Cristalización de proteínas en chip por microdiálisis para estudios de difracción de rayos X in situ

Este trabajo describe el protocolo de fabricación de chips microfluídicos desarrollado para la cristalización de proteínas en chip con el método de diálisis y experimentos de difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente. Una de las principales ventajas de estos microchips es la elección de materiales de fabricación, haciendo que los chips sean compatibles para la recopilación in situ de datos de difracción de rayos X a temperatura ambiente. Los experimentos de cristalización en chip requieren pequeños volúmenes de la muestra de proteínas, reduciendo el costo total de trabajar con estas macromoléculas de alto valor.

La cristalización en chip también elimina la recolección manual de los frágiles cristales proteicos, aplicados con frecuencia en combinación con el enfriamiento criollo durante los experimentos convencionales de cristalografía. Además, nuestros microchips utilizan microdiálisis para la cristalización de proteínas, que es un método basado en la difusión con el objetivo de equilibrar la concentración precipitante a través de una membrana semipermeable, con el fin de acercarse a la concentración cromulent para la cristalización de proteínas, y permite un control preciso y reversible sobre las condiciones de cristalización. La microdiálisis combinada con el control de temperatura se puede utilizar para desvincular la nucleación del crecimiento del cristal para investigar diagramas de fase, cambiando la concentración precipitante mientras se utiliza la misma muestra de proteínas.

Primero prepare 50 gramos de base de silicona PDMS y su agente de curado en una relación de masa de 10 a uno. Mezcle los dos ingredientes en un vaso de precipitados con una espátula. Después de mezclar, coloque la mezcla en una cámara de vacío para eliminar todas las burbujas de aire.

Poner 25 gramos del PDMS premezclado en el primer SU8 para dominar que contiene los patrones del canal microfluídico y los pilares, hasta una altura de aproximadamente cinco milímetros. A continuación, vierta los 25 gramos restantes del PDMS en el segundo maestro SU8, que contiene sólo los patrones de los pilares. Cura las dos capas PDMS en un horno a 338 kelvin durante una hora.

Corta las capas PDMS curadas alrededor de los patrones de los maestros SU8 con un bisturí, y despega suavemente los moldes PDMS de los maestros de silicona. Coloque el molde PDMS, con los canales y los pilares en una diapositiva rígida de vidrio microscopio con los patrones orientados hacia arriba. Cortar un pequeño trozo de membrana de diálisis de celulosa regenerada con el fin de cubrir el pilar central del molde PDMS, que está diseñado para ser la cámara de proteínas.

El corte de peso molecular de la membrana de diálisis se elige en consecuencia para el peso molecular de la muestra de proteínas, y los precipitantes de la solución de cristalización. A continuación, separe cuidadosamente la pieza seca de la membrana de diálisis de celulosa regenerada. Corta un pequeño trozo de la membrana de diálisis separada.

El tamaño de esta pieza de membrana depende del diseño del chip. Y específicamente, depende de las dimensiones del pilar central. Deposite la pieza de la membrana de diálisis en el pilar central del molde PDMS, que se apoya en el tobogán de vidrio, con su pilar y canales orientados hacia arriba.

A continuación, coloque el segundo molde PDMS con sólo los pilares orientados hacia abajo, en la parte superior del molde PDMS que ya está soportado en la diapositiva de vidrio. Alinee todos los pilares de los dos moldes PDMS. La pieza de la membrana de diálisis de celulosa regenerada está intercalada entre los dos pilares centrales de los moldes PDMS.

Este paso del procedimiento de fabricación se puede llevar a cabo bajo un microscopio óptico o simplemente inspeccionando visualmente cuidadosamente la alineación de todos los pilares. Coloque el conjunto en una cámara de vacío y desece durante 30 minutos con el fin de eliminar las burbujas de aire atrapadas dentro de los moldes PDMS, y para mejorar la inserción de la resina NOA fotocurable, que se describirá en el siguiente paso de este protocolo. Retire el conjunto de la cámara de vacío y llene el espacio vacío entre los dos moldes PDMS con la resina fotocurable a base de tiolina, NOA 81, por imbibición capilar.

Aplique la resina en tres de los cuatro lados del ensamblaje. Coloque el conjunto en un enlazador cruzado y cure la resina NOA exponiendo a la luz UV durante ocho segundos, usando una lámpara UV colimada de 35 milivatios por centímetro cuadrado. Corta una pieza de PMMA de 175 micrómetros de espesor en las dimensiones estándar de un tobogán de vidrio microscopio y despega la protección plástica de cada lado de la pieza PMMA.

Una vez completada la primera exposición a los rayos UV, retire el molde SUPERIOR PDMS con una resina NOA parcialmente cruzada pegada en él del molde PDMS inferior y del tobogán de vidrio. Presione suavemente el conjunto del molde SUPERIOR PDMS y la resina NOA parcialmente curada en la pieza PMMA. Coloque el nuevo conjunto en el enlazador cruzado y cure de nuevo la resina NOA mediante la exposición a la luz UV durante 60 segundos.

Retire cuidadosamente el molde SUPERIOR PDMS. El chip de diálisis hecho de la resina NOA totalmente transversal que incrusta una membrana de diálisis de celulosa regenerada y está apoyado en una pieza DEM está listo. Enlace conectores disponibles comercialmente en los puntos de entrada y salida del canal microfluídico con pegamento epoxi rápido.

Para la manipulación de fluidos, elija el diámetro de los tubos PTFE en función del tamaño de los conectores. Los tubos se utilizan para la introducción de la solución de cristalización dentro del canal fluido del chip de diálisis. Pipeta manualmente una gota de la muestra de proteína dentro del depósito de proteínas situado justo en la membrana de diálisis.

