípico e identificación de candidatos prometedores en la investigación del control de vectores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la función génica en vectores de mosquitos para validar dianas implicadas en la transmisión de patógenos.
- Valor operativo: Alcanza aproximadamente una tasa de mutación del 10 % en embriones analizados, lo que apoya flujos de trabajo eficientes para la validación de dianas.
- Valor predictivo: La transmisión germinativa de mutaciones en descendientes F1 confirma la actividad específica en la diana y su heredabilidad para la evaluación fenotípica.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: La microinyección de complejos Cas9/gRNA en embriones genera mutaciones dirigidas a un sitio específico para la selección funcional.
- Valor operativo: Las altas tasas de supervivencia embrionaria tras la inyección permiten la realización de ensayos a gran escala con cohortes inyectadas.
- Preparación para el ensayo: El protocolo incluye la preparación de las agujas, la alineación de los embriones y los parámetros de inyección para garantizar la reproducibilidad entre los ensayos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Las líneas mutantes generadas permiten estudiar el papel de los genes en la competencia vectorial frente a patógenos como el virus del Nilo Occidental y nematodos filariales.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Las mutaciones heredadas en la línea germinal permiten el análisis fenotípico longitudinal a través de generaciones.
- Sistema Relevante para Enfermedades: El modelo Culex pipiens permite evaluar dianas genéticas relevantes para estrategias de control de vectores.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad de descubrimiento a preclínico al permitir la validación de dianas, la selección fenotípica y el seguimiento mecanicista en vectores insectos de enfermedades.
- Biología de Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la eliminación de genes para aclarar sus funciones en las vías de transmisión de patógenos.
- Selección: Genera lecturas cuantitativas de mutaciones (por ejemplo, frecuencia de indel) para comparar la eficacia de gRNA y la eficiencia de edición.
- Análisis: El secuenciamiento de individuos F0 y F1 proporciona resultados medibles para evaluar la precisión de la edición y la transmisión germinativa.
- Investigación Traducida: Las líneas mutantes facilitan la evaluación preclínica de la función génica en la competencia vectorial y la interacción con patógenos.
- Reutilización Empresarial: El protocolo estandarizado de microinyección puede adaptarse a distintas especies de mosquitos y modelos de insectos para su reutilización en plataformas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante mutaciones transmisibles por vía germinativa y cribado fenotípico.
- Valor operativo: Altas tasas de supervivencia y parámetros de inyección reproducibles mejoran el rendimiento y reducen el desperdicio de recursos.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones de avance o interrupción en la priorización de objetivos al vincular la función génica con la competencia vectorial.
- Impacto en la cartera: Avance ajustado al riesgo de candidatos para el control de vectores basado en conocimientos mecanicistas validados.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en embriología de mosquitos, técnicas de microinyección y preparación de reactivos CRISPR/Cas9.
- Depende del equipo de microinyección, del montaje microscópico y de los controles ambientales para la incubación de embriones.
- Necesita estandarización entre los equipos en el manejo de embriones, la presión de inyección y la preparación de las micropipetas para garantizar la consistencia.
- La adaptación a otras especies de mosquitos puede requerir la optimización del momento de recolección de embriones y de los parámetros de inyección.
- Las limitaciones prácticas incluyen la dependencia de habilidades técnicas para la apertura de las micropipetas y el alineamiento de los embriones, lo cual afecta las tasas de éxito de la inyección.
