Cepa controlada de hidrogeles 3D bajo imágenes de microscopía en vivo

Los tejidos biológicos crecen en ambientes blandos tridimensionales a través de los cuales las células están expuestas a diversas señales mecánicas. Nuestro método permite el estiramiento de hidrogeles de forma tridimensional para la investigación de respuestas biomecánicas. Esta técnica permite el estiramiento uniforme de los hidrogeles a lo largo de su espesor mientras se realizan imágenes en vivo.

Además, la geometría del hidrogel se puede manipular a cualquier tamaño o forma. El conocimiento sobre cómo las células y la matriz extracelular responden a las fuerzas es importante para revelar cómo se desarrollan los tejidos y progresan las enfermedades. Esto puede conducir al desarrollo potencial de terapias contra el cáncer y modelos de ingeniería de tejidos.

Comience usando un cortador láser o manual para crear una tira de goma con un agujero en el centro. Corta un rectángulo de película hidrofóbica para que sea más ancho que las tiras de silicona y lava un plato de plástico con etanol al 70%. Después de secar con toallitas sin pelusa, coloque la película de sellado en el plato y coloque una tira de silicona con la envoltura de plástico quitada de un lado en el centro de cada pieza de película de sellado.

Para la formación de gel de fibrina, administre uniformemente 2,5 microlitros de fibrinógeno marcado en frío en el recorte de silicona de cada tira de modo que toda la circunferencia de cada recorte esté en contacto con el fibrinógeno, teniendo cuidado de no permitir que se formen bolsas de aire o burbujas en ninguna parte de las soluciones. Agregue inmediatamente 2,5 microlitros de trombina enfriada directamente a cada solución de fibrinógeno y mezcle rápidamente las soluciones con un pipeteo cuidadoso, moviendo la punta alrededor de toda la mezcla para crear una solución lo más homogénea posible. Después de mezclar, coloque el plato tapado en la incubadora durante 30 minutos para la polimerización en gel.

Al final de la incubación, agregue suficiente PBS a la placa para sumergir las construcciones de silicona en gel y levante con cuidado cada muestra de la placa, asegurándose de que la capa de película de sellado permanezca adherida a la tira. Despegando lentamente de un extremo de la silicona al otro, separe con cuidado la película de sellado de cada pieza de silicona, luego vuelva a colocar la tira en el plato y coloque el plato en la platina de un microscopio óptico para evaluar el estado de la muestra. Para cargar la muestra en el dispositivo de estiramiento, llene el baño con PBS y coloque la tira de silicona que contiene el gel de muestra en la parte superior del baño de modo que los extremos de la tira queden a cada lado del baño.

Coloque las abrazaderas y las tiras de tela, y luego apriételas para que todas las piezas estén conectadas para formar una tira recta con el recorte en el centro. Coloque el material en el pozo y asegure un cubreobjetos en el fondo del pozo, luego coloque un pozo de líquido de aluminio en el dispositivo de estiramiento. Llene el pocillo con uno o dos mililitros de medio celular PBS y coloque la tira de gel de tela en el dispositivo.

Sujete la tira de tela en el soporte de modo que el corte del gel quede en el centro antes de colocar y bloquear con cuidado el inserto de alfiler en su lugar en el dispositivo. Coloque y bloquee el otro lado de la tela en el husillo y coloque el dispositivo de estiramiento y la muestra adjunta en la platina de un microscopio confocal. Utilice un cable USB para conectar el microcontrolador a la computadora y conecte el servomotor al microcontrolador.

A continuación, abra el módulo de control del dispositivo de estiramiento en el ordenador para obtener una imagen de la muestra. Para determinar si la muestra es adecuada para un experimento, utilice imágenes en vivo de baja resolución para escanear todo el gel y determinar la posición Z más baja en la que la adhesión total a las paredes internas del recorte es aparente sin desgarros ni burbujas. Después de anotar la ubicación Z del microscopio, escanee la interfaz de la etiqueta fluorescente del gel y la tira de silicona para determinar la adhesión total del gel a la silicona en toda su circunferencia.

Después de escanear, mueva la platina en la dirección Z hasta que ya no haya continuidad en el gel y observe el límite superior de la posición Z. A continuación, reste el límite superior de la dirección Z del límite inferior para calcular el espesor de la muestra. Para determinar la posición de pre-estiramiento de la muestra, haga clic en Ir a Zero Servo POS en el software del módulo para asegurarse de que el servomotor esté en su posición cero y conecte el servomotor al dispositivo de estiramiento, teniendo cuidado de no ejercer ninguna presión sobre la muestra.

Mientras toma imágenes, haga clic en el botón más uno para mover el motor un grado a la vez en el sentido de las agujas del reloj. Cuando el lado derecho del recorte se mueva, haga clic en el botón menos uno para invertir la muestra a la penúltima posición y mantener la muestra bajo una tensión mínima. Haga clic en Establecer posición mínima del servo para establecer la posición de referencia y capturar una imagen de mosaico de un solo corte en Z de 40 aumentos, alta resolución y corte Z de toda el área de gel como referencia de referencia para el análisis de posprocesamiento.

Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, avance el servomotor un grado por segundo hasta alcanzar la magnitud de estiramiento deseada. En cada magnitud de estiramiento para la que se desee un análisis, verifique que el gel no se haya desprendido de la silicona en ningún punto de su circunferencia escaneando la interfaz entre el gel y la silicona, luego capture un conjunto de imágenes de pila Z de mosaico de alta resolución de toda el área de gel para el análisis posterior al procesamiento. El acercamiento y el seguimiento manual de los agregados de cordón durante el estiramiento del gel permiten calcular las deformaciones locales del gel en las direcciones axial y perpendicular.

Por lo general, las hebras axiales se propagan de manera relativamente lineal desde el borde del corte de silicona hasta el centro del gel y son más grandes que las deformaciones perpendiculares compresivas. Aquí, se muestran imágenes de gran aumento de un hidrogel típico sin estirar y relativamente isotrópico, y un hidrógeno bajo una alta deformación de corte del 80% que representa fibras altamente alineadas en la dirección de estiramiento. El análisis de la reorientación de la fibra reveló una dependencia aproximadamente lineal entre la alineación de la fibra y la deformación externa en el corte hasta deformaciones del 40% con una saturación moderada a deformaciones superiores al 40%Como se ilustra en este análisis de alineación de fibras, a medida que aumenta la deformación externa en el corte, la alineación de la fibra aumenta, siguiendo una curva no lineal general.

Tenga en cuenta que la respuesta del gel al estiramiento es relativamente uniforme a lo largo de su grosor Z. Como se ilustra en esta simulación preliminar de elementos finitos realizada en material continuo 2D, el mate de color oscila entre el 38 y el 42%, lo que indica que las cepas de gel son relativamente homogéneas en toda el área de gel circular. Es importante asegurarse de que el hidrogel se adhiera completamente a las paredes internas del corte geométrico, ya que la adhesión y la continuidad son cruciales para un estiramiento fiable de las muestras.

Al modificar la geometría del recorte de silicona, podemos programar gradientes en la deformación y la alineación de fibras, por lo que al incrustar celdas podemos analizar la respuesta a estos gradientes.