El volumen de la gota de proteína depende del diseño del microchip que se está utilizando. Y en concreto, depende del volumen del pilar central, y puede ser de 0,1 o 0,3 microlitros. Aplique cuidadosamente una fina capa de grasa de silicona de alto vacío alrededor del depósito de proteínas.

Corta un pequeño trozo de PMMA y colóquelo suavemente por encima de la fina capa de la grasa de silicona. Corta un trozo de cinta Kapton, lo suficientemente grande como para cubrir la pieza de PMMA colocada sobre el depósito de proteínas y pegarse en el chip NOA alrededor de todos los bordes. La muestra de proteínas está encapsulada dentro del depósito y el chip se puede utilizar para experimentos de cristalización.

Primero prepare aproximadamente 500 microlitros de la solución de cristalización mezclando volúmenes apropiados del búfer y las soluciones precipitantes. Inyecte la solución de cristalización en el punto del chip de diálisis a través de los conectores fluidos, ya sea manualmente con la jeringa o con un sistema automatizado impulsado por presión. Una vez que el canal fluido esté lleno de la solución de cristalización y no haya aire atrapado en su interior, selle los puertos de entrada y salida del chip con cinta Parafilm.

Pipetear el volumen adecuado de la solución proteica dentro del depósito de proteínas y encapsular la muestra de proteínas como ya se ha descrito. El crecimiento del cristal proteico se puede visualizar y grabar con una cámara digital. Para la fabricación de los microchips de diálisis, hemos elegido materiales ópticamente transparentes y biológicamente inertes, demostrando una alta compatibilidad para experimentos de difracción de rayos X in situ.

Se ha evaluado el ruido de fondo generado por los materiales que comprenden el compartimento proteico del chip, que se encuentra en el camino directo del haz de rayos X. El compartimento proteico consiste en la membrana de diálisis de celulosa regenerada, la cinta Kapton y dos capas de PMMA, una utilizada como sustrato de los microchips, y otra utilizada para la encapsulación de la muestra proteica. En esta imagen, se ilustra el ruido de fondo generado por la cinta Kapton, la membrana de diálisis de celulosa regenerada, la capa PMMA y su ensamblaje.

A pesar de que la resina fotocurable NOA comprende el cuerpo principal de los microchips, no está incluida en estas mediciones ya que no forma parte de la cámara proteica. Los anillos difusos atribuidos a las interacciones de los rayos X con los materiales se pueden ver para la cinta Kapton a la resolución inferior a cuatro angstroms, el PMMA entre cuatro y ocho angstroms, y la membrana de diálisis entre cuatro y cinco angstroms. El ruido de fondo total generado por el chip se observa principalmente a la resolución inferior a seis angstrom, lo que indica que el tratamiento de los datos de difracción de alta resolución de lysozyme no se ve afectado.

Los microchips se montaron frente al haz de rayos X con un soporte impreso en 3D que diseñamos para experimentos de difracción de rayos X in situ, y puede contener hasta tres chips simultáneamente. Se llevaron a cabo experimentos con el fin de evaluar la eficiencia de los microchips para la cristalización en chip de proteínas solubles en modelos con el método de microdiálisis. Los cristales de lysozyme se cultivaron a 293 kelvin en dos condiciones diferentes.

La primera condición de cristalización contenía 1,5 cloruro de sodio molar y 0,1 acetato de sodio molar. La segunda condición de cristalización contenía un cloruro de sodio molar, acetato de sodio molar de 0,1 y 30% polietileno glicol 400, y fue elegido para mostrar la compatibilidad de los microchips y el método de microdiálisis, con precipitantes de alto peso molecular y soluciones viscosas. Los experimentos de cristalización se llevaron a cabo en condiciones estáticas.

Una vez que los cristales de lysozyme fueron cultivados en el microchip, se utilizaron para experimentos de difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente. Los microchips se montaron en la línea de haz con la ayuda del soporte impreso en 3D y se recogieron conjuntos completos de datos de difracción de rayos X a partir de dos cristales de lisozyme. Después del tratamiento de los datos de difracción de rayos X, el mapa de densidad de electrones de un solo cristal de lysozyme se obtuvo a resolución de 1,95 angstrom, como se muestra en la figura A.Figure B muestra el mapa de densidad de electrones obtenido con resolución de 1,85 angstroms.

Después de fusionar dos conjuntos de datos obtenidos de dos cristales de liozima diferentes, ambos mapas de densidad electro muestran información estructural detallada que se puede obtener mediante experimentos de difracción de rayos X in situ realizados directamente en los microchips de diálisis a temperatura ambiente, a partir de cristales de proteínas simples o múltiples. Demostramos el procedimiento de fabricación de dispositivos microfluídicos diseñados para la cristalización de proteínas en chip con el método de microdiálisis, y experimentos de difracción de rayos X in situ a temperatura ambiente. Utilizamos materiales de fabricación con alta transparencia de rayos X, compatibles con cristalografía de proteína in situ.

La recopilación de datos de difracción se automatiza con el uso de un soporte impreso en 3D para los chips, que se puede montar directamente en líneas de haz de cristalografía macromolecular. La versatilidad de este microchip se debe al uso de microdiálisis para controlar de forma reversible las condiciones de cristalización y mapear diagramas de fase utilizando un pequeño volumen proteico. El prototipo del dispositivo es sencillo, lo que permite la fabricación de hasta 30 microchips en un solo día en una habitación limpia, con materiales relativamente baratos.

Esperamos que estas características de los chips se pueden utilizar para estudios de cristalografía de rayos X en serie de objetivos proteicos más desafiantes.